교신저자：권순영, 425-707 경기도 안산시 단원구 고잔 1동 516  고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
교신저자：전화：(031) 412-5170 · 전송：(031) 401-4365 · E-mail：sutanipa@hanmail.net

서     론

   현재 편평세포암종의 치료방법으로는 수술적 방법과 방사선 치료 및 항암화학요법이 사용되고 있다. 하지만 아직 많은 문제가 남아 있으며 두경부 편평세포암종의 특징인 치료 후의 잔존암, 이차암, 국소전이, 원격전이 등이 생존율을 낮추는 요인이 되고 있다.¹⁾ 이에 기존 치료방법의 개선을 위한 연구 및 이를 보완할 수 있는 방법들이 연구되고 있으며 이 중 cryoablation은 암 치료에 있어서 또 하나의 잠재적 방법으로 알려져 왔다.²⁾ 그것은 cryoablation이 국소적으로 암조직을 파괴할 뿐만 아니라 면역반응의 활성화를 유발시켜 cryoablation 후에도 암세포에 대한 면역치료효과를 나타내기 때문이다.³⁾ 이미 발표된 연구를 보면 구강암, 간암, 전립선암, 신장암, 유방암 환자에서 cryoablation이 임상적으로 효과적이었다는 보고가 있으며, 몇몇 연구에서는 원격전이에서도 효과가 있었다고 하여 cryoablation의 면역치료효과 가능성을 제시하고 있다.^4,5,6,7,8)
   지금까지 알려진 cryoablation에 의한 면역학적 항암효과에는 크게 두 가지 가설이 있다. 하나는 항암항체의 생성이고 다른 하나는 T세포 면역기능의 향상이다. 항암항체 생성 가설에서는 cryoablation으로 파괴된 종양세포가 제거되는 과정에서 포식세포에 의하여 항원이 인식되어 항체가 생성되고, 이렇게 생성된 항암항체는 살아남은 다른 암세포를 공격하여 면역치료효과를 나타낸다는 설명이다. T세포 면역기능이 향상된다는 가설은 cryoablation에 의하여 암세포가 파괴되고 그 과정에서 생성된 여러 인자들에 의하여 암세포의 항원 발현에 변화가 생기고 T세포가 감작되어 면역치료효과를 나타낸다는 설명이다. 이미 알려진 정상 면역체계에서 암세포가 파괴되는 주된 기전인 세포독성 T세포 기전과 동일하며 cyroablation에 의한 종양면역효과의 주된 기전으로 알려져 있다.³⁾
   이런 cryoablation의 면역치료효과는 그 동안 여러 암종을 이용한 연구에서 그 가능성이 밝혀져 왔으나 편평세포암종을 이용한 연구는 상대적으로 적은 편이며 결과에 대한 논란의 여지가 많았다.^3,10,11) 이에 본 연구에서는 편평세포암종에서 cryoablation 후의 면역학적 반응에 대하여 살펴보고 이를 통한 면역치료효과의 가능성에 대하여 알아보고자 했다. 

재료 및 방법

재  료 

실험동물과 편평세포암종 세포주
   실험에 사용된 동물은 암컷 생후 4~6주령의 C3H mouse 30마리로 이들은 구입 후 최소 2주 이상의 검역과 안정과정을 거친 후 사용되었다. 이 과정에서 실험동물은 미국 NIH(National Animal Resources)가 권장하는 지침을 준수하여 본교의 실험동물연구센터에서 무균환경(specific pathogen free)하에서 사육되었으며, 생후 6~8주가 되었을 때 실험에 사용하였다. 
   실험에 사용된 SCCVII(H-2^k) 세포주는 C3H/HeJ mouse의 피부에서 자연 발생한 편평세포암종으로부터 얻어진 세포주로서 삼성서울병원 이비인후과에서 분주 받아 배양하여 사용하였다. 편평세포암종 세포는 RPMI 1640 배양액에 10% fetal bovine serum, 1% L-glutamine, 100 μg/ml penicillin과 streptomycin을 첨가한 뒤, 5% 이산화탄소가 유지되는 37℃ 배양기에서 배양하였다. 배양된 세포주는 trypsin/EDTA를 이용하여 flask 바닥에서 떼어낸 뒤, trypan blue dye 염색을 이용하여 생존해 있는 세포를 계수한 뒤 이후 실험에 사용하였으며 3개월마다 mycoplasma의 감염 여부를 확인하였다. 또한 cryoablation 후의 종양면역효과의 종양특이성을 비교하기 위하여 murine bladder cancer세포인 MBT-2 세포주를 사용하였는데, 배양은 MEN 배양액을 사용하여 위와 같은 방법으로 배양하였다.

편평세포암종의 유발
   실험동물 28마리의 우측 대퇴부 피하에 SCCVII 세포를 1×10⁶개씩 주사한 후 1주간 배양하여 종양을 유발하였으며, 대조 실험군 2마리는 암세포를 주사하지 않고 동일한 환경에서 계속 사육하였다.

방  법

종양의 cryoablation과 외과적 절제
   SCCVII 세포를 접종한 1주 후에 28마리의 실험동물을 관찰하여 발생한 종양의 최대 크기가 3~6 mm인 총 24마리를 선별하였다. 이들을 무작위로 12마리씩 나누어 외과적 절제술군과 cryoablation군에 배정하였고, 또한 각 군을 6마리씩 나누어 각각 SCCVII 세포와 MBT-2 세포의 재접종 대상으로 계획하였다(Table 1). 
   일차 SCCVII 세포 접종 후 종양이 발생한 동물을 ketamine으로 흡입마취시킨 후 마취된 실험동물이 저체온에 빠지지 않도록 heating pad에 놓고 알코올 소독 후 피부를 절개하여 종양을 노출시켰다. 외과적 절제술 군 12마리에서는 육안으로 충분한 안전연을 확인하며 종양의 절제를 시행하였다. 술 후 피부를 봉합하고 회복기 동안 실험동물을 warming lamp하에 두어 체온을 유지하였다. Cryoablation군 12마리는 피부를 절개하여 종양을 노출시킨 후 liquid nitrogen gun-spray(Cryogun^®, Sanarus Medical, Pleasanton, CA, USA)를 이용하여 10초간 cryoablation을 시행한 후 30초간 해동시키고 , 다시 같은 시술을 한 번 더 반복한 후 피부를 봉합하고 체온을 유지하며 회복시켰다. Cryoablation은 liquid nitrogen gun-spray의 freezing nozzle을 종양에서 1~1.5 cm 거리로 유지하며 사용하였으며, 이 과정에서 주변의 정상조직을 보호하기 위하여 종양크기에 맞게 지름 5~8 mm의 구멍이 뚫린 플라스틱판을 사용하였다. 

동일암이나 이종암 세포의 재접종 후 이차암의 발생여부 비교
   실험동물에서 종양의 외과적 절제술과 cryoablation 시행 후 시술 부위가 회복되도록 1주간 기다린 후, 우측 대퇴부의 종양 재발이 없는 12마리를 선별하였으며, 외과적 절제술군이 4마리, cyroablation군이 8마리였다(Table 1). 이차암의 발생 여부를 확인하기 위하여 종양 재발이 없는 12마리를 대상으로 암세포의 재접종을 시도하였다. 이들 중 외과적 절제술군 3마리와 cryoablation군 4마리에서는 좌측 대퇴부에 SCCVII 세포를 주사하였고, 나머지에서는 MBT-2 세포를 주사하였으며, 첫 번째의 SCCVII 세포 투여와 동일한 방법으로 시행하였다. 일주일 후 외과적 절제술이나 cryoablation의 시행여부와 재접종한 종양의 종류에 따라 이차암 발생에 차이가 있는지 비교하였다.

Thymidine 세포독성 시험

비장세포의 활성화(Spleen cell restimulation)
   외과적 절제술 시행군과 cryoablation 시행군 중에서 SCCVII 세포의 재접종 1주 후에도 이차암 발생이 없었던 2마리씩을 선택하여 비장을 채취하였으며, 대조 실험군 2마리에서도 비장을 채취하였다. 채취한 비장은 nylon mesh를 이용하여 single cells를 얻고 0.9% ACK lysis buffer(155 mM NH₄Cl, 9.9 mM KHCO₃, 1 mMl Na₂ EDTA)를 이용하여 RBC를 제거한 후 PBS로 세척하여 비장세포를 얻었다. 비장세포를 60 cm² plate에 3×10⁶cell로 분주하고, 25 U IL-2/ml와 항원 생성을 위하여 얼렸다(-85 ℃) 녹이는(37℃) freezing-thawing을 시행한 SCCVII 세포 5×104/ml를 추가로 첨가하여 4~5일간 배양하였다.

종양세포 표지(Tumor cell labeling)
   SCCVII 세포를 2×10⁶ cell/100 cm² dish culture(media 5 ml)에서 9시간 배양한 후 5 μCi/ml ³H thymidine을 첨가하여 다시 8시간 정도 배양하여 ³H thymidine이 부착된 종양세포를 생성하였다. 

세포독성 측정(Cytotoxicity assay)
   ³H thymidine이 부착된 종양세포를 10⁴ cell/96well 상태로 준비했다. 그리고 작동세포(effector cell)인 활성화된 비장세포와 표적세포(target cell)인 종양세포를 15, 7.5, 3.8, 1.9, 0.9, 0.5, 0.2：1 비율로 계단희석(serial dilution)한 후 6시간 동안 배양하여 작동세포-표적세포 반응을 유발하였다. 세척과정을 거친 후, 검사물을 3회 이상 얼렸다(-85℃) 녹이는(37℃) freezing-thawing을 통하여 세포를 파괴하고 β-counter를 이용하여 ³H thymidine을 측정하였으며, 다음 수식을 사용하여 세포독성 %값을 계산하였다.
   Cytotoxicity(%)=100%×(release in test sample-release in control sample)/(total count-spontaneous release)

통계처리
   종양세포와 비장세포의 계단희석 비율에 따른 세포독성의 비교는 Kruskal-Wallis test를 이용하였으며 유의수준은 5%로 하였다. 

결     과

동일암이나 이종암 세포의 재접종 후 이차암의 발생여부 비교
   SCCVII 세포 접종으로 종양이 발생한 24마리는 배정된 군에 따라 외과적 절제술과 cryoablation을 시행 받았으며, 이후 동측 대퇴부의 종양재발이 없었던 각 군의 3마리와 4마리에서 반대측 대퇴부에 SCCVII 세포를 재접종하였다(Table 1). 이 중 cryoablation군에서는 4마리 모두 이차암이 발생하지 않았고 외과적 절제술군에서는 3마리 중 1마리(33%)에서 이차암이 발생하여 cryoablation 군에서의 이차암 발생이 적었으나 개체수가 적어 통계학적 비교는 무의미하였다(Table 2). 반대측 MBT-2 세포 접종은 외과적 절제술군 1마리와 cryoablation군 4마리에서 시행되었고(Table 1), 이 중 cryoablation군 1마리(25%)에서만 이차암이 발생하였다(Table 2).

Thymidine 세포독성 시험(Thymidine cytotoxicity assay)
   대조실험군, cryoablation군, 외과적 절제술군에서의 세포독성 시험 결과는 Table 3, Fig. 1과 같다. 이 중 cryoablation군의 세포독성은 작동세포와 표적세포의 비율이 각각 1.875：1, 0.469：1, 0.234：1일 때 세 군 중 가장 높게 관찰되었으나, 비율이 7.5：1과 3.75：1에서는 외과적 절제술군이, 0.938：1일 때는 대조실험군이 더 높은 세포독성을 보여 세 군 간의 일관된 차이는 없었으며 통계학적으로 유의하지 않았다. 

고     찰

   치료목적으로 cryoablation의 사용은 1845년 영국의 James Arnot가 유방암, 자궁경부암 등에 사용했다는 기록이 가장 오래된 것이다. 1980년대 말 이후로는 냉동프로브와 영상진단 기술의 발전으로 cryoablation의 사용이 더욱 많아졌으며, 암 치료분야까지 이용이 확대되었다.²⁾ Cryoablation이 암 치료에 사용되면서 원발암의 치료효과 외에 원격전이에도 치료효과가 있으며 이것은 cryoablation의 면역학적인 항암효과에 의한 것이라는 연구들이 발표되어왔다.^4,5,6,7,8) Cryoablation에 의한 면역학적 반응은 종양괴사로부터 시작되는데 이 과정에는 삼투압에 의한 세포의 탈수와 부피의 감소, DNA의 분절, 세포 내 얼음결정에 의한 세포막의 천공 등이 포함된다.¹²⁾ 이후 괴사된 조직이 인체 내에서 포식되는 염증반응이 일어나며 동시에 사이토카인의 분비 증가, 림프구의 증가 및 활성화를 통하여 종양면역반응이 활성화된다고 알려져 있다.^3,11,12) Cryoablation에 의한 종양면역반응에는 항암항체의 생성, T세포 면역기능의 향상, NK세포와 포식세포의 활성화 등이 관여하며, 이 중 T세포 활성화가 가장 중요한 기전으로 알려져 있다.^3,11,12)
   Cryoablation을 이용한 암 치료에서 종양면역효과를 얻을 수 있다면 이것은 다른 수술적 치료방법보다 많은 장점을 가진다. 즉, cryoablation에 의한 1차적인 종양조직의 파괴 외에 종양면역반응에 의한 미세 잔존암의 치료 및 암세포의 전신전이 예방을 기대할 수 있다.¹⁴⁾ 또한 cryoablation을 주된 치료 방법으로는 사용하지 않더라도 보조요법으로 cryoablation을 수술 전에 먼저 시행하는 방법이나 cryoablation과 항암화학요법을 동시에 시행하고 후에 방사선치료를 추가하는 방법으로 이용할 수도 있다.^11,15)
   Cryoablation의 종양면역기능 활성화는 유방암, 구강암, 간암, 전립선암, 신장암 등 다양한 암에서 그 효과가 보고되어 왔으나,^4,5,6,7,8) 다른 여러 문헌들에서는 cryoablation이 종양면역기능을 억제한다는 상이한 연구결과를 보고하고 있다. Hayakawa 등은 동물실험에서 원발암의 cryoablation 시행 후 암세포의 2차접종 시에 종양면역기능이 감소하였음을 보고하였으며, 그들의 다른 연구에서는 원발암의 cryoablation 후 2차암의 성장 및 원격전이가 증가하였다는 cryoablation의 종양면역기능 억제효과를 보고하였다.^15,16) 이 연구결과는 유사한 암종인 섬유육종을 이용한 Neel 등의 결과와는 상반되며, 또한 cryoablation과 외과적 절제술 간에 암의 원격전이 및 암세포 성장에 차이가 없다는 Matsumura의 연구와도 차이가 있다.^17,18)
   현재까지 cryoablation의 종양면역반응에 대해서는 논란의 여지가 남아있으며, 저자들의 연구결과도 편평세포암종을 대상으로 한 다른 연구들과는 상이한 결과를 보인다.^4,19,20) 저자들의 실험결과 SCCVII 세포 재접종 후 이차암의 발생률은 cryoablation군에서는 0%(0/4), 외과적 절제술군에서는 33%(1/3)로 전자에서 적은 경향을 보였으나 개체수가 적어 통계학적 비교는 무의미 하였다(Table 2). 또한 세포독성 시험에서는 대조실험군, cryoablation군, 외과적 절제술군 사이에 의미 있는 일관된 차이가 없었다(Table 3, Fig. 1). 결론적으로 저자들의 편평세포암종 동물실험 모델에서는 cryoablation이 종양면역반응에 영향을 미치지 않는다는 결과를 얻었다. 이것은 Fazio 등과 Airoldi 등이 발표한 초기 구강암 환자에서 cryoablation 후 1주에서 2주 사이에 측정한 세포매개 면역(cell-mediated immunity)이 증가했다는 결과와는 상반된 것이다.^4,19,20) 이런 차이에는 여러 요인이 관여하겠지만 임상실험과 동물실험의 차이 외에 SCCVII 세포의 낮은 항원성도 관여할 것으로 추정할 수 있다.¹³⁾ 즉, 본 실험에서 실험군 간 이차암 발생률에 차이가 없었다는 결과는 SCCVII 세포로 유발된 편평세포암종의 항원성이 상대적으로 낮아서 cryoablation으로 유발되는 종양면역반응이 다른 암종에서처럼 활발하지 않기 때문이라는 추론이다. 또한 cryoablation으로 종양면역기능이 일부 항진되었다고 하여도 재접종으로 발생한 편평세포암종의 tumor burden을 극복하기에는 그 능력이 미약했을 가능성도 있다.¹¹⁾ 그리고 SCCVII 세포로 유발된 편평세포암종의 낮은 분화도와 빠른 성장속도도 cryoablation의 종양면역기능의 항진을 저해하는 요소로 작용할 수 있다.^9,11,13) 결국 이런 여러 요소들이 본 실험에 cryoablation에 의한 이차암 발생 억제의 실패로 이어졌다고 가정할 수 있으며 실제로 본 실험에 사용된 편평세포암종은 낮은 조직학적 분화도와 빠른 성장속도를 암시하는 피부 침범 및 종양괴사를 나타내었다(Figs. 2 and 3).
   세포독성 시험에서의 각 군 간의 비슷한 세포독성 결과도 편평세포암종의 낮은 항원성과 관련이 있을 수 있다. 즉, 암종의 낮은 항원성 때문에 cryoablation에 의한 면역반응 활성화가 미약하다는 가정이다. 또한 종양면역기능이 일부 항진되었다고 하여도 그 정도가 제한적이고 국소적이어서 전신적인 수준으로는 미치지 못했다고 가정할 수 있다.⁹⁾ 이에 따라서 비장세포에서 측정한 세포독성 시험에서 cryoablation의 종양면역효과가 관찰되지 않았다고 추론할 수 있다.
   본 연구가 상대적으로 적은 표본수로 진행되었다는 한계점이 있어, 이를 위해 앞으로 더 많은 연구대상을 필요로 하고 또한 종양 면역 효과에 영향을 미치는 다른 인자의 조사가 필요할 것으로 생각된다. 

결     론

   SCCVII 세포주를 이용한 C3H mouse의 편평세포암종 모델에서 cryoablation과 외과적 절제술은 동일암인 SCCVII 세포 재접종 후 이차암 발생에 차이가 없었으며 이종암인 MBT-2 세포주를 이용한 실험에서도 치료방법에 따른 재발에 차이가 없었다. 또한 cryoablation과 외과적 절제술 각 군에서 시행한 thymidine cytotoxicity assay에서도 의미 있는 차이가 없었다.
   이상의 실험결과 SCCVII 세포주를 이용한 C3H mouse의 편평세포암종 모델에서 cryoablation에 의한 종양면역반응은 외과적 절제술과 비교해 차이가 없으며 면역치료효과의 가능성도 낮다고 판단된다.

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