교신저자：박용호, 301-721 대전광역시 대사동 640  충남대학교 의과대학 이비인후과학교실
교신저자：전화：(042) 280-7697 · 전송：(042) 253-4059 · E-mail：parkyh@cnu.ac.kr

서     론

   기존의 연구에서 소음에 의한 내이손상은 주로 유모세포와 신경세포의 손상에 기인하는 것으로 생각되고 대부분 그에 관한 연구가 진행되어 왔다. 하지만 최근에 소음에 의한 와우의 측벽 즉 혈관조와 나선인대의 조직학적인 손상도 보고되고 있으며 이러한 변화들이 내이의 항상성 유지에 관련이 있을 것으로 생각되고 있다.¹⁾ 
   내이의 항상성 유지에는 여러 가지 이온들이 관여하고 있지만 그 중 K⁺은 정상의 청력과 전정기능의 유지에 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. K⁺은 내림프에서 약 150 mM 정도의 주된 양이온으로 소리 등의 자극에 의해 내림프에서 외림프로 이동하며 결국 와우측벽의 혈관조를 통하여 내림프로 재순환하게 된다. 이러한 과정에는 여러 가지 K⁺ 관련 채널들이 작용하여 내림프의 K⁺ 농도와 와우내 전위유지에 결정적인 역할을 하는 것으로 생각된다.²⁾
   최근 여러 종류의 K⁺ 채널이 와우내에 존재하는 것이 밝혀졌는데 특히 와우의 측벽에서 내향 정류 K⁺(inwardly rectifying K⁺, Kir) 채널 5.1은 나선인대와 상혈관조 부위(suprastrial zone)에서 발현되고 내향 정류 K⁺ 채널 4.1(KCNJ 10)은 혈관조에서 주로 발현되어 와우내 전위의 생성에 관여하는 것으로 알려져 있다.³⁾
   본 연구에서는 실험적으로 소음에 의해 유도된 난청의 동물모델에서 일시적 역치변위와 영구적 역치변위를 유발하고 내이의 손상을 확인하며 이에 따른 와우측벽의 KCNJ10 K⁺ 채널의 발현양상을 관찰하고자 하였다. 

재료 및 방법

실험군과 소음의 노출
   청성뇌간반응에서 정상소견을 보이고 정상의 Preyer 반응을 보이는 300~350 g의 수컷 Hartley albino 기니픽 20마리를 사용하였다. 실험군은 각각 소음에 노출하지 않은 정상 대조군(group 1；4마리)과 115 dB SPL, 125 Hz~12 kHz의 광대역 소음에 2시간 노출시킨 군(group 2；8마리) 및 120 dB SPL, 125 Hz~12 kHz의 광대역 소음에 6시간씩 3일 연속 노출시킨 군(group 3；8마리)으로 분류하였다. 방음 처리된 박스형으로 만들어진 100×80×60 cm의 동물우리 속에 실험동물을 넣고 소음원은 Goldwave(ver 5.09, Goldwave Inc.) 프로그램을 이용하여 증폭기와 두 개의 스피커를 연결하여 사용하였다. 

청성뇌간반응의 측정
   모든 실험동물은 xylazine(5 mg/kg)과 ketamine(30 mg/kg)의 혼합액으로 근육마취를 시행하고 방음실에서 ICS사의 MCU-80을 사용하여 청성뇌간반응의 역치변화를 측정하였다. 삽입형 ear tip(3.5 mm, Nicolet Biomedical, Inc.)을 연고를 도포하여 외이도에 위치시키고 전극은 활동전극을 두정부에, 기준전극은 측정할 귀의 후외부에, 접지전극은 반대측 귀의 후외부에 위치하였다. 자극음은 100 μs의 click과 tone burst로 주었으며, 청성뇌간반응의 측정은 파형을 얻기 위하여 1024 tone presentation을 평균하였고 click, 2, 4, 8 kHz에서 역치를 측정하였다. 역치의 근방에서 음의 강도는 5 dB 간격으로 측정하였으며 청성뇌간반응의 역치는 제 5파형이 나타나는 최소의 자극강도로 정의하였다. 대조군과 소음 노출군 모두에서 소음 노출 전에 청성뇌간반응을 측정하여 기준점으로 정하였으며 시간의 변동에 따른 청성뇌간반응의 역치변화를 관찰하기 위하여 소음 노출 직후, 소음 노출 7일 후에 각각 측정하였다.

조직학적 관찰

조직의 준비
   Group 2에서는 2시간 소음 노출 뒤 6시간 후에, group 3에서는 6시간씩 3일간 연속적으로 노출시킨 후에 각각 4마리씩, group 2와 3에서 소음 노출이 끝난 뒤 7일 후에 각각 4마리씩 실험동물을 희생하였다. 실험동물은 ketamine과 xylazine의 혼합액으로 깊게 마취한 뒤 동물의 측두골을 채취하여 해부 현미경하에서 와우의 첨부와 등골을 제거하고 pH 7.4의 2% paraformaldehyde in 0.1 M PBS로 1시간 동안 와우내 고정하였다.
   주사전자현미경적 관찰을 위하여 채취한 와우는 등골을 와우의 난원창으로부터 분리한 뒤 와우의 첨단을 개방하고 2.5% glutaraldehyde(pH 7.2) 고정액으로 관류하고 고정액 내에서 와우의 기저 회전부에서 첨단부까지 골와우각, 혈관조, Reissner막, 개막의 순서로 제거하였다. 
   Phalloidin염색을 하기 위하여 채취한 와우는 해부 현미경하에서 기저 회전부에서 첨단부까지 골와우각, 혈관조, Reissner막, 개막의 순서로 제거하여 와우 첨부로부터 기저부까지 전체의 Corti 기관을 분리하였다.
   면역형광염색을 위하여 분리된 와우는 pH 7.4의 2% paraformaldehyde in 0.1 M PBS로 실온에서 12시간 동안 고정 후 hydrochloric acid(Apex Engineering Products Co, Aurora, IL)를 이용하여 약 30분간 탈회하였으며 파라핀에 포매한 다음 10 μm 두께로 절편을 만들었다.

유모세포와 와우측벽의 변화확인 및 세포와우도
   손상된 유모세포를 확인하기 위하여 분리된 조직은 주사전자현미경적 관찰을 위하여 2.5% glutaraldehyde에, 고정된 조직은 탈수와 금도금 과정을 거쳐 주사전자현미경(S2500, Hitach, Tokyo, Japan)하에서 관찰하였다. 
   와우측벽의 투과전자현미경적 관찰을 위하여 분리 고정된 조직은 0.1 M EDTA in 0.4% glutaraldehyde에 3일간 탈회한 뒤 osrnium으로 후고정하고 탈수의 과정을 거친 뒤 Spurr epoxy resin에 포매하고 70 nm의 두께로 절편하여 uranyl acetate와 lead citrate로 염색한 뒤 투과전자현미경(Tecnai G2 Spirit Twin, FEI company, USA)하에서 관찰하였다.
   유모세포손상의 정량적 관찰을 위해서는 와우 첨부로부터 기저부까지 약 10개의 분절로 분리된 조직은 pH 7.4인 phosphated buffered solution으로 세척하고 0.3% Triton- X로 처리한 뒤 flurorescein isothiocyanate(TRITC)로 표지된 phalloidin(1：50；sigma, St. Louis, MO)으로 30분간 반응시킨 후 다시 PBS로 세척하고 수용성 마운트로 포매하여 형광현미경(BX50W/PH20, Olympus, Tokyo, Japan)하에 관찰하여 얻어진 사진은 컴퓨터 프로그램으로 재 조성하여 약 200 μm 간격으로 관찰하여 섬모가 소실된 양상을 보이는 유모세포의 숫자를 계산하였다.

면역형광염색
   KCNJ10 K⁺ 채널의 발현양상을 보기 위하여 준비된 조직절편은 탈파라핀 후 조직 절편을 citrate buffer(pH 6.0) 용액에 담근 다음 5분씩 2회에 걸쳐 microwave에 넣어 가열하였다. 0.1 M PBS로 세정하고 내인성 peroxidase의 활성을 저지하기 위하여 0.5% periodic acid 용액에 10분간 반응시킨 다음 다시 PBS로 세정하였다. 세정 후 ABC kit(Dako Cytomation, Carpinteria, CA)에 포함되어 있는 blocking serum(normal goat serum)을 1시간 동안 반응시키고 일차항체 rabbit anti-Kir4.1(1：100, Alomone Labs, Ltd, Jerusalem, Israel)로 처리하여 4℃에서 12시간 반응시켰다. PBS로 세정한 후 이차 항체로는 Fluorescein conjugated anti-rabbit IgG(Chemicon International, Inc, Temecula, CA)에 1시간 동안 상온에서 반응시켰으며 다시 PBS로 세척하고 포매하여 형광현미경(BX 50W/PH20, Olympus, Tokyo, Japan)하에 관찰하였다.

통계학적 검정
   통계학적 검정은 SPSS(Version 12.0)을 이용하여 소음 노출군에서 청성뇌간반응의 시간대별 차이는 One way ANOVA를 사용하여 p<0.05로 유의성을 검정하였다.

결     과

청성뇌간반응의 역치변화
   소음 노출 전 실험동물의 기준청력은 유사하였으며 그룹별로 소음 노출 직후와 소음 노출 7일 후에 각각 청성뇌간반응의 역치변화를 측정하였다. 115 dB SPL, 125 Hz~12 kHz의 광대역 소음에 2시간 노출시킨 group 2에서는 소음노출 직후 click, 2, 4와 8 kHz에서 측정한 청성뇌간반응의 역치상승은 각각 18.13±5.30, 17.5±7.07, 19,13±6.51과 38.13±5.30 dB SPL이었으며, 소음 노출 7일 후에 측정한 청성뇌간반응의 역치상승은 각각 1.89±2.59, 7.5±5.35, 4.38±3.20과 4.38±3.20 dB SPL로 소음 노출 직후에 비하여 통계적으로 유의하게 청성뇌간반응 역치의 회복을 보였다(p<0.05)(Fig. 1).
   120 dB SPL, 125 Hz~12 kHz의 광대역 소음에 6시간씩 3일 연속 노출시킨 group 3에서는 소음 노출 직후 click, 2, 4와 8 kHz에서 측정한 청성뇌간반응의 역치상승은 각각 16.88±4.58, 19.38±4.17, 20±6.55와 42.75±10.26 dB SPL이었으며, 소음 노출 7일 후에 측정한 청성뇌간반응의 역치상승은 각각 15.63±4.17, 19.33±3.20, 19.38±4.17과 38.88±5.94로 소음 노출 직후에 비하여 청성뇌간반응 역치의 회복을 보이지 않았다(Fig. 2).

유모세포의 손상확인 및 세포와우도
   유모세포의 손상을 확인하기 위하여 대조군과 소음노출 7일 후에 group 3에서는 phalloidin 염색과 주사전자현미경 검사를 시행하였다. 유모세포의 손상은 주로 와우첨부로부터 12~18 mm에 해당하는 중간회전 이후부터의 부분에서 관찰되었고 주로 외유모세포의 손상과 일부 내유모세포의 손상이 관찰되었으며(Fig. 3), 손상된 세포의 주사전자현미경적 관찰에서도 부동모의 소실을 확연하게 관찰할 수 있었다(Fig. 4).

소음 노출에 따른 와우측벽의 변화
   소음 노출에 따른 와우측벽의 조직학적 변화를 관찰하기 위하여 대조군과 소음 노출군에서 각각 와우 기저부 혈관조 부위의 투과전자현미경 검사를 시행하였다. 대조군에 비하여 Group 2에서는 소음 노출 6시간 후에 관찰한 조직에서는 혈관조의 중간세포들에서 위축과 넓은 세포 사이 간극이 관찰되었으며, group 3에서는 소음 노출 7일 후에 위축된 변연세포와 중간세포의 붕괴가 관찰되었다(Fig. 5).

KCNJ10 K⁺ 채널의 발현
   KCNJ10 K⁺ 채널의 발현은 대조군 중 주로 혈관조에서 발현이 되었으며 소음 노출 후 일시적 청성뇌간반응의 역치상승을 보였던 group 2에서는 소음 노출 6시간 후 그 발현 양상이 대조군에 비하여 증가된 양상을 보였으며 소음 노출 7일 후에는 비교적 대조군과 비슷한 양상을 보였다(Fig. 6). 또한 소음 노출 후 청성뇌간반응의 역치상승이 7일 동안 지속되었던 group 3에서는 반복된 소음 노출 직후 그 발현 양상이 대조군에 비하여 감소된 양상을 보였으며 소음 노출 7일 후의 발현 양상도 대조군에 비하여 감소된 양상을 보였다(Fig. 7). 그 외 일부 나선신경절세포에서 KCNJ10 K⁺ 채널의 발현을 관찰할 수 있었으나 그 발현양상의 변화는 미미하였다.

고     찰

   내이는 고도로 분화된 감각기관으로 와우내에서 외림프에서 내림프로의 K⁺ 순환은 내림프의 K⁺ 농도와 와우내 전위에 미치는 영향은 이미 잘 알려져 있다. 와우내로 전달된 기계적인 신호가 전기적 신호로 변환되기 위해서는 먼저 개막(tectorial membrane)과 유모세포의 첨부에서 shearing force에 의한 부동모의 K⁺ 채널이 열리게 되며 이러한 작용으로 탈분극된 유모세포는 voltage-gated Ca²⁺ 채널을 열게 되어 Ca²⁺의 세포내 유입을 초래하고 유모세포의 기저부에서 신경전달물질을 유출하게 된다. 이와 동시에 유모세포의 기저부에서는 KCNQ4, KCNN2 그리고 KCNMA1 등의 K⁺ 채널이 작용하여 내림프내의 K⁺이 외림프로 이동하게 된다. 이렇게 외림프로 유출된 K⁺은 지지세포 등에 의해서 포획되어 세포 사이사이의 틈간격그물을 통하여 나선인대로 유입된다. 와우의 측벽에서는 나선인대의 제2형과 제4형의 섬유세포에 존재하는 내향전류 K⁺ 채널(inwardly rectifying K⁺ channel, Kir) 5.1에 의하여 유입된 K⁺은 세포 사이의 틈간격을 이동하여 제1형 섬유세포를 통하여 혈관조의 기저세포와 중간세포로 이동된다. 혈관조 내에서는 중간세포에 유입된 K⁺은 Kir 4.1채널(KCNJ10)에 의하여 혈관조 내액으로 확산되며 변연세포의 K⁺-Na⁺ 채널과 Na⁺-K⁺-2Cl^- 채널에 의해 변연세포로 유입되어 KCNQ-KCNE1 채널을 통하여 내림프내로 재순환하게 된다. 이 과정에서 중간세포의 KCNJ10에 의하여 와우내 전압이 생성되는 것으로 이해되고 있다.^2,4,5) 또한 최근의 문헌에서 청각기관의 발달과정에서 KCNJ10 K⁺ 채널의 발현이 청력발달의 시작과 매우 밀접한 관계가 있음이 밝혀졌다. Jin 등⁶⁾에 의하면 내이의 발생과정에서 KCNJ10 K⁺ 채널의 발현은 태생 30일에는 미미하게 발현되다가 태생 45일에 증가하여 태생 50일부터 성인이 될 때까지 유지되었음을 보고하였고 이것은 Raphael 등⁷⁾이 발표한 와우내 전위가 태생 약 62일에 형성된다는 보고와 시기적으로 유사하여 특히 KCNJ10 K⁺ 채널의 발현이 청력의 획득과 중요한 연관이 있음을 보고하였다. 
   소음에 의한 와우 손상은 잘 알려진 유모세포의 손상 이외에도 최근 와우 측벽의 혈관조와 나선인대의 구조변화도 관찰되고 있다. Hirose 등¹⁾의 연구에 의하면 소음에 의한 와우 측벽의 급성변화로는 나선인내의 제2형 섬유세포의 일부 변성과 혈관조의 부종이 발생하며 만성적인 상태에서는 제2형 섬유세포의 대량 소실과 혈관조의 중간 및 변연세포의 변성도 관찰되었음을 보고하여 이러한 변화가 와우내 전압의 변동과 일시적 혹은 영구적 역치변위와 관계가 있지 않을까 생각하였다. 
   본 연구에서는 소음에 의한 와우손상 모델에서 각각 청성뇌간반응의 일시적 역치상승과 영구적 역치상승을 유발하고 와우측벽에서 그에 따른 KCNJ10 K⁺ 채널의 발현 양상을 관찰하고자 하였다. 일시적 역치상승을 일으켰던 group 2에서는 소음 노출 6시간 후 KCNJ10 K⁺ 채널의 발현이 대조군에 비하여 증가된 양상을 보였으며 역치가 회복된 소음 노출 7일 후에는 그 발현 양상이 대조군과 비슷한 양상을 보였다. 또한 영구적 역치상승을 일으켰던 group 3에서는 반복된 소음의 노출 후에 KCNJ10 K⁺ 채널의 발현은 대조군에 비하여 감소된 양상을 보였으며 소음 노출 7일 후에도 그 발현양상은 대조군에 비하여 감소된 양상을 보였다. 이러한 결과는 Hirose 등¹⁾과 본 실험에서 관찰된 와우측벽의 조직학적 변화와도 관계가 있을 것으로 생각되며 일시적 역치상승을 보였던 group 2에서 소음 노출 6시간 후에 KCNJ10 K⁺ 채널의 발현이 증가한 것은 소음에 의한 와우손상에서 와우내 항상성 조절에 관여하는 것으로 생각된다. 또한 반복적인 소음 노출에 의하여 영구적 역치상승을 보였던 group 3에서 소음 노출 직후에 KCNJ10 K⁺ 채널의 발현이 감소한 것은 와우 측벽의 비가역적인 조직학적 손상과 관계가 있을 것으로 생각된다. 따라서 소음 노출 7일 후에도 그 발현양상이 대조군에 비하여 감소되어 있고 K⁺의 재순환 과정에도 일부 영향을 주었을 것이라 생각되었다. 하지만 영구적 역치상승을 보였던 group 3에서는 유모세포의 광범위한 손상이 동반되어 있으므로 와우측벽의 변화만으로 K⁺의 재순환에 영향을 주었다고는 단정할 수 없을 것으로 생각한다.
   와우의 측벽에서 특히 혈관조가 내림프의 이온 항상성에 중요한 것으로 생각되어 왔으나 나선인대에 존재하는 섬유모세포에서 Na/K-ATPase와 Na/K/Cl cotransfer의 존재는 나선인대 또한 이온의 항상성과 와우내 전압에 중요한 역할을 하는 것으로 생각되고 있다.^8,9,10) 일반적으로 와우내 전위는 혈관조에서 생성되는 것으로 알려져 있는데 일시적 역치변위를 일으키는 소음의 노출에 대하여는 와우내 전압은 변동이 없으며,^11,12,13) 또한 영구적 역치변위를 유발하는 소음노출에 대하여도 와우측벽의 조직학적 손상이 광범위하게 발견되더라도 와우내 전압은 일시적으로 변동이 있을 수 있으나 대부분 빠른 시일 내에 회복되었다는 보고가 많다.^14,15) 이러한 결과들은 와우내 전위의 변동이 청력의 소실과는 크게 연관이 없을 것으로 생각되고 동반된 유모세포 등의 손상이 중요한 역할을 하는 것으로 생각한다. 
   따라서 본 연구에서 소음 노출에 따라 와우측벽의 KCNJ10 K⁺ 채널의 변화양상은 청력의 변동보다는 와우내 전압의 유지, 즉 와우내 항상성 유지를 위한 역할을 하는 것으로 생각되며 와우측벽의 조직학적인 변화와 관계가 있을 것으로 생각한다.

결     론

   본 연구에서는 소음 노출에 따른 와우측벽의 KCNJ10 K⁺ 채널의 발현양상을 관찰하고자 하였다. 청성뇌간반응에서 일시적 역치상승을 보였던 group 2에서는 KCNJ10 K⁺ 채널의 발현양상이 소음 노출 후 변동하는 양상을 보였으며 영구적 역치 상승을 보였던 group 3에서는 KCNJ10 K⁺ 채널의 발현이 감소한 이후 변화가 없었다. 이상의 결과는 소음에 의한 와우손상 동물모델에서 K⁺의 재순환 과정은 일부 와우측벽의 조직학적인 변화와도 관계가 있을 것으로 생각되며 또한 이러한 발현양상의 변화가 와우내 전위와 항상성의 유지에 관여할 것으로 생각한다.

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