교신저자：김용대, 705-717 대구광역시 남구 대명 5동 317-1  영남대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
교신저자：전화：(053) 620-3781 · 전송：(053) 628-7884 · E-mail：ydkim@med.yu.ac.kr

서     론 

   호흡기도의 상피를 덮고 있는 점액(mucus)은 외부로부터 유입되는 이물질과 세균, 바이러스 등을 물리적으로 제거하고, 코점막의 습도를 조절해주는 역할을 한다. 그러나 염증성 호흡기 질환이 있을 경우 점액이 과다하게 분비되거나 그 점도가 높아져 분비물의 배출이 곤란해지거나 기도가 폐쇄되어 병의 경과를 악화시킬 수 있다. 이러한 점액의 성상을 결정하는 것은 점액 내에 포함된 당단백인 점소(mucin)이며, 점소의 성상을 결정하는 것은 점액유전자(mucin gene)이다. 현재까지 사람에서 발견된 점액유전자는 20여 가지가 있으며, 호흡기에서 발현되는 중요한 점액유전자는 MUC2, MUC4, MUC5AC, MUC5B 등이 있다.^1,2,3,4) 최근에는 사람의 코점막에서 MUC8 유전자가 발현되고, 정상 코점막에서보다 비용조직에서 그 발현 정도가 훨씬 높다는 보고가 있으며, 각종 염증매개물질에 의해서 사람의 정상 코점막에서 MUC8의 발현이 뚜렷하게 증가된다고 하여 코점막에서 MUC8 유전자의 역할에 대해 관심이 높아지고 있다.^5,6)
   비용은 그 자체가 점액을 과도하게 분비할 수 있으며, 비용으로 인해 부비동의 환기통로가 폐쇄되면 부비동염을 유발하여 부비동 점막에서의 점액 과분비도 일으킨다. 따라서 호흡기 상피세포와 비용에서 분비되는 점액의 생성과 그 유전자의 발현을 조절할 수 있는 약제를 개발할 수 있다면 비·부비동염에서 점액 과분비로 인해 발생하는 병의 악순환과 환자의 불편한 증상을 해소하는 데 획기적인 도움이 될 것이다.
   Prostaglandin(PG)은 세포막의 인지질에서 유래한 arachidonic acid에서 생성되는 autacoid로 그 종류가 다양하며 생체 내에서의 역할도 광범위하다. 그러나 대체적으로 염증반응의 매개역할을 하는 것으로 알려져 있고 이외에 평활근 긴장도, 지혈, 혈전생성, 분만, 위장관 분비 등에 관련되지만,⁷⁾ 가장 최근에 발견된 PG인 15-deoxy-delta^12,14-prostaglandin J₂(15d-PGJ₂)는 생성과정, 작용기전, 그리고 그 역할이 지금까지 알려진 PG들과는 다른 점이 많다.⁸⁾ 관절염, 허헐-재관류 손상, 염증성 장질환, 알츠하이머병 등과 같은 염증반응이 중요한 병인인 질환에 대해 치료 및 예방효과가 있는 것으로 알려져 있고, 세포의 종류와 농도에 따라 세포를 보호하거나 자연사를 유도하는 역할도 하여, 염증반응과 노화의 과정에 15d-PGJ₂가 어떠한 역할을 할 수 있는지에 대해 최근 연구가 활발하게 진행되고 있다.⁹⁾ 그러나 염증반응에 의한 기도점액 과분비 과정에 15d-PGJ₂가 어떤 효과가 있는지는 보고된 바가 없다.
   따라서 이 연구에서는 사람의 비용상피세포와 사람 호흡기 상피세포인 NCI-H292 세포주(Human lung mucoepidermoid carcinoma cell line)에서, 사람의 코점막상피세포에서 점액의 분비를 증가시키고 MUC8 유전자 발현을 증가시키는 것으로 이미 알려진 interleukin-1β(IL-1β)⁶⁾에 의한 MUC8 유전자와 단백분비에 15d-PGJ₂가 어떠한 작용을 하는지 알아보고자 하였다.

대상 및 방법

세포 배양 및 처치
   비용조직은 만성 비·부비동염 및 비용을 가진 10명의 환자에서 내시경 부비동 수술 과정에서 채취하였다. 천식과 알레르기성 비염을 동반하지 않으며 최근 4주 동안 비·부비동염의 급성 악화나 약물 투여를 하지 않은 경우를 대상으로 하였다.
   채취한 비용 조직을 즉시 penicillin(PC) 100 UI/ml, streptomycin(SM) 100 μg/ml를 포함한 phosphate buffered saline(PBS)에 담아 4℃에서 30분간 넣어 두었다가 꺼내어 PBS로 2번 세척 후 직경 60 mm 조직배양접시에 놓고 섬유모세포, 근육세포, 혈관 내피세포, 혈구세포 등을 없애기 위해 현미경하에 작은 가위나 칼로 결체조직을 제거하였다. 결체조직이 제거된 비용 상피가 위로 오도록 하여 60 mm 조직배양접시에 넣은 후 상피가 다 잠길 정도로 dispase(GIBCO, Grand Island, NY, USA)를 10 ml 정도 첨가한 후 95%의 산소와 5%의 이산화탄소가 혼합된 환경의 배양기에서 37℃의 온도로 1시간 30분 동안 배양하였다. 이후 15번 수술용 칼로 비용의 상피 표면을 깨끗하게 긁어내어 PBS에 담은 후 200 mesh에다 걸러내고 튜브에 담아 3,000 rpm에서 5분간 원심 분리하였다. 상층부의 PBS를 제거하고 Human Keratinocyte Growth Supplement(HKGS, Cascade Biologics, Portland, OR, USA, 5 ml/500 ml of medium)가 첨가된 EpiLife Medium(Cascade Biologics) 6 ml를 넣은 후 24-well plate에 1 ml씩 접종하였다. 현미경으로 세포의 양을 확인한 후 2일마다 HKGS를 첨가한 EpiLife Medium으로 배지를 교체하면서 세포가 어느 정도 증식되면 실험에 사용하였다.
   NCI-H292 세포(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)는 6-well plate에 1×10⁶ cells/well의 농도로 접종한 후 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin과 10% fetal bovine serum(FBS)이 포함된 RPMI 1640(GibcoBRL) 배지를 이용하여 95%의 산소와 5%의 이산화탄소가 혼합된 배양기에서 37℃의 온도로 배양하였다. 수일 후 배양이 어느 정도 이루어지면 세포를 0.5% FBS가 포함된 RPMI 1640 배지로 교체한 후 24시간 동안 배양하고, 다시 FBS가 포함되지 않은 RPMI 1640 배지로 세척한 후 실험에 사용하였다.
   배양된 NCI-H292 세포와 인체 비용상피세포에 각각 10 ng/ml과 20 ng/ml의 IL-1β(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 처치하여 MUC8 mRNA 발현과 단백분비를 유도하였다. 15d-PGJ₂의 효과를 알아보기 위해서는 세포에 다양한 농도의 15d-PGJ₂(BIOMOL, Inc., Plymouth Meeting, PA, USA)을 처치한 후 1시간 뒤에 IL-1β를 투여하였다. 대조군에서는 IL-1β이나 15d-PGJ₂를 투여하지 않고 동일한 시간 동안 배지에서 배양하였다.

Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction(RT-PCR)을 이용한 MUC8 점액유전자의 반정량적 분석
   GeneAmp RNA PCR core kit와 PTC-200(MJ Research Inc., Watertown, MA, USA) PCR machine를 사용하여 제조사의 방법대로 시행하였다. PCR에 사용된 oligonucleotide primer는 밝혀진 염기서열에 의해 제작하였으며, 각 반응의 내부 양성 대조군(internal positive control)은 β₂-microglobulin(β₂M)을 사용하였다. 실험에 사용된 primer의 염기배열은 MUC8의 경우 sense는 5'-ACA GGG TTT CTC CTC ATT G-3', antisense는 5'-CGT TTA TTC CAG CAC TGT TC-3'이며, β₂-microglobulin(β₂M)의 경우 sense는 5'-TCG CGC TAC TCT CTC TTT CTG G-3', antisense는 5'-GCT TAC ATG TCT CGA TCC CAC TTA A-3'를 사용하였다. 증폭된 mRNA 산물의 크기는 MUC8은 239 bp, β2M은 334 bp이었다. 과정을 간략히 설명하면, 배양된 세포를 2% bovine serum albumin을 함유한 PBS로 3회 세척한 후 Trizol^®(Molecular Research Center, Cincinnati, OH, USA)를 이용하여 총 mRNA를 추출하였으며, PCR은 95℃에서 60초간 변성(denaturation)과정과 61℃에서 30초간 결합(annealing)반응 및 72℃에서 60초간 연장(extension)반응을 30회 반복한 후 72℃에서 20분간 최종 연장반응을 시행하였다. 
   증폭된 중합효소연쇄반응의 산물은 SYBR green이 함유된 1% agarose gel을 통한 전기영동을 이용하여 분리 관찰하였다. 확인된 띠(band)의 세기는 Scion Image software (Scion Corporation, Frederick, MD, USA)를 이용하여 반정량적으로 분석하였고, 대조군의 density를 1로 하였을 때 실험군의 density 값을 비율로 나타내어 relative density로 나타내었다.

면역분석법(Immunoassay)을 이용한 MUC8 단백의 측정
   MUC8 단백의 함량을 측정하기 위해서 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)법을 이용하였다. 시료를 처리한 배양된 세포에서 lysis buffer(50 mM Tris·Cl [pH 7.5], 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid, 1% Triton X-100, and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride)로 단백을 추출하여 정량하였다. 추출한 단백 100 μg을 96-well plate에 담고 40℃에서 건조될 때까지 방치한 후 plate를 PBS로 3회 세척하였다. 비특이적 결합을 방지하기 위해 2% bovine serum albumin으로 실온에서 1시간 동안 차단한 후 PBS로 3회 세척한 다음 0.05% Tween 20를 함유한 PBS에 1：200으로 희석된 MUC8 항체(Zymed, San Francisco, CA, USA)로 반응시켰다. 다시 PBS로 3회 세척한 후 이차항체인 horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)를 0.05% Tween 20를 함유한 PBS에 1 : 5,000으로 희석하여 각 well에 첨가하였고 1시간 후에 각 well을 PBS로 3회 세척하였다. 3,3', 5,5'-tetramethyl benzidine 용액으로 발색한 후, 2N-H₂SO₄를 이용하여 중단시켰다. ELISA reader(EL800^®, BIO-TEK Instruments, Winooski, VT, USA)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 어떠한 약제도 처리하지 않은 대조군의 측정치를 기준으로 그보다 초과되거나 감소되는 양을 % above control로 계산하였다.

통계 처리
   통계 처리는 Windows용 SPSS version 12.0(SPSS inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 95%의 유의 수준에서 Student's t-test를 이용하였다.

결     과

IL-1β에 의한 MUC8 mRNA발현
   IL-1β를 배양된 NCI-H292 세포와 인체 비용상피세포에 다양한 농도로 처리하고 24시간 뒤에 MUC8 mRNA를 측정하였다. NCI-H292세포와 비용상피세포에서 MUC8 mRNA 발현이 용량 의존적으로 증가되었다(Fig. 1).

배양된 NCI-H292 세포와 인체 비용상피세포에서 IL-1β에 의해 유도된 MUC8 mRNA의 발현에 대한 15d-PGJ₂의 효과
   배양된 NCI-H292 세포와 인체 비용상피세포에 15d-PGJ₂를 각각 5 μM, 10 μM, 20 μM의 농도로 투여한 후 1시간 뒤에 NCI-H292 세포에는 10 ng/ml 농도의 IL-1β를, 인체 비용상피세포에는 20 ng/ml 농도의 IL-1β를 처리하였다. 24시간이 경과한 후 MUC8와 내부 대조군인 β₂-microglobulin의 mRNA 발현을 RT-PCR로 분석하였다. 배양된 NCI-H292 세포와 인체 비용상피세포에서 15d-PGJ₂처리 농도가 높을수록 IL-1β로 유도된 MUC8 mRNA 발현이 그에 비례하여 감소하였다(Figs. 2 and 3).

배양된 NCI-H292 세포와 인체 비용상피세포에서 IL-1β에 의해 유도된 MUC8 단백 분비에 대한 15d-PGJ₂의 효과
   배양된 NCI-H292 세포에서 아무런 약제도 처리하지 않은 대조군의 MUC8 단백 측정치를 기준으로 이를 0%로 하였을 때, 측정된 MUC8 단백의 양은 IL-1β만 처리한 군에서 83.3±13.7%, 15d-PGJ₂ 5 μM과 IL-1β를 처리한 군은 57.7±11.2%, 15d-PGJ₂ 10 μM과 IL-1β를 처리한 군은 32.4±6.3%, 15d-PGJ₂ 20 μM과 IL-1β을 처리한 군은 9.6±3.6%로 나타나 15d-PGJ₂의 농도가 증가할수록 MUC8 단백분비가 통계학적으로 의미 있게 감소하였다(p<0.05, Fig. 4). 비용상피세포의 경우에서도 IL-1β만 처리한 군은 92.4±14.2%, 15d-PGJ₂ 5 μM과 IL-1β를 처리한 군은 60.7±10.5%, 15d-PGJ₂ 10 μM과 IL-1β를 처리한 군은 42.0±6.4%, 15d-PGJ₂ 20 μM과 IL-1β을 처리한 군은 15.6±4.8%로 나타나 15d-PGJ₂의 처리농도가 증가할수록 MUC8 단백 분비가 통계학적으로 의미 있게 감소하였다(p<0.05, Fig. 4).

고     찰

   점소은 세포막 외로 분비되는 겔형성 점소(gel-forming mucins)와 막결합 점소(membrane-bound mucins)로 크게 분류되며 MUC8은 세포외부의 점액층의 점도와 탄성을 결정하는 겔형성 점소에 속한다.¹⁾ MUC8 mRNA가 기관지 상피에서 발현된다는 사실이 알려진 이후 비·부비동 점막에서의 MUC8 유전자의 발현에 대해서도 연구가 진행되었다. Kim 등⁵⁾은 MUC8 mRNA가 정상 코점막 보다 비용에서 발현정도가 높고, 비용조직에서 다른 점액유전자(MUC1, 2, 4, 5AC, 5B, 7)보다 MUC8 유전자의 발현정도가 높음을 보고하였다. 또한 사람의 정상 코점막 상피세포를 여러 가지 사이토카인으로 자극하였을 때 MUC8 mRNA와 단백의 발현이 증가됨이 알려져 있으며,⁶⁾ 만성 비부비동염 환자의 상악동 점막에서도 MUC8 유전자가 상향조절되어 있다.¹⁰⁾ 이번 연구에서도 전구염증성 사이토카인인 IL-1β로 자극된 호흡기상피세포주와 비용 상피세포에서 MUC8 mRNA의 발현이 증가하여 다른 연구자들의 보고와 유사한 양상을 나타내었다. 이처럼, 비용과 염증상태의 호흡기 상피세포에서 MUC8 유전자가 상향조절 되어있다는 사실을 볼 때, MUC8 유전자와 단백이 어떠한 역할을 하는지는 아직 완전히 밝혀지지는 않았지만 염증성 기도질환 및 비용에서의 점액 과분비와 점도의 변화에 MUC8 유전자가 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.
   15d-PGJ₂가 체내에서 생성되는 과정은, arachidonic acid가 cyclooxygenase에 의해 불안정한 중간물질인 PGH₂로 바뀌고 이는 다시 다양한 효소들에 의해 생물학적으로 활성상태인 PGD₂, PGE₂, PGF₂α, PGI₂ 등으로 변환된다. 이 중 PGD₂가 효소의 작용 없이 자연 탈수(dehydration)되면 PGJ₂로 전환되는 데 PGJ₂의 15-hydroxy group이 소실되어 한 단계 더 탈수되면 15d-PGJ₂가 생성된다.¹¹⁾ PGJ₂는 다른 PG와는 달리 cyclopentenone ring을 가지고 있는데 그 내부의 전자친화성 카르보닐기(electrophilic carbonyl moiety)에 의해 특징적인 생물학적 작용을 나타낸다.¹¹⁾
   15d-PGJ₂가 각종 세포에 미치는 효과는 15d-PGJ₂가 peroxisome proliferator-activated receptor γ(PPARγ)에 대한 내인성 리간드(endogenous ligand)로서 작용하여 나타나며, nuclear factor-kB(NF-kB), activator protein-1(AP-1), nuclear factor-erythroid 2p45(NF-E2)-related factors(Nrf2), hypoxia inducible factor(HIF), p53, signal transducer and activator of transcription(STAT) 등과 같은 전사인자의 조절을 통해서도 나타난다.^9,12,13,14) 이러한 과정을 통해 15d-PGJ₂는 항염증 효과를 나타내는 것으로 알려져 있으며, 세포의 종류와 처리농도에 따라 세포보호효과와 그 반대의 작용인 세포사멸효과도 나타낸다.^7,8,15,16) 그러나 호흡기 염증질환시 발생하는 점액의 과분비에 15d-PGJ₂가 어떤 영향을 미치는지는 아직까지 연구된 바가 없다.
   이번 연구에서는 염증성 코질환에서 점액의 과분비에 중요하다고 알려진 MUC8 mRNA의 발현과 단백분비에 15d-PGJ₂가 어떠한 작용을 나타내는지를 알아보았는데, 배양된 NCI-H292 세포와 인체 비용상피세포에서 IL-1β에 의해 증가된 MUC8 mRNA의 발현을 15d-PGJ₂가 농도 의존적으로 감소시키는 것을 알 수 있었다. 그리고 15d-PGJ₂가 IL-1β에 의해 증가된 MUC8의 발현만을 억제하고 IL-1β를 투여하지 않은 생리적 상태에서는 억제효과가 나타나지 않았으므로, 15d-PGJ₂는 IL-1β에 의해 유발되는 염증반응을 억제함으로써 MUC8 mRNA의 과발현을 억제하는 것으로 생각된다. 이번 연구는 15d-PGJ₂가 점액유전자 과발현을 억제하는 물질임을 밝혔으나, 그 기전에 대해서는 앞으로 추가적인 연구가 필요하다.
   한편, 코점막에서 점액이 주로 분비되는 세포는 배세포와 점막하 분비선인데 MUC8 mRNA의 발현과 단백 분비는 분비세포뿐만 아니라 비용, 비강 그리고 상악동 점막의 섬모세포(ciliated cell)에서도 일어난다.^10,17,18) 비용의 상피는 정상 비·부비동 점막에서보다 두꺼워져 있는데 이는 배세포의 수는 매우 감소된 반면 섬모세포가 많이 증식된 결과이다.¹⁹⁾ 따라서 MUC8 유전자가 점액의 생성뿐만 아니라 비용에서의 섬모세포 과증식과도 관련이 있다면 15d-PGJ₂가 비용의 발생을 성장을 억제시킬 수 있는지에 대해서도 연구가 필요할 것이다.
   또한 비용에서는 MUC8이 중요한 점소로 최근 알려져 있지만 MUC2, MUC5AC, MUC5B 또한 비·부비동 염증성 질환에서 중요한 점소로 알려져 있으므로 다양한 점소를 대상으로 15d-PGJ₂의 효과에 대한 연구가 시행되어야 할 것으로 사료된다.

결     론

   배양된 NCI-H292 세포와 인체 비용상피세포에서 15d-PGJ₂는 IL-1β에 의한 MUC8 mRNA의 발현을 농도 의존적으로 억제하여 점액 분비를 억제하는 것으로 생각된다.

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