Address for correspondence : Myung-Whun Sung, MD, PhD, Department of Otorhinolaryngology, Seoul National University College of Medicine, 101 Daehak-ro, Jongno-gu, Seoul 110-799, Korea
Tel : +82-2-2072-2448, Fax : +82-2-745-2387, E-mail : mwsung@snu.ac.kr

서     론 

   Arachidonic acid(AA)로부터 생성되어 생물학적 활성을 가지는 일부 대사산물들이 염증 반응뿐만 아니라 암세포의 성장에서도 주요한 역할을 가진다는 사실이 최근 입증되고 있다.^1,2) 이러한 AA 유래 인자들을 특이적으로 인지하여 억제하는 약제들이 앞으로 유용한 항암제의 한 부분이 될 가능성이 부각되며 이러한 분야에서 많은 연구가 진행되고 있다. 세포막의 인지질로부터 특정한 자극에 반응하여 유리된 AA는 주요 3가지 대사 과정(Cyclooxygenase, Lipoxygenase, Cytochrome P450 epoxygenase)으로 유입된다.³⁾
   Cyclooxygenase-2(COX-2)에 의해 AA로부터 생성된 Prostaglandins(PGs)는 항암 면역 및 세포자살 억제, 암세포 성장, 전이, 신생혈관 생성 과정 등의 촉진을 통해 암화 과정에 기여할 수 있음이 오랜 기간의 연구를 통해 알려졌다.⁴⁾ 지난 수년간의 연구 속에서 다양한 암종에서의 COX-2과발현이 확인되었고, 이의 선별적인 억제가 암치료뿐 아니라 예방에 유용할 것이란 기대를 가지게 하였다. 두경부암종의 경우에 COX-2의 과발현과 그 암 촉진 효과가 다양한 기전으로 확인되었으며, 그 억제에 의한 항암효과가 실험적으로 입증되고 있다.^5,6) 
   COX-2뿐 아니라, 5-lipoxygenase(5-LO)의 대사 산물(5-HETE, LTB4, CysLTs) 또한 일부 암종의 신생혈관생성 유도에 관여됨이 최근에 보고되었다.⁷⁾ COX-2와 5-LO로부터 유도된 생리활성인자들은 세포에 존재하는 각각의 특정 수용체와 결합한 후 일련의 신호 전달 과정을 활성화시킴으로써 세포의 활성을 증가시킬 수 있는데, 흥미로운 점은 COX-2와 5-LO가 각각 다른 세포 내 신호 전달 과정을 통한 반응을 유도하지만, 일부 암세포에서 결과론적인 효과는 유사한 기전(직접적인 성장 촉진뿐 아니라 혈관생성인자 증가등을 통한 간접적인 촉진)을 통해 암세포의 발달에 관여한다는 부분이다.^4,7) 이러한 사실들로부터, 저자들은 COX-2 과발현뿐 아니라 5-LO의 과발현 또한 암세포의 발달에 중요한 역할을 할 수 있으며, 특히 COX-2 과발현이 확인되는 두경부암종에서의 5-LO의 동시 발현 가능성에 주목하여, 이를 기초로 한 병합 억제 처리가 두경부암세포의 살상 및 치료에 더 효과적일 수 있는지를 실험적으로 확인하고자 하였다.

재료 및 방법

세포주와 세포배양
   서울대학교 세포주은행에서 제공받은 SNU-1041, 1066, 1076 두경부암세포주와 University of Pittsburgh Cancer Institute로부터 제공받은 PCI-1, 13, 50 두경부암세포주를 대상으로 실험을 진행하였다. 세포주들은 37℃, 5% CO₂ 상태에서, 일정하게 계대배양하며 유지하였다.

Western blot 분석
   배양용기의 세포는 trypsin 처리 후 원심분리(1,500 rpm, 5분)하여 모은 후에, 단백질 추출 용액(Cell signaling, Danvers, MA, USA)에서 분해되어 단백질 추출하였다. 세포 추출물은 4~12% NuPAGE gels(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에서 전기영동하여 분리한 다음, nitrocellulose membranes (Schleicher & Schuell, Dachen, Germany)에 전달하였다. Membranes은 polyclonal anti-human COX-2(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) 또는 polyclonal anti-human 5-LO(BD, Franklin Lakes, NJ, USA) 항체로 4℃에서 16~20시간 동안 반응시켰다. Membranes은 다시 TBS-T 용액으로 4번 세척한 후, 마지막으로 horseradish peroxidase-conjugated 2차 항체(Pierce, Rockford, IL, USA)로 1시간 동안 반응시킨 후, 다시 TBS-T 용액으로 4번 세척하였다. 면역학적으로 활성화된 단백질은 Lumi-light western blotting substrate(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)로 발색반응을 유도한 후, LAS-3,000(Fuji Film Co., Tokyo, Japan) 장치에서 결과를 확인하였다.

siRNA 이용한 COX-2와 5-LO 억제
   COX-2(D-004557-04, 5' GAAAUUUGACCCAGAACUAUU3')와 5-LO(D-004530-02, 5' CCAAGUUCCUGCUGCGUUUUU)의 발현을 각각 억제하는 small interfering RNA(siRNA)와 non-targeting control(D-001210-01, 5' UAGCGACUAAACACAUCAAUU3') siRNA를 Dharmacon RNA Technologies(Lafayette, CO, USA)로부터 구입하였다. siRNAs 적용을 위한 최적 조건(사용농도 및 처리 시간) 및 그 작용의 효과는 사전에 진행한 western blotting과 EIA 분석을 통해 확인하였다. 실험용 세포주들은 6-, 12- or 24-well 배양용기에 50~70%를 채우는 정도까지 분주하였다. 24시간 후에, siRNA(100-200 nM)를 Lipofectamine-2000 reagent(Invitrogen)을 사용하여 48시간 동안 세포주들에 처리하였다. 

PGE₂, LTB₄, VEGF 생성 분석
   COX-2 활성 측정을 위해 두경부종양세포에서 생성되는 PGE₂를, 5-LO 측정에 대해서는 대표적인 생성인자인 LTB₄의 생성 변화를 이용하였다. PGE₂와 LTB₄ enzyme immunoassay(EIA) kit는 Cayman Chemical(Ann Arbor, MI, USA)에서 구입하였고, VEGF EIA kit는 R&D Systems(Minneapolis, MN, USA)에서 구입하여 제조사의 사용 지시법에 따라 측정을 진행하였다.

세포 성장능 분석
   실험 대상 세포주를 96well 배양용기에 준비한 후 37℃ 세포배양기에서 24시간 동안 안정화 과정을 미리 진행하였다. 이후에 미리 지정한 시간 동안 해당 siRNAs를 처리한 후, Cell Counting Kit-8(Dojindo Lab., ToKyo, Japan)을 이용하여 세포 성장능 변화를 모니터링하였다.

COX-2와 5-LO 유전자를 발현하는 plasmids의 세포 내 이입
   COX-2 cDNA는 William L. Smith 박사(Department of Biological Chemistry, University of Michigan)로부터 제공받았으며, 5-LO cDNA는 Thomas G Brock 박사 (Department of Internal Medicine, University of Michigan Health System)로부터 제공받았다. 제공받은 각 cDNA를 이용하여, 2가지의 pcDNA3.1 발현 벡터(pcDNA3.1-COX-2 and pcDNA3.1-5-LO)를 제작하였다. 제작된 발현용 벡터는 단백면역분석 및 효소면역반응을 통해 그 발현 및 활성 정도를 사전 평가한 후에, 본 실험에 적용하였다. 실험 대상세포주에 0.5~1.5 μg의 발현 벡터를 Lipofectamine-plus 시약을 이용하여 이입하였다. 이입 후 4시간 후에, 정상 배양 배지로 교체로, 24~72시간 동안 배양한 후, 세포배양액은 효소면역분석법에, 세포 추출물은 단백면역분석법에 각각 적용되었다.

통계학적 분석
   통계학적 분석은 unpaired student t-test로 검증했고, p<0.05를 기준으로 통계적 유의성을 평가하였다. 결과치는 평균±SD(standard deviation)로 계산하였다.

결     과

두경부암세포주에서의 COX-2와 5-LO의 발현
   단백면역분석법을 통해, SNU-1041, 1066, 1076과 PCI-50에서의 COX-2와 5-LO의 두드러진 과발현이 확인되었다(Fig. 1). 이러한 결과를 바탕으로 차후 실험은 SNU-1041, 1076과 PCI-50을 대상으로 진행하였다.

두경부암세포주에서의 PGE₂와 LTB₄ 생성 분석
   SNU-1041, 1076과 PCI-50에 처리한 COX-2와 5-LO siRNA가 COX-2와 5-LO의 발현을 효과적으로 억제함을 확인하였고, 다음으로 진행한 PGE₂와 LTB₄ 생성 분석 실험에서는 각 세포주에서 생성되는 PGE₂와 LTB₄가 각각의 억제 수단에 의해 완벽히 차단되는 결과를 확인하였는데, 이러한 결과는 해당 세포주에서의 COX-2와 5-LO의 과발현을 재확인시켜주는 결과 및 이들의 저해 수단의 효과적인 작용을 확인한 것으로 판단한다(Fig. 2). 

두경부암세포주 성장에 대한 COX-2와 5-LO 단독 억제와 병합 억제의 효과
   단백질 발현과 PGE₂와 LTB₄ 생성 분석 실험에서의 결과에 기초하여, SNU-1076과 PCI-50을 대상으로 COX-2와 5-LO 억제의 암세포 성장 억제 효과의 평가를 진행하였다. siRNA 병합 처리에 의해 COX-2와 5-LO 발현이 효과적으로 억제됨을 확인하였다. 실험에 사용된 세포주 모두 COX-2와 5-LO 발현 및 그 활성이 높음에도 불구하고, 각각의 억제 수단 단독 적용시에는 의미 있어 보이는 억제 효과가 확인되지 않지만, 두 억제 수단의 병합시에는 유효한 암세포 성장 억제 효과가 si-RNA 처리에서 확인되었다. SNU-1076의 경우에는 COX-2와 5-LO 단독 억제시 거의 반응이 없다가 병합 처리를 한 경우에 대조군에 비해 50%까지 암세포 성장이 억제가 되었으며, PCI-50의 경우에는 병합 시 70% 수준으로 성장 억제 효과가 확인되었다(Fig. 3).

두경부암세포주에서 VEGF 생성에 대한 COX-2와 5-LO 단독 억제와 병합 억제의 효과
   COX-2와 5-LO 병합 억제의 두경부암세포주에 대한 직접적인 성장 억제 효과 이외에도 암 신생혈관 생성에 기여하는 vascular endothelial growth factor(VEGF) 생성 차단을 통한 간접 항암 효과의 가능성을 확인하고자 하였다. 먼저 SNU-1076과 PCI-50을 대상으로 COX-2와 5-LO의 이들 세포주에서의 VEGF 생성에 대한 관여 가능성을 조사하기 위해, COX-2와 5-LO를 각각 발현하는 plasmid를 세포 내 이입한 결과, 실험 대상 세포에서 PGE₂와 LTB₄ 생성 증가와 함께 VEGF 생성이 3~8배 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 4A). 다음으로, SNU-1076과 PCI-50에서 COX-2와 5-LO siRNA 병합 억제가 각각의 단독 처리 시보다 VEGF 억제에 더 효과적임을 실험적으로 확인할 수 있었다(Fig. 4B).

고     찰

   저자들은 초기 연구에서 COX-2 특이적 억제 수단의 적용시 COX-2 화학억제제들의 COX-2의 발현과 무관한 항암효과의 기전을 관찰하였고, 또한 이 외에도 COX-2의 발현을 상당히 높게 보이는 두경부암세포주들에서 COX-2 선택적 억제제에 의한 암 성장 억제 효과가 나타나지 않는 경우를 관찰하였다. 이러한 결과는 두 가지의 가능성이 있는 것으로 판단되었는데, 하나는 각각의 암세포 고유의 세포내 특성에 의해 AA에서 COX-2에 의해 최종적으로 생성되는 PGs의 작용의 역할 정도가 크거나 약화되었을 수가 있는 것이다. 이는 AA와 COX-2 작용 기전에 연관된 다양한 PGs 생성효소 발현의 변화 또는 그 PGs 수용체 생성의 감소나 상실에서 기인하거나, 암세포의 특화된 세포 내 신호 전달 체계의 특성 속에서 COX-2 관련 신호계의 변형에 의한 현상으로 해석될 수가 있다. 즉, COX-2 과발현을 가지더라도 일부 암세포에서는 COX-2 다음으로 작용하는 최종 PGs 생성 효소 중 일부의 발현이 없거나 특정 PGs 수용체를 가지지 않으므로 해서, 그 세포에서는 다른 암세포에서와는 달리 COX-2의 과발현이 암화에서 중요한 역할을 보이지 않고, 단순 COX-2 과발현만을 가져온 것일 수도 있을 것이다. 
   또 다른 하나의 가능성으로 저자들은 COX-2와 다른 AA 대사 기전과의 상호 작용 관계를 고려하게 되었다. 즉, COX-2 억제로 인해 대사되지 못한 잉여 AA가 COX-2 이외의 다른 기전으로 전이될 수 있으므로,^8,9) 이러한 과정에서 생성된 AA대사 산물이 암화에 기여하여 COX-2 억제에 의해 상실된 PGs의 역할을 보상할 가능성을 실험적으로 검토하고자 하였다. 두경부종양세포에서 과발현되는 COX-2가 이들의 암화에 어떠한 방식으로던지 역할을 가진다면 분명 항암치료에서 적용될 수 있는 주요한 분자적 타겟으로서의 가치가 높을 것이므로, 이를 항암치료 측면에서 활용 가능한 방법을 찾는 것은 큰 의미가 있다고 본다. 
   COX-2 이외의 AA대사 기전이 암화에 연관될 가능성은 현재 연구가 활발하게 진행중인 분야이다. 현재 보고된 바에 의하면, 5-LO와 Cytochrome P450 epoxygenase 2J2(CYP2J2) 정도가 가장 흔하게 암세포에서 과발현되는 AA 대사 관련 인자이다.^10,11) 특히, 5-LO가 다양한 암종에서 암세포의 성장에 기여함이 다수 보고되어,¹²⁾ 본 저자들은 두경부종양세포에서의 5-LO의 동시 발현 가능성에 주목하였고, 이를 기초로 한 병합 억제 처리가 암세포의 살상 및 치료에 더 효과적일 수 있는지를 실험적으로 입증하고자 하였다. 서론에서 언급한 바와 같이, COX-2와 5-LO가 각각 다른 세포 내 수용체와의 결합을 통한 반응을 유도하지만, 일부 암세포에서 유사한 기전을 통해 암세포의 악성화에 관여한다는 점은 상당히 흥미로우며, 저자들의 가설의 검증 필요성을 더 증대시켰다. 
   결과적으로 두경부암세포에서 과발현되는 COX-2와 5-LO의 경우에는, 각각의 단독 억제시에는 두드러지는 항암 효과가 본 저자들의 실험 모델에서 관찰되지 않았지만, 병합 억제시에는 암세포 성장 억제 및 VEGF 생성 저하가 의미 있는 수준으로 확인되었다. 이러한 결과는 본 연구자의 모델과 같은 두경부암세포에서는, COX-2와 5-LO에 의한 암화 촉진 작용이 유사한 기전을 통하기 때문에 하나의 기전만이라도 활성화된 상태라면 암세포의 발달에 계속 기여 가능하기 때문일 것으로 추측된다. 또, 앞서 언급한 바와 같이 한쪽 기전의 차단 시에 발생한 잉여의 AA가 대사 가능한 다른 기전에 추가적으로 사용되어, 차단된 기전에 의한 암세포 발달 촉진 작용을 보완할 가능성이 있어 보인다.^8,9) 이는 병합 억제의 필요성에 대한 본 저자들의 가설을 지지하는 내용으로 판단되며, 추가적으로 두경부암세포의 암화에서의 COX-2뿐 아니라 5-LO의 주요한 역할 가능성을 제시하는 결과로 볼 수 있다. 다만 SNU-1041과 SNU-1066과 같이 COX-1의 높은 발현을 가지는 암세포에서는, COX-2와 5-LO의 병합 억제 시에도 두드러진 암세포 성장 및 VEGF 생성 억제 효과는 보이지 않았다. 이러한 결과는 COX-1에서 유래되는 PGE2가 계속 남기 때문일 것으로 추측되는데, COX(COX-1과 COX-2)에 의해 생성되는 PGs와 5-LO 기전 중 하나만의 차단은 그다지 효과가 없음을 제시한다. 이는 추가적으로 COX-2와 5-LO의 병합 억제 시도에서 대상 암세포에서의 AA 대사계에 관여하는 인자들의 발현 및 활성 정도에 대한 면밀한 사전 조사가 동반되어야함을 제시한다. 
   저자들은 두경부종양세포에서 과발현되는 5-LO가 최소한 암세포의 성장과 VEGF 생성에 관련됨을 확인하였다. 추가적으로 이러한 실험 결과는 두경부종양세포와 같이 COX-2 이외에 다른 AA 대사 기전이 암화에 관련되는 경우라면, 이들의 병합 억제가 선택이 아닌 필수적으로 적용되어야 함을 의미한다. COX-2의 단독 억제 효과가 우수한 대장암과 같은 일부 암종의 경우는 COX-2 억제 수단의 가치가 쉽게 확인되지만, 두경부암종과 같이 COX-2의 항암치료에서의 적용 가치가 복합적인 의미를 보이는 암종 또한 존재할 수 있으며, 이러한 경우에 대해서는 앞으로 보다 깊이 있는 연구를 통해 그 분자적 항암치료 대상으로서의 가치 정립이 중요하다고 판단된다.

1. Harizi H, Corcuff JB, Gualde N. Arachidonic-acid-derived eicosanoids: roles in biology and immunopathology. Trends Mol Med 2008;14(10):461-9.

2. O'Donnell VB, Maskrey B, Taylor GW. Eicosanoids: generation and detection in mammalian cells. Methods Mol Biol 2009;462:5-23.

3. Levick SP, Loch DC, Taylor SM, Janicki JS. Arachidonic acid metabolism as a potential mediator of cardiac fibrosis associated with inflammation. J Immunol 2007;178(2):641-6.

4. Zheng Y, Ritzenthaler JD, Sun X, Roman J, Han S. Prostaglandin E2 stimulates human lung carcinoma cell growth through induction of integrin-linked kinase: the involvement of EP4 and Sp1. Cancer Res 2009;69(3):896-904.

5. Park SW, Lee SG, Song SH, Heo DS, Park BJ, Lee DW, et al. The effect of nitric oxide on cyclooxygenase-2 (COX-2) overexpression in head and neck cancer cell lines. Int J Cancer 2003;107(5):729-38.

6. Roh JL, Sung MW, Park SW, Heo DS, Lee DW, Kim KH. Celecoxib can prevent tumor growth and distant metastasis in postoperative setting. Cancer Res 2004;64(9):3230-5.

7. Tong WG, Ding XZ, Talamonti MS, Bell RH, Adrian TE. LTB4 stimulates growth of human pancreatic cancer cells via MAPK and PI-3 kinase pathways. Biochem Biophys Res Commun 2005;335(3):949-56.

8. Ye YN, Wu WK, Shin VY, Bruce IC, Wong BC, Cho CH. Dual inhibition of 5-LOX and COX-2 suppresses colon cancer formation promoted by cigarette smoke. Carcinogenesis 2005;26(4):827-34.

9. Cianchi F, Cortesini C, Magnelli L, Fanti E, Papucci L, Schiavone N, et al. Inhibition of 5-lipoxygenase by MK886 augments the antitumor activity of celecoxib in human colon cancer cells. Mol Cancer Ther 2006;5(11):2716-26.

10. Jiang JG, Ning YG, Chen C, Ma D, Liu ZJ, Yang S, et al. Cytochrome p450 epoxygenase promotes human cancer metastasis. Cancer Res 2007;67(14):6665-74.

11. Catalano A, Procopio A. New aspects on the role of lipoxygenases in cancer progression. Histol Histopathol 2005;20(3):969-75.

12. Melstrom LG, Bentrem DJ, Salabat MR, Kennedy TJ, Ding XZ, Strouch M, et al. Overexpression of 5-lipoxygenase in colon polyps and cancer and the effect of 5-LOX inhibitors in vitro and in a murine model. Clin Cancer Res 2008;14(20):6525-30.