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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 51(5); 2008 > Article
Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 2008;51(5): 422-428.
Neural Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow of Human Mastoid Process.
Hyong Ho Cho, Han Seong Jeong, Su Jeong Jang, Jong Seong Park, Hyu Chae Cho, Chul Ho Jang, Yong Bum Cho
1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Chonnam National University Medical School, Gwangju, Korea. choyb@chonnam.ac.kr
2Department of Physiology, Chonnam National University Medical School, Gwangju, Korea.
3Research Institute of Medical Sciences, Chonnam National University Medical School, Gwangju, Korea.
인간 유양돌기 골수 유래 간엽줄기세포의 획득 및 신경세포로의 분화
조형호1 · 정한성2 · 장수정2 · 박종성2 · 조휴채1 · 장철호1 · 조용범1,3
전남대학교 의과대학 이비인후과학교실1;생리학교실2;의과학연구소3;
주제어: 간엽줄기세포세포분화측두골유양돌기.
ABSTRACT
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Reports of neural differentiation of mesenchymal stem cells suggest the possibility that these cells may serve as a source for stem cell-based regenerative medicine to treat neurological disorders. The purpose of this study was to generate neural cells by differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells that isolated from human mastoid process.
MATERIALS AND METHOD:
Human mesenchymal stem cells (hMSCs) isolated from human mastoid process bone marrow during mastoidectomy for chronic otitis media surgery were characterized using fluorescence-activated cell sorter. Induction of neural differentiation from hMSCs was performed using mitogenic factors (basic fibroblast growth factor, epidermal growth factor, forskolin, isobutylmethylxanthine), and the characterization of differentiated hMSCs was performed using immunohistochemistry, RT-PCR and whole cell patch clamp technique.
RESULTS:
hMSCs from bone marrow of mastoid process were isolated and cultured. Differentiated cells from hMSCs expressed mRNA transcripts for neuron specific markers, TUJ1 and neurofilament proteins (NF-L, NF-M) as determined by RT-PCR, and neuron specific markers, suhc as NeuN, TUJ1, microtubule-associated protein-2 (MAP2) and glial fibrillary acidic protein by immunohistochemistry. These cells showed voltagedependent sodium currents that was blocked by tetrodotoxin.
CONCLUSION:
hMSCs, which were isolated from human mastoid process bone marrow, were one of the good sources for stem cell-based regenerative medicine to treat neurological disorders.
Keywords: Mesenchymal stem cellsCell differentiationTemporal boneMastoid

교신저자:조용범, 501-190 광주광역시 동구 학1동 8번지  전남대학교 의과대학 이비인후과학교실
교신저자:전화:(062) 220-6770 · 전송:(062) 228-7743 · E-mail:choyb@chonnam.ac.kr

서     론 


  
줄기세포는 불멸의 세포로 무기한 동안 세포분열을 통해 스스로 자랄 수 있고 또한 다양한 특정 세포로 다분화(多分化)할 수 있는 다잠재능(multiponteniality)을 유지하는 특성을 갖고 있다. 이는 특정한 세포로 분화를 할 수는 있지만 자가 재생산을 못하는 전구세포(progenitor cell)와 구별되는 점이다. 인간을 포함한 포유류의 줄기세포는 배반포의 내측 세포군에서 유래한 배아줄기세포와 골수 및 제대혈에서 유래한 간엽 줄기세포, 조혈 줄기세포, 그리고 신경줄기 세포 등의 성체줄기세포가 있다.
   줄기세포를 이용한 연구는 최근 몇 년 동안 다양하게 진행되어 왔고, 이비인후과적인 영역에서도 동물의 줄기세포를 이용하여 내이손상을 유발한 실험동물에 동물의 신경줄기세포나 배아줄기세포를 이식한 후 이식된 줄기세포가 손상된 내이에서 생존하면서 유모세포나 신경세포로 분화되었음을 확인하는 연구가 활발히 진행되고 있다.1,2,3,4,5,6) 국내에서도 개의 지방조직내 간엽줄기세포를 이용하여 연골세포로의 분화를 시킨 연구와 개의 자가골수 줄기세포를 이용하여 골 형성 임플란트를 개발한 보고가 있다.7,8)
   또한, 줄기세포 연구의 최종적인 목적인 인간에의 적용을 위하여 최근 면역거부반응을 낮추고 윤리적 문제를 극복하기 위해 자신의 골수나 제대혈에서 유래된 간엽줄기세포를 신경세포로 분화시켜 사용하는 연구가 시작되고 있으나, 줄기세포획득의 어려움 때문에 연구에 쉽게 사용하지 못하는 실정이다.9,10,11)
   이에 본 연구에서는 만성중이염 수술 중 병변 제거를 위하여 제거하여야 하는 유양돌기 골수를 채취 배양하여 간엽줄기세포를 확립하고 이를 in vitro에서 신경세포로 분화시키고 그 성상을 규명하여 추후 인간줄기세포 연구에서 쉽게 사용할 수 있는 인간 간엽줄기세포를 확립하고자 하였다.

재료 및 방법

만성중이염 수술 환자의 유양돌기에서 채취한 골수에서 간엽줄기세포의 분리 및 배양
  
만성중이염으로 인하여 유양돌기 삭개술이 필요한 환자 중 실험목적으로 본인의 유양돌기 내에 존재하는 골수 일부를 사용하는 데 동의한 환자 10명의 경화형 유양돌기에서 작은 큐렛을 이용하여 골수를 약 2
~3 cc 채취하였다. 채취한 골수를 10% fetal bovine serum(Hyclone, Logan, UT, USA), 1% penicillin-streptomcin(Hyclone, Logan, UT, USA), 0.2% amphotericin B(Fungizone®, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)를 함유한 dulbecco's modified eagle's medium high glucose 배지(Hyclone, Logan, UT, USA)에서 인간간엽줄기세포를 분리 배양하였다. 배양은 37℃ 가습 배양기에서 5% 이산화탄소와 95% 공기 환경하에서 시행하였다. 배양 7일째에 배지를 교체하면서 non-adherent cell을 제거하였다. 첫 번째 배양이 충분히 이루어진 후 배양된 세포를 ethylene diamino-tetraacetic acid(Hyclone, Logan, UT, USA)을 함유한 trypsin을 이용하여 획득하고 계대배양을 시행하였다.

FACS(Fluorescence-activated cell sorting)를 이용한 인간간엽줄기 세포의 성상 규명
  
유양돌기에서 분리 배양된 인간간엽줄기세포의 성상을 규명하기 위하여 조혈줄기세포 표지자인 CD34, CD45와 간엽줄기세포 표지자인 CD44, CD90을 FACS(BD FACS Calibur System, BD Biosciences Immunocytometry System, Heidelberg, Germany)를 이용하여 검사하였다.

인간간엽줄기세포에서 신경세포로의 분화 유도
  
유양돌기 골수에서 분리 배양한 인간간엽줄기세포를 외배엽에서 유래된 신경세포로 분화시키기 위하여 배양액에 혈장을 제거하고 basic fibroblast growth factor(bFGF, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA), epidermal growth factor(EGF, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA), forskolin(Sigma Chemical co., St. Louis, MO, USA), isobutylmethylxanthine(IBMX, Sigma Chemical co., St. Louis, MO, USA) 등을 첨가하여 2주 정도 배양하여 신경세포로 분화를 유도하였다.

RT-PCR
  
Trizol(TriReagent, Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH, USA) 시약을 이용해서 인간 간엽줄기 세포를 수확한 후 trizol 1 ml당 chloroform(Sigma Chemical co., St. Louis, MO, USA)과 isoamyl alcohol(Sigma Chemical co., St. Louis, MD, USA) 300 μl를 추가하여 회전시켜 섞었다. Sample을 얼음에 20분간 둔 다음 13,200 rpm에서 20분간 원심분리 후 새로운 tube로 옮기고 chloroform과 isoamyl alcohol 300 μl를 추가한 다음 원심분리를 한번 더하고 isopropanol(Sigma Chemical co., St. Louis, MD, USA)을 섞어서 혼합 후 냉동고에 1시간 보관하였다. 이후 조직을 꺼내어 4℃에서 30분간 둔 다음 상층액을 제거하고 75% ethanol 800 μl로 씻어준 후 원심분리하고 상층액을 버린 다음 100% ethanol 800 μl를 추가하여 원심분리하고 건조시켰다. RT buffer(GibcoBRL, Grand Island, NY, USA), deoxynucleoside triphosphate (dNTP, GibcoBRL, Grand Island, NY, USA) 10mM, N6 random hexamer(GibcoBRL, Grand Island, NY, USA), ribonucleic acid guard ribonuclease(RNase) inhibitor (GibcoBRL, Grand Island, NY, USA), DTT(GibcoBRL, Grand Island, NY, USA) 0.1 M, deoxyribonuclease와 RNase 없는 증류수를 추가하여 회전시켜 섞은 후 마지막으로 200 UI의 moloney murine leukemia virus(GibcoBRL, Grand Island, NY, USA)를 추가하여 37℃에서 60분, 75℃에서 15분간 배양하였다. 신경세포 표지자인 TUJ1, neurofilament(NF-L, NF-M)와 초기 유모세포 표지자인 Math-1과 bone morphogenic protein(BMP4, BMP7)에 대한 인간 mRNA primer(Bioneer Co., Daejeon, Korea)를 제작하여 해당온도에서 확립된 간엽줄기세포 시기와 신경세포로 분화된 시기에 각각 RT-PCR을 시행하였다. 사용된 primer는 Table 1과 같다.

In vitro에서 면역조직화학 염색을 이용한 인간간엽줄기세포에서 분화된 신경세포의 성상 규명
  
인간간엽줄기세포를 신경세포로 분화시키기 위하여 분리된 간엽줄기세포를 Aclar
®에 분주하여 분열촉진인자인 bFGF, EGF, forskolin, IBMX 등을 처리하여 분화시켰다. 염색을 위하여 4% paraformaldehyde(Sigma Chemical co., St. Louis, MO, USA)를 이용하여 고정하고, Triton X-100(Sigma Chemical co., St. Louis, MO, USA)으로 침투화(permeabilization) 과정을 거친 후에 TUJ1(Chemicon, Temecula, CA, USA), microtuble-associated protein-2(MAP2, Chemicon, Temecula, CA, USA), NeuN(Chemicon, Temecula, CA, USA), 아스트로사이트 특이 표지자인 glial fibrillary acidic protein(GFAP, Chemicon, Temecula, CA, USA)의 1차 항체를 준비하여 4℃에서 12시간 정도 반응시켰다. 
   이후 PBS로 여러 번 씻고 2차 항체로 1시간 30분 동안 반응시킨 후에 3,3'-diaminobenzidine(Chemicon, Temecula, CA, USA)로 염색하여 확인하였다.

전기생리학적 연구
   Hamil 등12)의 whole-cell patch clamp 방법을 이용하여 전압의존성 나트륨 전류를 기록하였다. 기록용 전극은 미세유리전극제조기(Narishige, Tokyo, Japan)와 microforge(MF-79, Narishige, Tokyo, Japan)를 이용하며 Digidata 1,200B(Axon instruments, Foster city, CA, USA) interface를 통하여 컴퓨터와 연결하였다. 막전압 조절과 실험결과 얻어진 나트륨 전류의 기록 및 자료분석은 pClamp 7 software(Axon instruments, Foster city, CA, USA)를 사용하며, oscilloscope를 사용하여 전류의 변화를 동시에 관찰하였다.

결     과

유양돌기 골수에서 인간간엽줄기세포 배양
  
만성중이염 환자의 수술 중 실험적으로 유양돌기 골수의 사용에 동의하고 골수 채취가 용이한 환자 10명의 골수에서 줄기세포를 분리하여 배양할 수 있었다. 환자는 남자가 4명, 여자가 6명이었고, 나이는 29세에서 71세까지 다양하였다. 채취된 모든 골수에서 줄기세포를 분리할 수 있었고, 환자의 나이에 따른 차이는 없었다. 세포는 in vitro에서 세포분열을 통해 증식하는 성질을 보였고, 섬유모세포와 유사한 형태를 보였다(Fig. 1). 계대 배양은 10회까지 시행하였고, 신경세포로의 분화를 위해서 3번째 계대배양을 한 세포를 사용하였다.

배양된 인간간엽줄기세포의 성상
  
줄기세포의 성상을 규명하기 위하여 시행한 FACS를 통하여 조혈줄기세포의 표지자인 CD34, CD45에 음성이었고, CD44와 CD90에 양성인 간엽줄기세포를 확인할 수 있었다(Fig. 2).

인간간엽줄기세포에서 신경세포로의 분화
  
인간간엽줄기세포가 들어있는 배양액에 bFGF, EGF, forskolin, IBMX를 투여하여 분화된 세포는 축삭(axon)과 가지돌기(dendrite)를 가지고 있는 신경세포 모양을 보였다(Fig. 3).

분화된 신경세포의 성상확인
  
신경세포로 분화한 후 성상을 확인하기 위해 시행한 RT-PCR에서 신경세포의 표지자인 TUJ1, NF-L, NF-M에서 양성 소견을 보였다(Fig. 4). 또한, 면역조직화학 염색에서도 TUJ1, MAP2, NeuN, GFAP에 양성인 세포를 관찰할 수 있었다(Fig. 5). 신경세포로 분화된 줄기세포를 이용하여 시행한 전기생리학적 검사에서 테트로도톡신(tetrodotoxin)에 의해서 차단되는 전압의존성 나트륨전류를 기록할 수 있었다(Fig. 6).

고     찰

   줄기세포를 이용한 연구는 초기에는 특별한 신경전달 물질의 이상인 경우나 과거 인간 태아의 뇌조직 이식으로 어느 정도의 효과를 보았던 일부 질환을 모델로 하였다. 하지만 이제는 줄기세포를 이용하여 인공피부를 만들고 망막의 상피세포를 재현하며, 뇌졸중, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅톤병(Huntington's disease), 근육위축가쪽경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis) 등 다양한 만성 뇌신경 질환 혹은 퇴행성 뇌질환에서 활발한 연구가 진행되어 왔다.13,14,15) 하지만 배아줄기세포 사용으로 인한 윤리적 문제점과 종양형성 가능성에 대한 문제가 제기되어, 최근에는 면역거부반응을 낮추고 윤리적 문제를 극복하기 위해 자신의 골수나 제대혈에서 유래된 간엽줄기세포를 신경세포로 분화시켜 사용하는 연구가 시작되고 있다.9,10,11)
   이비인후과적인 영역에서 줄기세포를 이용하여 가장 흔히 연구되는 질환으로 청각장애를 들 수 있다. 이러한 청각장애는 이비인후과 영역에서 다른 어떤 감각장애보다도 흔하게 접하는 질환이며 또한 일상생활에 심대한 영향을 미치는 질환이다. 대부분의 청각장애를 유발하는 유모세포의 소실은 노화, 큰소리에 과도한 폭로, 아미노글리코사이드 항생제나 항암제에 의한 부작용, 바이러스 감염, 유전적 질환에 의하여 발생한다. 유모세포가 소실된 후에는 유모세포에서 뇌로 소리신호를 전달하는 양극성 나선신경절의 신경이 소실되고 이로 인하여 더욱더 청력이 악화되고 재활의 가능성이 점점 떨어지게 된다.16,17) 따라서 유모세포의 소실로 인한 청각장애 환자에게는 유모세포의 재생뿐만 아니라 나선신경절의 신경의 재생도 병행하여야 한다.
   현재까지 진행되고 있는 내이의 유모세포의 분화를 유도하는 연구로 Li 등은 생쥐 배아 줄기세포에 EGF, bFGF, insulin-like growth factor를 사용하여 먼저 신경 조상세포(progenitor cell)로 분화시키고 단계적으로 분열촉진인자를 제거하여 유모세포로 분화시켜 RT-PCR과 면역조직 염색으로 선조세포와 유모세포 표지자들에 대한 특성을 규명하였다.5,6) 또한, Doetzlhofer 등1)은 생쥐 태아에서 내이 상피세포와 간엽세포를 각각 분리배양하여 내이 상피세포의 유모세포로의 분화에 간엽세포와 이주위간엽세포(periotic mesenchymal cell)와 EGF가 필수적임을 밝혔으며, Hu등2)은 고농도 neomycin을 이용하여 기니픽의 내이를 손상시키고 생쥐에서 분리한 신경줄기세포에 neurogenin 2 유전자를 넣어 이식함으로써 이식한 줄기세포가 내이의 유모세포위치 뿐 아니라 나선신경절 주변까지 생존해 있음을 확인하였다. 동양에서의 연구는 교토의대에서 활발히 진행되고 있는데, 쥐의 신경줄기세포와 생쥐의 배아줄기세포를 쥐, 생쥐 및 닭에 이식하여 와우와 전정 유모세포로 분화시키는데 성공하였고, 이들 유모세포에서 시냅스 소포(synaptic vesicle) 표지자인 synaptophysin이 발현되어 감각신경과의 연결로가 형성될 수 있음을 시사하였다.3,4) 하지만 이러한 연구들은 인간 줄기세포가 아닌 생쥐나 쥐에서 만들어진 신경줄기세포나 배아 줄기세포를 사용함으로써 이종이식으로 인한 윤리적, 면역적 문제점을 내포하고 있다. 따라서 이러한 윤리적, 면역적 문제점을 극복하기 위하여 최근 간엽줄기세포를 이용한 치료법들이 다양하게 시도되고 있으나 아직 청감각세포의 재생에 대한 연구는 미흡한 실정이다.
   인간간엽줄기세포를 얻기 위한 방법으로 골수 조직이 풍부한 대퇴골 등에서 주사기를 이용하여 골수를 얻는 방법과 탯줄 혈액 등에서 조혈모세포를 이용하여 얻는 방법 등이 있지만 이러한 방법들은 채취에 여러 가지 어려움이 있어서 연구에 쉽게 사용하지 못하는 실정이다. 만성중이염 수술을 위하여 유양돌기 삭개술을 하다보면 골수조직을 자주 접하게 되고 이를 제거하여야 하는 경우가 발생하게 된다. 따라서, 이러한 유양돌기 골수 조직 채취는 환자의 동의만 있다면 언제든지 쉽게 행할 수 있다는 장점과 환자에게 골수 채취를 위해 다른 조작을 가하지 않아도 된다는 장점이 있다. 이에 본 연구에서는 환자의 동의를 받아서 수술을 위하여 제거하여야 하는 골수 조직을 이용하여 줄기세포를 얻을 수 있었고, 이 줄기세포가 간엽줄기세포임을 FACS을 이용하여 확인할 수 있었다. 본 실험에서 골수 조직 채취가 용이한 10명의 환자에게서 골수를 채취하여 줄기세포를 확립하였는데 모든 환자의 골수에서 줄기세포를 확립할 수 있었고, 이는 나이나 성별의 차이가 없었다.
   인간 유양돌기 골수에서 확립한 간엽줄기세포를 신경세포로 분화시키기 위하여 Matsuoka 등18)과 Deng 등19)이 사용한 분화촉진인자인 bFGF, EGF, forskolin, IBMX를 사용하여 효과적으로 신경세포로 분화를 시킬 수 있었으며, 이렇게 분화된 신경세포는 축삭과 가지돌기를 가지는 신경세포 모양으로 바뀌었고, 면역조직학적 염색과 RT-PCR 검사에서도 신경세포에 특징적으로 나타나는 NFM, NFL, TUJ1, MAP2, NeuN, GFAP에서 양성으로 나와 신경세포로 변화되었음을 알 수 있었다. 또한, 분화된 신경세포의 기능을 알아보기 위해 시행한 전기생리학적 검사에서 테트로도톡신에 의해 차단되는 전형적인 전압의존성 나트륨전류가 기록되어 신경세포로서의 기능을 하고 있음을 알 수 있었고, 이는 인간간엽줄기세포의 기능을 규명하기 위해 시행한 Li 등11)의 실험결과와 일치하였다. 이는 Matsuoka 등18)과 Deng 등19)이 보고한대로 간엽줄기세포가 분화촉진 인자를 통하여 신경세포로 분화될 수 있음을 증명한 것이고, 또한 인간 유양돌기에서 획득한 간엽줄기세포가 기능을 하는 신경세포가 될 수 있음을 증명한 것이라 하겠다. 따라서 쉽게 얻을 수 있는 인간 유양돌기 골수 조직을 잘 활용한다면 줄기세포를 이용한 신경재생의 연구 및 활용에 상당한 도움이 될 수 있으리라 생각된다.

결     론

   인간유양돌기 골수 조직에서 배양한 줄기세포는 FACS를 통하여 조혈줄기세포의 표지자인 CD34, CD45에 음성이고, 간엽줄기세포의 표지자인 CD44와 CD90에 양성인 간엽줄기세포임을 확인하였다. 배양된 인간간엽줄기세포를 이용하여 신경세포로 분화를 유도한 후 시행한 RT-PCR에서 신경세포의 표지자인 TUJ1, NF-L, NF-M에서 양성 소견을 보였고, 면역조직화학 염색에서 TUJ1, MAP2, NeuN, GFAP에 양성인 세포를 확인하여 신경세포로 분화되었음을 증명하였다. 또한, 전기생리학적 검사에서 테트로도톡신에 의해서 차단되는 전압의존성 나트륨전류를 기록할 수 있어서 기능을 하고 있는 신경세포임을 증명하였다.


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