교신저자：나기상, 301-721 대전광역시 중구 대사동 640  충남대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   최근 일반적인 항생제의 치료에 반응하지 않는 만성 감염질환들이 증가하고 있는데 이의 원인으로는 항생제의 오남용으로 인한 내성균의 출현과 biofilm이 관여하는 것으로 생각되고 있다.
   Biofilm은 만성 감염질환에서 주목받고 있는 개념으로 세균들이 자체의 안정성을 유지하기 위하여 숙주의 점막이나 이물 등에 부착하는 데 필요한 세포외 중합물질(extraellular polymeric substance, EPS)을 분비하여 이 속에 군집의 형태로 존재하고, 이러한 상태가 면역반응은 물론 항생제의 치료에도 잘 반응하지 않는 만성 감염상태를 유발하며 또한 biofilm 형태로 존재하던 세균들은 부유형으로 유리되어 주변의 조직이나 다른 부위의 감염을 유발할 수 있는 것으로 알려지고 있다.^1,2)
   최근 만성 비부비동염, 중이염 등과 같은 만성 상기도 감염증에서 또는 실험적으로 유발된 중이염 및 진주종성 중이염에서도 biofilm의 형성이 확인됨으로써 이러한 질환에서도 biofilm이 병태생리에 중요한 역할을 하는 것으로 생각되고 있지만^3,4,5,6,7) 임상적으로 만성 중이염 혹은 진주종성 중이염 환자에서 biofilm의 형성과 그 빈도를 조사한 연구는 많지 않았다.
   본 연구에서는 만성 중이염과 진주종성 중이염에서 biofilm의 존재 여부와 그 빈도를 확인하여 보고자 하였다.

대상 및 방법

대  상
   만성 중이염과 만성 진주종성 중이염으로 진단하고 수술을 시행한 85명의 환자들을 대상으로 하였다. 이 중 단순 중이염 환자는 21명이었으며 진주종성 중이염 환자는 64명이었다. 수술전 2~3주 이상의 충분한 항생제 치료에도 불구하고 수술 당시 화농성의 이루가 있는 경우를 활동형으로 이루가 없는 경우를 비활동형으로 분류하였는데 활동형이 52명, 비활동형이 32명이었다(Table 1). 단순 중이염 환자에서는 수술 중 미세겸자 등으로 얻은 21개의 중이 점막조직 및 육아조직은 주사전자현미경 및 투과전자현미경으로 관찰하였으며, 진주종성 중이염 환자에서 얻은 64개의 진주종 조직은 광학현미경과 주사전자현미경으로 관찰하였다.
   광학현미경을 통하여는 군집되어 있는 균들의 존재유무, 투과 전자현미경으로는 세포외 물질들로 둘러싸여 있는 균들의 존재를 관찰하였으며 주사전자현미경으로는 군집되어 있는 균들의 삼차원적 구조를 관찰하여 biofilm의 존재여부를 판정하였다.

광학현미경적 관찰
   수술 중 얻어진 조직은 10% formalin으로 고정한 뒤 탈수 과정을 거쳐 파라핀 블록을 제작하였으며 5 μm 두께의 절편을 만들고 gram 염색을 시행하여 광학현미경(BX51TRF, Olympus, Tokyo, Japan)하에서 관찰하였다.

전자현미경적 관찰
   주사전자현미경적 관찰을 위하여 2.5% glutaraldehyde에 고정된 조직은 탈수와 금도금 과정을 거쳐 주사전자현미경(S2500, Hitach, Tokyo, Japan)하에서 관찰하였다.
   투과전자현미경적 관찰을 위하여 고정된 조직은 osmium으로 후고정 하고 탈수의 과정을 거친 뒤 Spurr epoxy resin에 포매하고 70 nm의 두께의 절편을 만들어 uranyl acetate와 lead citrate로 염색한 뒤 투과전자현미경(Tecnai G2 Spirit Twin, FEI company, USA)하에서 관찰하였다.

통계학적 검정
   Biofilm 형성 빈도를 활동형과 비활동형으로 나누어 비교하였으며, 단순 중이염군과 진주종성 중이염군 사이의 형성빈도 차이를 비교하였다. 통계학적 방법으로는 Fisher's exact test를 이용하여 p값이 0.05 미만일 때 유의하다고 하였다.

결     과

   단순 중이염 환자의 중이점막이나 육아조직에서는 총 21명의 환자 중 7명(33%)에서 biofilm의 형성을 관찰할 수 있었다(Fig. 1). 이 중 5명의 활동형 환자에서는 3명(60%)이, 16명의 비활동형 환자에서는 4명(25%)이 각각 biofilm을 형성하고 있음을 관찰할 수 있었는데 활동형이 비활동형에 비하여 biofilm의 형성 빈도가 높았으나 통계적으로 유의하지는 않았다.
   진주종성 중이염 환자로부터 얻어진 진주종 조직에서는 총 64명의 환자 중 41명(64%)에서 biofilm의 형성을 관찰할 수 있었다(Figs. 2 and 3). 이 중 47명의 활동형 환자에서는 31명(66%)이, 17명의 비활동형 환자에서는 10명(58.8%)이 각각 biofilm을 형성하고 있음을 관찰할 수 있었는데 활동형과 비활동형에서 그 형성 빈도는 큰 차이를 보이지 않았다(Table 1).
   하지만 전체 85명의 환자를 활동형과 비활동형으로 분류하여 biofilm의 형성 빈도를 조사한 결과에서는 활동형 52명의 환자 중 34명(65.4%)에서 그리고 비활동형 33명의 환자 중 14명(42.4%)에서 biofilm의 형성을 보여 활동형에서 비활동형에 비하여 통계적으로 유의하게 biofilm의 형성이 많았다(Table 2).
   또한 단순 중이염과 진주종성 중이염으로 나누어 그 빈도를 조사한 결과에서는 단순 중이염 21명의 환자 중 7명(33%)에서, 진주종성 중이염 64명의 환자 중 41명(64%)에서 biofilm의 형성을 보여 진주종성 중이염에서 단순 중이염에 비하여 통계적으로 유의하게 biofilm의 형성이 많았다(Table 3).

고     찰

   Biofilm은 세균들의 3차원적인 군집으로 최근 많은 만성 감염질환에서 그 존재가 밝혀지고 있다. 보통 biofilm의 형성은 5단계로 설명하는데, 먼저 세균이 표면에 부착되면 조직이나 숙주와의 고착을 위하여 세포외 중합 물질(extracellular polymeric substance, EPS)을 분비하여 안정화를 유도하고 이러한 상태에서 세균들이 모여서 군집을 이루면 초기의 biofilm 형태가 이루어진다. 이러한 형태가 성장과 성숙과정을 거치게 되면 세균들은 다시 부유형으로 유리되어 주변조직이나 다른 부위로의 감염을 유발하게 된다.¹⁾
   최근 이비인후과 영역의 만성 감염질환에서도 이러한 biofilm의 존재가 밝혀지고 있다. 주로 만성 비부비동염에서 다양하게 biofilm의 형성이 관찰되고 있는데 실험적으로 유발된 부비동염 동물모델에서,⁸⁾ 그리고 만성 비부비동염 환자에서 수술 중 얻어진 비강내 점막에서도 biofilm이 관찰되며,⁹⁾ 최근에는 이러한 biofilm의 형성이 만성 비부비동염의 수술후 증상의 개선이나 점막의 상태에도 영향을 미치는 것으로 보고되고 있다.¹⁰⁾ 
   Coticchia 등¹¹⁾은 만성 비부비동염의 소아와 폐쇄성 수면무호흡증을 가지고 있는 소아의 아데노이드에서 biofilm의 존재여부를 관찰한 결과 폐쇄성 수면무호흡증을 가지고 있는 환자에서는 약 1.9%, 그리고 만성 비부비동염의 경우 94.9%에서 biofilm의 형성을 관찰하여 특히 소아에서 비인강에 존재하는 biofilm이 만성 비부비동염의 병태생리에 중요하다고 보고하였다. 최근에는 만성 혹은 재발성 편도염 조직의 약 70%에서 biofilm의 존재를 관찰한 연구도 있었다.¹²⁾
   이와 같이 biofilm은 만성 혹은 재발성으로 발생하는 상기도 감염의 질환에서 주로 보고가 되고 있지만 이외에도 고막의 환기관 삽입술 이후에 지속되는 이루를 보이는 환자에서 환기관 자체에 biofilm의 형성이 관찰되었으며,¹³⁾ 인공와우 이식기,¹⁴⁾ 기관절개술 이후 사용되는 기관절개관,¹⁵⁾ 중심정맥카테터 등¹⁶⁾에도 biofilm의 형성이 관찰되어 만성 염증 질환 이외에도 이식물이나 의료용 재료의 표면에도 감염의 위험성이 보고되고 있다.
   중이염과의 연관성에 대해서도 Post 등⁴⁾과 Ehrlich 등⁵⁾이 Haemophilus influenza를 이용하여 실험적으로 유발한 중이염에서 biofilm의 형성을 관찰하였으며, Dohar 등⁶⁾은 Pseudomonas aeruginosa를 이용한 만성 화농성 중이염의 중이점막에서 biofilm의 형성을 관찰하였다. 또한 만성 진주종성 중이염에서도 이와 유사한 연구가 진행되었는데 Chole 등⁷⁾은 gerbil에서 실험적으로 유발한 진주종에서 22마리 중 21마리에서 biofilm의 형성을 관찰하였으며, 24명의 진주종 환자 조직 중 16명에서 biofilm의 존재를 관찰하여 만성 중이 감염질환의 병태생리에 관계됨을 보고하였다. 그러나 국내에서는 본 연구처럼 많은 수의 만성 중이염 환자를 대상으로 병변조직에서 biofilm의 존재여부를 연구한 논문은 거의 없었는데 결과적으로 만성 중이염 및 진주종성 중이염 조직의 33%와 64%에서 biofilm의 존재를 관찰하여 그 빈도가 적지 않음을 알 수 있었다.
   이러한 biofilm상태의 세균은 일반적인 항생제의 치료에 잘 반응하지 않는 것으로 알려져 있는데 Costerton 등¹⁷⁾에 의하면 biofilm을 형성하고 있는 경우는 항생물질에 500배 이상 내성이 있는 것으로 보고하고 있다. 그 이유는 항생물질 자체나 또한 포식세포의 산물인 hydrochlorite와 hydrogen peroxide와 같은 reactive oxidants가 biofilm의 EPS를 투과하기 어렵고,¹⁸⁾ 또한 biofilm을 형성하고 있는 세균들 중의 일부는 서서히 성장하거나 성장을 거의 멈춘 상태로 있게 되는데 이러한 상태의 세균들은 항생물질 자체에 감수성이 없기 때문이며, 일부 세균들 자체가 생물학적으로 다른 표현형을 가지기 때문으로 생각되고 있다.^19,20)
   최근 이러한 biofilm의 치료적인 측면에서 연구가 진행되고 있는데 세균들의 군집을 이루는데 중요한 quorum sens-ing이라 불리는 세균간의 전달 체계를 방해하거나, 세균의 부착이나 biofilm을 조절하는 유전자의 전사를 억제하는 것 등이 중요할 것으로 생각되고 있다. 또한 물리적 혹은 화학적인 방법으로 EPS를 파괴하여 항생제나 면역반응의 감수성을 증가시키는 방법들이 연구되고 있다.^2,17,20)
   본 연구에서는 만성 중이염 및 진주종성 중이염 조직의 33%와 64%에서 biofilm의 존재를 확인하였는데, biofilm은 단순 중이염보다 진주종성이 유의하게 많이 관찰되었다. 또한 염증 활동성에 따라 biofilm의 형성 정도를 비교한 결과, 전체적으로 활동형에서 비활동형보다 biofilm의 형성이 유의하게 많이 관찰되었다. 이러한 결과로 일반적인 항생제에 잘 반응하지 않고 만성 이루를 보이는 중이염에서 biofilm의 형성이 내성에 일부 관여를 하는 것으로 생각된다. 하지만 분석의 기준에서 단순히 수술 당시 이루가 있는지의 여부에 따라 활동형과 비활동형을 구분하였으므로 감염질환의 활동성의 여부를 정확하게 판단하기는 어려우며, 세균배양 검사를 동시에 시행하여 세균의 동정과 biofilm의 형성관계를 관찰하지 못한 점과 이루의 기간이나 항생제 내성 정도, 그리고 중이 조직의 상태 등을 고려하여 비교 분석하지 못하였다. 특히 단순 중이염의 경우 검사에 충분한 조직을 얻기가 쉽지 않아 여러 가지 검사를 동시에 진행하여 biofilm의 형성을 관찰하지 못한점이 본 연구의 제한점으로 생각된다. 또한 만성 중이염은 대부분 수술적인 방법으로 염증조직과 병변을 제거하여 치료하는데 현재까지는 biofilm의 형성여부를 미리 손쉽게 관찰하거나 진단하는 방법이 별로 없고 주로 수술 후 조직 검사에 의존하는 실정이다. 따라서 일반적인 항생제의 충분한 치료에도 반응이 없는 만성 이루를 보이는 일부 만성 중이염에서는 biofilm의 형성 가능성을 고려하여 치료의 방침을 결정하는 것도 도움이 될 것으로 생각한다.

결     론

   본 연구에서는 만성 중이염과 진주종성 중이염 조직에서 biofilm의 존재를 관찰하고자 하였다. 그 결과 단순 만성 중이염의 약 33%, 그리고 진주종성 중이염의 약 64%에서 biofilm이 관찰되었다. 이루를 기준으로 질환을 활동형과 비활동형으로 분류하였을 때 활동형에서 비활동형보다 biofilm의 형성이 많았으며 단순 중이염보다 진주종성 중이염에서 biofilm의 형성이 많이 관찰되었다. 이상의 결과로 biofilm이 일부 만성 중이염과 진주종성 중이염의 병태생리에서 중요한 역할을 하는 것으로 생각되며 이에 따른 추가적인 연구가 진행되어야 할 것으로 생각한다. 

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