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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 53(6); 2010 > Article
Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 2010;53(6): 349-353.
doi: https://doi.org/10.3342/kjorl-hns.2010.53.6.349
The Demonstration of Bacterial Biofilm and It's Impact on Postoperative Course in Patients with Chronic Rhinosinusitis.
Jin Woong Choi, Sung Tae Seo, Sun Gui Kim, Yong Min Kim, Ki Sang Rha
1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Chungnam National University School of Medicine, Daejeon, Korea. ksrha@cnu.ac.kr
2Research Institute for Medical Sciences, Chungnam National University School of Medicine, Daejeon, Korea.
만성 비부비동염에서 Biofilm이 수술 후 경과에 미치는 영향
최진웅1 · 서성태1 · 김선귀1 · 김용민1,2 · 나기상1,2
충남대학교 의학전문대학원 이비인후과학교실1;의학연구소2;
ABSTRACT
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Bacterial biofilm is thought to contribute to the progression and persistence of chronic rhinosinusitis. There are many studies which demonstrate these structures on chronic rhinosinusitis (CRS), but the majority of the studies just focus on the documentation of their presence and the method for identification. There are also a few researches that show the impact of biofilm on postoperative surgical outcomes. In this study, we demonstrated bacterial biofilm in CRS patients and determined whether they affect clinical courses and outcomes after surgery.
SUBJECTS AND METHOD:
The mucosa of ethmoid bulla was obtained during endoscopic sinus surgery from 21 CRS patients. Fluorescent microscope and scanning electron microscopy (SEM) were used for the determination of biofilm. The outcomes of the surgery were evaluated by endoscope every two weeks for 6 months. Preoperative symptom scores, CT scores, and the post operative results were compared between patients with biofilm and patients without biofilm.
RESULTS:
Bacterial biofilm were seen in 13 (62%) of the 21 CRS patients. A statistical association existed between the presence of biofilm and the worsened preoperative symptom scores, but the preoperative CT scores were not related to the presence of biofilm. Patients with biofilm had long-lasting postoperative mucosal inflammation and a prolonged healing time, and these differences have statistical significance.
CONCLUSION:
This study showed that the presence of bacterial biofilm were significantly correlated with worsening preoperative symptom scores and the prolonged postoperative recovery time. Therefore, bacterial biofilm may play an important role in the recalcitrant and resistant nature of CRS.
Keywords: Chronic rhinosinusitisBiofilm

Address for correspondence : Ki-Sang Rha, MD, PhD, Department of Otolaryngology-Head & Neck Surgery, Chungnam National University School of Medicine, 33 Munhwa-ro, Jung-gu, Daejeon 301-721, Korea
Tel : +82-42-280-7698, Fax : +82-42-253-4059, E-mail : ksrha@cnu.ac.kr

서     론


  
만성 비부비동염의 발생 원인 및 병태 생리는 아직까지 명확하게 밝혀져 있지 않다. 자연구의 폐쇄와 세균감염 외에도 진균 감염, 초항원(superantigen), 알레르기 반응, 표피세포에 관여하는 유전자 이상, 부비동의 골염(osteitis) 등이 만성 비부비동염의 발생에 관여할 것으로 생각되며, 최근에는 Biofilm이 만성 비부비동염의 재발과 염증 악화 등에 관여할 것이라는 연구결과가 보고되고 있다.1,2,3,4,5)
   주변 환경이 세균들의 생존에 부적합한 경우 세균들은 스스로 만들어낸 다당류기질(polysaccharide matrix, glycocalyx)에 둘러싸인 채 구조화된 집락(microcolony)을 이루는데 이것을 biofilm이라고 한다. Biofilm은 주로 생체 표면, 죽은 조직의 표면 또는 생체에 쓰이는 의료기구의 표면에서 발견된다.6,7) 그 동안 biofilm은 비뇨생식기 감염 및 카테터 감염(catheter infection), 치성 감염, 낭포성 섬유증(cystic fibrosis) 등에서 지속적인 감염과 항생제 치료에 저항하는 원인으로 알려져 왔으며,6,7) 이비인후과 영역에서도 중이 환기관(ventilation tube)이나 인공 와우(cochlear implant) 삽입 후 발생하는 염증에서 biofilm 형성이 관찰되었으며, 일부 만성 중이염이나 편도 및 아데노이드 질환에서 반복적인 감염을 일으키고 치료에 저항하는 원인 중의 하나로 생각되고 있다.8,9,10,11,12,13)
   최근 몇몇 연구에서 biofilm이 만성 비부비동염 환자에서 발견되어, biofilm이 만성 비부비동염의 염증 과정을 악화시키는 역할을 할 것으로 생각되고 있다. 그러나 대부분의 연구는 만성 비부비동염 환자의 부비동점막에서 biofilm이 존재하는지 여부에 초점을 맞추고 있으며, biofilm의 존재와 임상양상이나 수술 후 결과와의 상관관계에 대한 연구는 거의 보고되어 있지 않다.
   따라서 본 연구에서는 만성 비부비동염 환자에서 biofilm을 검출하고, biofilm이 검출된 환자들에서 biofilm의 존재 유무가 질환의 임상양상과 수술결과에 어떤 영향을 미치는지 알아보고자 하였다.

대상 및 방법

대  상
   2007년 11월부터 2008년 1월까지 만성 비부비동염으로 부비동 내시경수술을 받은 환자 중 수술 후 6개월까지 정기적으로 외래에서 경과 관찰이 가능한 21명을 대상으로 하였다. 이 중 남자가 15명 여자가 6명이었고 나이는 11
~75세(평균 37.7세)였다. 모든 환자에서 비용이 동반되어 있었다.
   만성 비부비동염은 2003년에 Chronic Rhinosinusitis Task Force에서 정한 3개월 이상 지속되는 화농성 비루, 비폐색, 후비루, 두통, 후각장애 등의 증상과 내시경으로 관찰한 비강 소견 및 부비동 전산화단층촬영(ostiomeatal unit computed tomography, OMU-CT) 결과로 진단하였다.3) 수술 전 1개월 이내에 전신적 항생제 및 스테로이드를 사용한 환자와 진균성 부비동염, 후비공비용, 해부학적 이상이 있는 환자는 제외하였다. 수술 전 증상의 정도는 7개의 항목으로 구성되어 있는 five point ranking scale questionnaire를 이용하여 각 항목에 대해 0=증상이 없음(no complaint), 1=경증(mild), 2=증등도(moderate), 3=중증(severe), 4=너무 심해서 괴롭다(intolerable)로 점수화하였다.14) Lund-MacKay scoring system을 이용하여 모든 환자의 OMU-CT에서 관찰되는 부비동 상태의 점수로 좌우 평균치를 구하였다.15)

조직의 채취 및 Biofilm 분석
   내시경하에서 먼저 구상돌기를 제거하여 사골봉소를 노출시킨 후 사골겸자를 이용하여 사골봉소를 통째로 제거하여 얻었다. 조직에서 뼈를 제거하여 점막만을 얻은 후 두 개로 나누어 표본을 만들고 각각 형광 현미경(fluorescent microscope)과 주사전자현미경(scanning electron microscope, SEM)으로 biofilm 형성 유무를 관찰하였다.

형광 현미경
   채취한 사골봉소 점막을 즉시 알루미늄 금속 박편(aluminum foil)으로 둘러싼 후 액화 질소에 바로 담가 냉각시킨 후 -70℃의 온도에서 보관하였다. -20℃의 cryoworker에서 10 μm 두께로 절편을 만든 후 70% acetone으로 고정하였다. 고정된 절편을 phosphate-buffered saline(PBS)으로 3차례 세척한 후 우선 15 μM의 Propium iodide로 5분간 염색하였다. 그 후 다시 PBS로 세척한 후 50 μg/mL의 Concanavalin A fluorescein isothiocyanate(FITC)(C7642; Sigma-Aldrich Inc, MO, St. Louis, USA)로 5분간 염색하였다. 이후 다시 PBS로 세척한 후 Olympus IX 70 inverted microscope(Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 biofilm을 분석 관찰하였으며 Olympus DP Controller software를 이용하여 사진촬영하였다.
   형광현미경에서 Propium iodide와 Concanavalin A로 이중 형광 염색을 했을 때 biofilm을 구성하는 세균이나 주변 점막세포가 빨강형광을 띠며 다당류 기질은 녹색형광을 띠기 때문에 biofilm은 빨강형광과 녹색형광이 겹쳐 보이게 된다. 이렇게 이중 형광이 관찰되는 경우를 biofilm양성군으로 하였다.5,9)

주사전자현미경
   조직절편을 세절한 후 2.5% glutaraldehyde(in pH 7.4, 0.1M phosphate buffer, 4℃)에 2
~4시간 동안 전고정하고 완충액(0.1M phosphate buffer, pH 7.2)으로 10분씩 3회 세척한 후, 1% osmium tetroxide(in pH 7.2, 0.1M phosphate buffer, 4℃)에 2시간 동안 후고정하였다. 다시 같은 완충용액으로 세척한 후 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%의 4℃ 에탄올용액에서 탈수 처리하여 isoamyl acetate로 치환하고 critical point dryer로 건조시킨 후, SC502 sputter coater를 이용하여 20 nm 두께로 도금한 후 주사전자현미경(HITACHI S-4300N, Tokyo, Japan)으로 관찰하고 사진촬영하였다.
   Biofilm을 구성하고 있는 세균들은 SEM에서 관찰해 보면 구형으로 나타나며 대부분 집락을 이루고 있다. 또한 세균들이 만들어낸 다당류기질들과 water channel 등을 포함하여 다형성의 삼차원적 구조로 나타난다. 이러한 특징적인 삼차원적 구조들이 세균들의 군락 주위에 같이 관찰되는 경우를 biofilm 양성군이라고 하였다.9,16)

수술 후 결과에 대한 평가
   수술 후 2주마다 비강의 상태를 내시경으로 관찰하여 염증과 부종이 없는 정상인 경우와 염증이 있거나 부종이 지속되는 경우로 나누어 기록하였다. 점막이 정상보다 비후되어 있는 경우, 용종이 관찰되는 경우 및 분비물의 성상이 점액성이거나 농성인 경우를 비점막의 염증 상태라 판정하였고 반면에 점막의 비후가 관찰되지 않거나 점막부종이 소실되어 정상화된 경우 및 소량의 장액성 분비물이 관찰되거나 관찰되지 않는 경우를 치유라 판정하고 그때까지 걸리는 기간을 기록하였다.

통계 처리(Statistic analysis)
   Biofilm 양성인 환자군과 음성인 환자군의 증상 점수, Lund-MacKay 점수, 그리고 치유 기간을 평균값±표준편차로 나타내었다. 각각의 측정치를 biofilm이 관찰된 만성 부비동염 환자군과 관찰되지 않은 환자군에서 2-표본 비모수적 검정의 Mann-Whitney 검정(Mann-Whitney U Test)를 이용하여 비교 분석하였다. 두 군의 수술 후 경과는 Fisher's exact test를 통해 분석하였다. 통계프로그램은 SPSS version 14.0(SPSSInc. IL, Chicago, USA)를 이용하였고. 유의수준은 0.05 미만으로 하였다.
   이번 연구는 본 병원의 임상시험심사위원회(institutional review board, IRB)의 승인 후에 시행하였다.

결     과

Biofilm의 검출
   형광현미경 또는 주사전자현미경에서 biofilm이 관찰되는 경우를 양성군으로 하였다. 총 21명의 환자 중 13예(62%)에서 biofilm이 관찰되었다(Figs. 1 and 2). 형광현미경과 주사전자 현미경에서 각각 11예(52%)와 9예(42%)가 관찰되었으며 이 중 7예(33%)는 두 가지 현미경 모두에서 관찰되었다.

Biofilm의 형성과 수술 전 임상적 지표의 관계
   수술 전 환자들의 증상을 Five point ranking scale questionnaire을 이용하여 점수화했을 때 biofilm이 관찰된 만성 비부비동염 환자들의 평균 증상 점수는 17.3±2.4이었고 biofilm이 관찰되지 않은 만성 비부비동염 환자에서는 14.1±3.0이었다. Biofilm이 있는 환자군에서 보다 증상이 더 심하였고 이는 통계적으로 유의했다(p=0.037). Lund-MacKay 점수는 biofilm이 있었던 군에서는 8.2±3.2, biofilm이 없었던 군에서는 8.6±2.2으로 Lund-MacKay 점수와 biofilm의 유무와는 통계적으로 유의한 상관관계가 없었다(p=0.78). 상악동, 사골동과 전두동에 염증이 있는 경우는 biofilm이 없는 군에서 3예, biofilm이 있는 군에서 5예였고 상악동, 사골동, 전두동과 접형동인 경우는 각각 5예, 8예였다. 병변의 범위와 Biofilm의 유무와도 유의한 상관관계가 없었다(p=1)(Table 1).

Biofilm 형성과 수술 후 경과
   수술 후 내시경으로 추적관찰하였을 때 biofilm이 관찰된 환자군은 그렇지 않은 군에 비해 술 후 4개월, 5개월에 염증이 지속되는 환자가 유의하게 많았다(Table 2). 그리고 biofilm이 관찰되지 않았던 환자들은 술 후 5개월에 모두 치유되었으나 biofilm이 관찰되었던 환자군에서는 13명 중 9예에서 염증 혹은 부종이 관찰되었다. Biofilm이 관찰되지 않았던 환자군은 수술 후 점막이 정상으로 회복되는데 11.6±5.8주가 소요되었으나, biofilm이 있었던 환자군은 20.3±5.0주가 소요되어 biofilm이 검출된 환자의 치유기간이 통계적으로 유의하게 길었다(p<0.001).

고     찰

   만성 비부비동염 환자의 비점막에서 biofilm의 검출 빈도는 연구자에 따라 다양하게 보고되고 있다. Prince 등4)은 157명의 만성 비부비동염 환자에서 28.6%의 빈도로 biofilm이 검출된다고 보고하였고 Psaltis 등5)은 공초점레이저주사현미경(confocal laser scanning microscope, CLSM)으로 관찰한 결과 44%의 환자에서 biofilm이 검출된다고 하였다. 또한 Sanclement 등2)은 SEM을 이용하여 24명의 만성 비부비동염 환자의 80%에서 biofilm을 관찰하였다.
   점막이나 어떠한 조직 또는 물체의 표면에 부착한 세균들은 미세군락을 형성하며 세균 상호간에 수로(water channel) 등을 통해 신호전달과 영양분을 공급하는 조직화된 군집을 이루며 스스로 다당류 기질을 생성하여 biofilm을 형성한다. 이러한 biofilm을 관찰하는 방법으로는 SEM 또는 투사전자현미경(transmission electronic microscope, TEM) 등의 전자 현미경을 이용하는 방법과 CLSM을 이용하는 방법 그리고 형광 제자리 보합법(fluorescence in situ hybridization, FISH) 방법 등이 있다. SEM은 다당류기질 등의 3차원적 구조물을 고배율로 관찰할 수 있는 장점을 가지고 있다. 그러나 조직 표본을 제작할 때 소요되는 시간이 길며 알데하이드나 에탄올을 사용하기 때문에 biofilm의 다당류 기질이 탈수(dehydration)되어 구조적 변형을 야기할 수 있다. 또한 분석시 단순 점액(mucus)과 혼동할 수 있는 단점이 있다. TEM은 다당류기질 내에 좀 더 깊이 존재하는 세균들을 2차원적으로 검출할 수 있으나 SEM과 마찬가지로 표본 제작에서 탈수의 과정을 거쳐 조직 구조를 변형시킬 수 있으며, 절편이 60
~90 nm로 초극박(ultrathin)이어서 존재하는 biofilm을 찾아 내지 못할 수 있다.2,16) Ha 등16)은 이러한 TEM의 단점 때문에 TEM으로만 biofilm을 검출하는 것은 잘못된 방법이라고 하였다. 반면 CLSM은 조직 표본 제작과정이 짧고 고정이나 탈수 등의 과정을 거치지 않아 조직 손상이 적다. 또한 핵산 probe를 사용하기 때문에 점액과 biofilm을 구별하는 데 용이하다. 이러한 점 때문에 Psaltis 등5)은 CLSM을 biofilm의 검출 방법 중에 가장 효과적인 방법이라고 하였다. FISH는 미리 검출될 예상 균주에 맞는 probe를 써야 한다는 단점이 있어 probe 이외의 균주에 의한 biofilm을 측정할 수 없는 단점이 있다. 현재까지 biofilm 검출의 표준화된 방법은 없으며 이러한 관찰 방법의 차이에 따라 biofilm의 검출 빈도가 달라질 수 있다. 본 연구에서는 SEM에서 발견이 되거나 또는 형광현미경에서 발견이 되는 경우를 biofilm 양성군이라고 하였는데 이는 SEM의 조직 처리과정으로 발생할 수 있는 위음성을 보완하기 위해서 두 가지의 검출방법을 사용하였다. SEM과 형광 현미경을 이용하여 관찰한 결과 62%의 환자에서 biofilm이 발견되어 Prince 등4)이나 Psaltis 등5)보다 높은 검출률을 보였다.
   만성 비부비동염의 수술 후 결과에 영향을 미치는 요인에 대한 많은 연구가 보고되고 있다. Mark와 Shamsa17)는 과거 부비동 수술 여부와 CT score가 수술 후 경과와 관련이 있다고 하였고, Lawson18)은 천식이 수술 후 질환의 재발과 관련이 있다고 하였다. 그러나 biofilm 유무와 만성 비부비동염의 수술 후 경과를 비교한 연구는 40예의 만성 비부비동염 환자를 대상으로 한 Psaltis 등19)의 연구 이외에는 보고된 바가 없다. Psaltis 등은 biofilm이 있는 환자군이 biofilm이 관찰되지 않은 환자군에 비해 수술 전 시행한 CT score가 더 나쁘고 수술 후 증상 및 점막 상태가 호전되는 데 더 오래 걸렸다고 보고하였다. 본 연구에서는 Psaltis 등의 연구와 달리 biofilm 유무와 수술 전 CT score와는 연관이 없었다. 그러나 수술 후 6개월까지 2주 단위로 수술 후 점막 상태를 비교했을 때 biofilm이 관찰되었던 만성 비부비동염 환자에서 점막 부종이 좀 더 지속되는 양상을 보였고 치유될 때까지 걸리는 시간도 길어 biofilm 형성이 수술 후 치유과정에도 영향을 미칠 것이라고 생각하였다. 또한 수술 후 biofilm 양성군에서는 경과 관찰 중 좀 더 적극적인 생리식염수 세척(saline irrigation)을 시행하여 물리적 제거를 시도하였는데, 이러한 처치에도 불구하고 치유기간이 biofilm 음성군에 비해 유의하게 길게 나타나 biofilm이 수술 후 경과에 영향을 미치는 것으로 생각된다.
   본연구의 대상자들은 병변의 범위가 상악동, 사골동 및 전두동을 포함하고 있었으며 13명의 환자들은 접형동까지 병변이 있는 범비부비동염을 보였다. 따라서 수술의 범위도 사골동 절제술이 모두 포함되어 있어 수술 후 결과의 판정은 전반적인 비강 내 점막의 상태를 수술자 본인이 관찰하여 평가하였다. 수술한 사람과 경과 관찰한 사람이 동일인이기 때문에 경과 관찰 중에 편견(bias)이 발생할 수 있다는 제한점이 있다.


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