교신저자：김용대, 705-717 대구광역시 남구 대명동 317-1  영남대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
교신저자：전화：(053) 620-3781 · 전송：(053) 628-7884 · E-mail：ydkim@med.yu.ac.kr

서     론 

   Macrolide는 세균의 50S ribosomal subunit에 결합하여 단백합성을 저해함으로써 정균작용을 나타내는 항생제로, 급성 호흡기감염에 주로 사용된다.¹⁾ 정균작용 이외에 erythromycin, roxithromycin, clarithromycin과 같은 14-membered lantone ring을 가진 macrolide는 면역조절, 세균의 병원성 감소, biofilm 형성 억제, 점액분비 억제 작용도 있다.²⁾
   점액(mucus)은 호흡기 상피 표면을 덮고 있는 물질로서 이들 기관에 적절한 습도를 유지해주고 윤활역할을 하며, 외부로부터 유입되는 물질에 대한 방어작용을 한다. 그러나 만성 비·부비동염, 만성 기관지염, 천식, 낭성 섬유증 등의 만성 염증성 호흡기질환에서는 점액의 분비가 과도하게 일어나거나 그 성상이 변화하여 병의 경과를 악화시킬 수 있어, 점액의 과다 분비를 조절하는 것이 매우 중요하다.
   점액의 성상을 결정하는 것은 점액 내의 당단백인 점소(mucin)로 점액유전자에 의해 생성이 조절된다. 현재까지 사람에서 발견된 점액유전자는 20여가지이며 호흡기에서 발현되는 중요한 점액유전자는 MUC2, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC8로 알려져 있다.³⁾ 이 중 MUC2와 MUC5 AC에 관한 연구가 가장 많이 이루어져 왔으나, 최근에는 분비형 점소(secreted mucin)인 MUC5B와 MUC8, 막성 점소(transmembrane mucin)인 MUC4의 역할을 규명하기 위한 연구도 이루어지고 있다.^4,5,6,7,8)
   14- 및 15-membered macrolide가 점액 및 객담의 생성을 감소시키며 호흡기 상피세포에서 MUC2, MUC4, MUC5AC 유전자의 발현을 억제하는 것으로 알려져 있다.^{8,9,10,11,12)} 하지만 만성 부비동염의 코점막과 비용조직에서 발현이 증가된다고 알려져 이비인후과 영역에서 최근 그 중요성이 부각되고 있는 분비형 점소인 MUC5B와 MUC8의 유전자 발현에 macrolide가 어떤 영향을 미치는지에 대한 보고는 없는 상태이다.^5,6) 따라서 사람의 호흡기 상피세포인 비용상피세포와 NCI-H292세포에서 14-membered macrolide인 roxithromycin이 MUC5B, MUC8 유전자의 발현과 점액 단백 생성에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 이 연구를 시행하였다.

대상 및 방법

세포 배양 및 처치
   비용조직은 만성 비·부비동염 및 비용을 가진 10명의 환자에서 내시경적 부비동 수술 과정에서 채취하였다. 천식과 알레르기성 비염을 동반하지 않으며 최근 4주 동안 비·부비동염의 급성 악화나 약물 투여를 하지 않은 경우를 대상으로 하였다.
   채취한 비용조직을 즉시 penicillin 100 U/ml, streptomycin 100 μg/ml를 포함한 phosphate buffered saline(PBS)에 담아 4℃에서 30분간 넣어 두었다. PBS로 세척 후 조직배양접시에 놓고 섬유모세포, 근육세포, 혈관 내피세포, 혈구세포 등을 없애기 위해 현미경하에 작은 가위나 칼로 결체조직을 최대한 제거하였다. 결체조직이 제거된 후 상피가 위로 오도록 하여 조직배양접시에 넣은 후 상피가 다 잠길 정도로 dispase(GIBCO, Grand Island, NY, USA)를 10 ml 정도 첨가한 후 95%의 산소와 5%의 이산화탄소가 혼합된 환경의 배양기에서 37℃의 온도로 1시간 30분 동안 배양하였다. 이후 수술용 칼로 비용의 상피 표면을 깨끗하게 긁어내어 PBS에 담은 후 200 mesh에다 걸러내고 튜브에 담아 3,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상층부의 PBS를 제거하고 Human Keratinocyte Growth Supplement(HKGS, Cascade Biologics, Portland, OR, USA, 5 ml/500 ml of medium)가 첨가된 EpiLife Medium(Cascade Biologics) 6 ml를 넣은 후 24-well plate에 1 ml씩 접종하였다. 현미경으로 세포의 양을 확인한 후 2일마다 HKGS를 첨가한 EpiLife Medium으로 배지를 교체하면서 세포가 70~80% 정도의 융합기가 되면 실험에 사용하였다.
   인간 폐 점액상피양 암 세포주(human pulmonary mucoepidermoid carcinoma cell line)인 NCI-H292세포(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)를 6-well plate에 1×10⁶ cells/well의 농도로 접종한 후 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin과 10% fetal bovine serum(FBS)이 포함된 RPMI 1640(GibcoBRL) 배지를 이용하여 95%의 산소와 5%의 이산화탄소가 혼합된 배양기에서 37℃의 온도로 배양하였다. 수일 후 70~80% 정도의 융합기가 되면 세포를 0.5% fetal calf serum이 포함된 RPMI 1640 배지로 교체한 후 24시간 동안 배양하고, 다시 FBS가 포함되지 않은 RPMI 1640 배지로 세척한 후 실험에 사용하였다.
   배양된 인체 비용상피세포와 NCI-H292세포에 각각 20 ng/ml과 10 ng/ml의 IL-1β(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 처치하여 MUC5B와 MUC8 mRNA 발현과 점액분비를 유도하였다. Macrolide의 효과를 알아보기 위해서 세포에 50 μM, 100 μM, 200 μM 농도의 roxithromycin(HANDOK Pharmaceuticals Co., LTD., Seoul, Korea)을 전처치한 후 1시간 뒤에 IL-1β를 투여하였다. 대조군은 IL-1β, roxithromycin을 투여하지 않고 동일한 시간 동안 배지에서 배양하였다.

Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction(RT-PCR)을 이용한 점액유전자의 분석
   GeneAmp RNA PCR core kit와 PTC-200(MJ Research Inc., Watertown, MA, USA) PCR machine을 사용하여 제조사에 소개한 방법을 이용하여 시행하였다. PCR에 사용된 oligonucleotide primer는 밝혀진 염기서열에 의해 제작하였으며, 각 반응의 내부 양성 대조군(internal positive control)은 β₂-microglobulin(β₂M)을 사용하였다. 실험에 사용된 primer의 염기배열은 다음의 표와 같다(Table 1).
   증폭된 mRNA 산물의 크기는 MUC5B는 437 bp, MUC8는 239 bp, β₂M은 334 bp이었다. 과정을 간략히 설명하면, 배양된 세포를 2% bovine serum albumin을 함유한 PBS로 3회 세척한 후 Trizol^®(Molecular Research Center, Cincinnati, OH, USA)를 이용하여 총 mRNA를 추출하였으며, PCR은 94℃에서 60초간 변성(denaturation)과정을 거치고 MUC5B는 60℃에서, MUC8은 55℃에서 60초간 결합(annealing)반응을 시킨 후, 72℃에서 60초간 연장(extension)반응하였다. 이러한 과정을 MUC5B는 35회, MUC8은 31회 반복한 후 72℃에서 20분간 최종 연장반응을 시행하였다. 증폭된 PCR반응의 산물은 SYBR^® green이 함유된 1% agarose gel을 통한 전기영동을 이용하여 분리 관찰하였다. 발현된 mRNA의 양은 Scion image software(Scion Corporation, Frederick, MD, USA)를 이용하여 반정량적으로 분석하였고, 대조군의 발현정도를 1로 하여 상대적인 발현정도로 나타내었다.

면역분석법(Immunoassay)을 이용한 점액단백의 측정
   점액단백의 함량을 측정하기 위해서 ELISA(enzyme- linked immunosorbent assay)법을 이용하였다. 시료를 처리한 배양된 세포에서 lysis buffer(50 mM Tris·Cl [pH 7.5], 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid, 1% Triton X-100, and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride)로 단백을 추출하여 정량하였다. 추출한 단백 100 μg을 96-well plate에 담고 40℃에서 건조될 때까지 방치한 후 plate를 PBS로 3회 세척하였다. 비특이적 결합을 방지하기 위해 2% bovine serum albumin으로 실온에서 1시간 동안 차단한 후 PBS로 3회 세척한 다음 0.05% Tween 20을 함유한 PBS에 1：200으로 희석된 MUC5B와 MUC8 항체(Zymed, San Francisco, CA, USA)로 반응시켰다. 다시 PBS로 3회 세척한 후 이차항체인 horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG(Santa cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)를 0.05% Tween 20을 함유한 PBS에 1：5,000으로 희석하여 각 well에 첨가하였고 1시간 후에 각 well을 PBS로 3회 세척하였다. 3,3', 5,5'-tetramethyl benzidine 용액으로 발색한 후, 2N-H₂SO₄를 이용하여 중단시켰다. ELISA reader(EL800^®, BIO-TEK Instruments, Winooski, VT, USA)로 450 nm에서 흡광도를 측정한 후 표준곡선을 이용하여 단백의 양을 정량하였다.

통계 처리
   통계 처리는 Windows용 SPSS version 12.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 95%의 유의 수준에서 Student's t-test를 이용하였다.

결     과

IL-1β에 의한 점액유전자의 발현
   IL-1β를 NCI-H292세포와 비용상피세포에 다양한 농도로 처리하고 MUC5B에 대해서는 8시간, MUC8에 대해서는 24시간 뒤에 세포를 모은 뒤 RT-PCR을 이용하여 mRNA의 발현정도를 측정하였다. NCI-H292세포와 비용상피세포 모두 MUC5B 및 MUC8 점액유전자의 발현이 농도 의존적으로 증가되었다(Fig. 1).

NCI-H292 세포에서 roxithromycin이 IL-1β에 의한 점액유전자의 발현과 점액단백생성에 미치는 영향
   NCI-H292세포에 roxithromycin을 다양한 농도로 투여한 후 1시간 뒤에 IL-1β(10 ng/ml)을 처리하였으며, roxithromycin 처리 농도가 증가할수록 IL-1β로 유도된 MUC5B와 MUC8 mRNA 발현이 감소하였다(Fig. 2A, Table 2). MUC5AC와 MUC8 점액단백의 생성량도 roxithromycin의 농도가 증가할수록 통계학적으로 의미 있게 감소하였다(Fig. 2B). 

인체 비용상피세포에서 IL-1β에 의해 유도된 점액유전자의 발현과 점액단백생성에 대한 roxithromycin의 효과
   Roxithromycin의 효과가 비용상피세포에서도 유사하게 나타나는지를 확인하기위해 비용상피세포에 roxithromycin을 다양한 농도로 투여한 후 1시간 뒤에 IL-1β(20 ng/ml)을 처리하였으며, roxithromycin의 처리 농도가 증가할 수록 IL-1β로 유도된 MUC5B와 MUC8 mRNA 발현이 감소하는 양상을 나타내었다(Fig. 3A, Table 2). MUC5AC와 MUC8 점액단백의 생성량도 roxithromycin의 농도가 증가할수록 통계학적으로 의미 있게 감소하였다(Fig. 3B).

고     찰

   Macrolide는 macrocyclic lactone ring에 다양한 amino sugar가 부착되어 있는 구조로 macrocyclic ring 내의 탄소원자의 개수(12~16개)에 따라 분류하는 방법이 통용된다.¹⁾ 14-membered macrolide인 erythromycin, roxithromycin, clarithromycin 등과, 15-membered macrolide에 속하는 azithromycin이 임상에 흔히 사용되고 있다. 가장 먼저 개발된 erythromycin은 위장과 같은 산도가 높은 환경에서는 쉽게 분해되어 항균작용을 하지 못하는 단점이 있었다. 이를 보완하기 위해 roxithromycin, clarithromycin, azithromycin 등이 개발되어 임상에 널리 이용되고 있으며, 이 중 대표적으로 임상에서 널리 사용되고 있는 roxithromycin을 이번 연구에 이용하였다.
   배양된 인체 기도상피세포의 점액분비를 erythromycin이 억제한다는 사실이 알려진 뒤,¹³⁾ 만성기관지염과 기관지확장증 환자에 clarithromycin을 투여했을 때 객담의 양이 감소하고¹⁴⁾ 만성 부비동염 환자에게 clarithromycin을 4주간 투여했을 때 비강점액의 점성 및 탄성도가 감소한다는 연구결과가 보고되어,¹⁵⁾ macrolide의 점액 과분비 억제와 점액의 양상을 조절하는 작용기전에 대해 많은 연구가 시행되었다. 동물을 이용한 생체 내 연구에서 macrolide가 중성구의 활동을 억제함으로써 배세포의 증식과 이형성을 억제하여 점액분비를 감소시킨다는 보고가 있으나,¹⁰⁾ 14-membered macrolide가 다른 세포의 활동을 통하지 않고 호흡기 상피세포의 점액분비에 어떠한 영향을 미치는 지에 대한 연구는 부족한 상태이다.
   NCI-H292세포주에서 roxithromycin이 IL-1β에 의해 유도된 MUC2와 MUC5AC 유전자 발현과 점액분비를 억제하고,⁹⁾ clarithromycin과 erythromycin이 NCI-H292세포주와 사람의 비용상피세포에서 MUC5AC mRNA의 발현을 억제하며,¹⁰⁾ azithromycin이 NCI-H292세포주에서 3O-C12-homoserine lactone에 의한 MUC5AC mRNA의 발현과 단백 생성을 억제한다.¹¹⁾ 그리고 NCI-H292세포주와 배양된 비용상피세포에서 IL-1β에 의한 MUC4 유전자의 발현을 roxithromycin이 억제한다는 보고가 있다.⁸⁾
   최근에는 MUC2, MUC5AC, MUC4 외에 MUC5B와 MUC8이 상기도 염증질환에 중요한 점액유전자로 부각되고 있다. 만성 부비동염 환자군와 정상군의 부비동내 점액을 분석했을 때 MUC5AC는 두 군간에 차이가 없으나 M UC5B는 만성 부비동염 환자에서 현저하게 증가되어있음이 알려져 있다.⁵⁾ MUC8도 역시 만성 부비동염 환자의 상악동 점막에서 유전자가 상향조절되어 있으며,⁶⁾ Kim 등⁷⁾은 MUC8 mRNA가 정상 코점막보다 비용에서 발현정도가 높고, 비용조직에서 MUC8 유전자의 발현정도가 다른 점액유전자(MUC1, 2, 4, 5AC, 5B, 7)보다 높음을 보고하였다. 하지만 MUC5B와 MUC8 유전자의 발현에 macrolide가 어떤 영향을 미치는지에 대한 연구는 없는 실정이다.
   이 연구에서는 NCI-H292세포에서 IL-1β에 의한 자극으로 증가된 MUC5B와 MUC8의 유전자 발현 및 단백 생성이 roxithromycin에 의해 억제되었으며 배양된 인체 비용상피세포에서도 유사한 양상으로 roxithromycin에 의해 그 발현이 억제되어, 호흡기 상피세포에서 이들 유전자의 발현에 대한 roxithromycin의 억제효과를 확인할 수 있었다. 그러나 지금까지 MUC2와 MUC5AC가 호흡기에서 가장 중요한 점소로 알려져 있으므로 roxithromycin이 MUC5B와 MUC8의 발현을 억제하는 것이 전제 점소의 생성에서 어느 정도의 중요성을 가지고 있는지는 추가적인 연구가 필요하다. 또한 roxithromycin 450 mg을 경구투여 했을 때 혈중 농도가 14 μM 정도에 도달하는 것으로 알려져 있는데,¹⁶⁾ 이번 연구에 사용된 roxithromycin의 최소농도가 50 μM이었으므로 생체 내에서 상용 복용량에 의한 혈중농도로 어느 정도의 점액분비 억제효과가 발생할 수 있을지는 알 수 없으며, roxithromycin을 생체 내로 투여했을 때 상피세포에 대한 영향 외에 염증매개물질과 염증세포의 활성도에 다양한 변화를 일으켜 점액분비를 조절할 것으로 생각되므로 생체 내 실험이 반드시 뒤따라야 할 것으로 생각된다.
   NCI-H292세포에서 azithromycin이 3-oxododecanoyl homoserine lactone에 의한 MUC5AC의 발현을 억제하는 기전은 extracellular signal-regulated kinase(ERK) 1/2를 억제하여 나타나는 것이며,¹⁰⁾ roxithromycin이 phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)와 녹농균에 의한 MUC2 유전자 발현을 nuclear factor-kappa B(NF-κB)의 활성을 저해하여 억제한다는 연구결과도 있다.¹¹⁾ 따라서 macrolide에 의한 MUC5B와 MUC8 점액유전자의 억제에 관여하는 기전도 이들 경로와 유사한지, 아니면 다른 기전에 의한 것인지를 밝히기 위한 연구가 필요하다.

결     론

   이 연구는 이미 알려진 macrolide의 MUC2, MUC4, MUC5AC에 대한 억제작용 외에 MUC5B와 MUC8에 대한 억제효과를 밝힌 의의가 있다. 이 연구결과를 바탕으로 호흡기 상피세포에서 macrolide가 점액의 과분비를 억제하는 기전에 대해 더 깊은 연구를 진행한다면, 큰 부작용이 없이 점액의 과분비를 억제할 수 있는 새로운 약제의 개발에 도움이 될 것이다.

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