교신저자：강준명, 420-717 경기 부천시 원미구 소사동 2번지  가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실
교신저자：전화：(032) 340-7051 · 전송：(032)-340-2674 · E-mail：entkjm@catholic.ac.kr

서     론

   선천면역(innate immunity)은 미생물을 인지함으로써 숙주의 방어기전에 중요할 뿐만 아니라 적응면역(adaptive immunity)의 활성화와 조절에도 중요한 역할을 한다. 최근 선천면역 중 Toll-like receptors(TLR)의 역할에 대해 많은 연구가 이루어지고 있으며, TLR은 초기의 염증반응뿐만 아니라 적응면역반응의 조절에도 중요한 역할을 하고 패혈증, 면역결핍, 죽상경화증(atherosclerosis), 천식, 자가면역질환 등 여러 질환과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 현재까지 사람에서 10종류의 TLR이 확인되었으며 TLR의 종류에 따라 다른 면역반응을 일으킨다.¹⁾ 
   현재까지 TLR 4, TLR 9, TLR 2 등이 알레르기와 관련된 것으로 알려져 있는데, TLR 4는 그람음성균의 Lipopolysaccharide(LPS)를 인지하며, TLR 9는 세균과 바이러스의 DNA(unmethylated CpG DNA)를 인지하고, TLR 2는 그람양성균의 lipoprotein, lipoteichoic acid(LTA) 등을 인지하여 반응을 나타낸다.²⁾ LPS에 의한 TLR 4의 자극은 LPS 노출시기와 양에 따라 알레르기 염증반응을 증가시키거나 감소시키며³⁾ TLR 9의 자극은 알레르기 염증반응을 감소시킨다.⁴⁾
   알레르기 염증반응에서의 TLR 2의 역할에 대해 최근 많은 연구가 이루어지고 있으며, 천식모델에서 TLR 2 작용제(agonists)를 감작 후 투여했을 때 알레르기 염증반응이 감소한다는 보고⁵⁾와 함께 항원과 함께 항원보강제(adjuvants)로 주었을 때는 T helper cell type 2(Th2) 면역반응을 증가시킨다는 보고도 있다.⁶⁾ 하지만 아직까지 알레르기 비염 마우스 모델에서 TLR 2의 역할에 대한 연구는 없었으며 투여시기에 따른 알레르기 염증반응의 차이에 대해서는 연구가 부족한 실정이다. 
   본 연구에서 저자들은 Aspergillus fumigatus(Af) 알레르기 비염 마우스 모델에서의 TLR 2의 역할 및 투여시기에 따른 알레르기 염증반응의 차이를 알아보고자 하였다. 

재료 및 방법

실험동물과 항원
   생후 6~8주령의 BALB/c 암컷 마우스를 사용하였으며, 무균환경에서 사육하였고 실험동물실규정을 준수하였다. Af 의 배양 여과액과 균사 추출물의 혼합물(Bayer Pharmaceuticals, Spokane, WA)을 phosphate buffered saline(PBS)으로 2 mg/ml가 되도록 희석하였다. 

알레르기 비염 모델의 제작
   마우스를 4군으로 나누었고 각 군은 6마리로 하였다(Table 1). 감작방법은 알레르기 aspergillosis 마우스 모델 방법⁷⁾을 변형하였으며, Af 항원 100 μg과 1 mg Al(OH)₂(alum；Sigma, St. Louis, MO)을 0.2 ml PBS로 혼합하여 2주에 걸쳐 3차례 복강내 주사하였고, 감작을 위한 마지막 복강내 주사 1주 후부터 3일 동안 연속적으로 Af 항원 50 μg(20 μl)을 비내 점적한 후 다음 날 마우스를 희생시켰다(1군). TLR 2 작용제는 합성 lipopeptide인 PamCys(Pam3Cys-Ser-Lys4, EMC microcollections, Tuebingen, Germany)를 사용하였고 QCL-1,000 Limulus Amebocyte Lysate assay(Bio-Whittaker, Walkersville, MD)로 측정하였을 때 LPS가 측정되지 않았다(<0.1 EU/ml). 2군의 경우에는 PamCys 50 μg을 감작 시작 하루 전에 비강내로 투여하였고, 3군의 경우에는 비강내 Af 항원 투여 하루 전에 비강내로 투여하였다. 대조군(4군)은 1 mg alum을 넣은 0.2 ml PBS를 Af 항원 대신 투여하였다. 비내점적은 Metofane(methoxyfluorane；Pittman-Moore, Mundelein, IL)으로 가볍게 흡입마취한 후 앙와위에서 micropipette를 이용하여 Af 항원을 점적하였다. 

항원 투여 후 유발된 알레르기 증상의 비교
   마지막 비강내 점적 15분 전과 점적 후 15분 동안의 코를 비비는 동작과 재채기 숫자를 기록하여 합산하였고 이를 증상점수로 하였다. 결과는 점적 후의 증상점수를 점적 전 증상점수에 대한 증가율로(%)로 나타내었다. 

비강세척액 분석
   마지막 비강내 점적 24시간 후에 ketamine(40 mg/kg) 과 xylazine(2 mg/kg)의 혼합액을 복강내 주사하여 마취시킨 후 아래턱을 분리하였다. Syringe가 달린 plastic tube 를 후비공에 넣은 후 손으로 눌러 후비공을 막고 양쪽 비강을 PBS 1 ml로 세척하였다. 수집된 비강세척액을 원심분리(1,500 rpm, 10분)한 후 상청액 0.5 ml를 Th2 사이토카인인 interleukin(IL)-5와 Th1 사이토카인인 interferon(IFN)-γ 정량분석에 사용하기 위해 -80℃에 보관하였다. IL-5와 IFN-γ 정량분석은 마우스 ELISA Set(Pharmingen, San Diego, CA)을 이용하여 측정하였다. 수집된 세척액의 세포 침전물을 PBS 1 ml로 재부유시킨 후 hemocytometer를 이용하여 총 백혈구수를 측정하였다. 이후 cytospin(Shandon Scientific Ltd., Cheshire, UK)을 이용하여 슬라이드에 1.5×10⁵ cells/ml이 되도록 한 후 Diff- Quick 염색(Dade Behring, Newark, DE)을 시행하였다. 상피세포를 제외한 200개의 세포를 세어 호산구 백분율을 계산하였다. 

Af 특이 항체의 측정
   비강세척을 한 후 흉곽을 절개하고 좌심실을 천자하여 혈액 1~2 ml를 채취하고 원심분리를 통해 혈청을 얻었다. Th2 면역반응과 관계된 Af 특이 IgE, IgG1 항체와 Th1 면역반응과 관계된 Af 특이 IgG2a 항체를 ELISA 방법을 사용하여 측정하였고 Af 특이 IgE 항체는 다음과 같은 방법으로 측정하였다. 96 well ELISA plate(Corning Inc., Corning, NY)에 carbonate 버퍼용액(pH 9.6)으로 녹인 5 μg/ml rat anti-mouse IgE 단일 항체(Biosource, Camarillo, CA)를 4℃에서 하룻밤 동안 유치(incubation)시킨 후 PBS-Tween 20 버퍼용액(Sigma)으로 4번 씻어낸 다음 10% fetal calf serum(Gibco, Grand Island, NY)으로 2시간 동안 blocking시켰다. 2배씩 희석된 각각의 혈청(시작 1：2)을 각 well에 넣은 다음 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰고 3번 씻어냈다. Biotinylation을 위해 Af(2 mg/ml)를 biotin(long arm) N-hydroxy succinimide ester(Vector, Burlingame, CA)와 실온에서 2시간 동안 반응시킨 후 PBS/0.05%/sodium azide로 하룻밤 동안 투석하였다. Biotinylated Af 0.1 μg을 각 well에 넣고 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후, Streptavidin-horseradish peroxidase(HRP) conjugate(1/1,000 dilution in PBS/10% FCS；Sigma)로 1시간 동안 추가반응시켰다. Plate를 3번 씻어낸 후 tetramethyl-benzidine(TMB) 용액(Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, MD)을 첨가한 후 10분 후에 microplate reader(Bio-Rad, Hercules, CA)를 이용하여 OD 450 nm에서 결과를 판독하였다. 결과는 standard curve를 이용해 Unit/ml로 표시하였다. Standard curve는 Af를 이용한 알레르기 모델에서 얻은 serum pool을 이용해서 만들었으며, Aspergillus Ag coupled Affigel-beads(Bio-Rad)를 이용해 Aspergillus 특이 혈청을 얻었고 이것을 이용해 standard curve를 구하였다. Serum pool의 농도를 임의로 1,000 Unit/ml로 정하였고, 이것을 기준으로 상대적인 농도를 구하였다. Af 특이 IgG1와 IgG2a 항체의 측정은 각 well을 5μg/ml Af 항원으로 4℃에서 하룻밤 동안 먼저 coating시킨 후 PBS- Tween 20 버퍼용액으로 씻어낸 다음 10% fetal calf serum으로 2시간 동안 blocking시켰다. 2배씩 희석된 각각의 혈청(시작 1：100)을 각 well에 넣은 다음 2시간 동안 반응시키고, biotinylated goat anti-mouse IgG1와 goat anti-mouse IgG2a(1：4000；Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IL)으로 1시간 동안 추가 반응시켰다. Streptavidin-HRP로 1시간 반응시킨 후 TMB 용액을 첨가하여 10분 후에 microplate reader로 값을 구하였다. 

비장세포 배양 및 사이토카인 측정
   마우스를 희생시키기 전에 비장을 적출하였고 100 μm cell strainer(BD Falcon, Bedford, MA)을 이용하여 single cell suspension을 얻었다. 비장세포를 5×10⁶ cells/ml 농도로 10% heat-inactivated fetal calf serum, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 2 mmol/L glutamine, 25 mmol/L HEPES를 첨가한 RPMI-1640 배지에 37℃, 5% CO₂ 조건으로 배양하였다. Af 항원(100 μg/ml)으로 자극한 후 72시간 후에 배양 상청액를 얻어 IL-4, IL-5, IL-10, IFN-γ를 ELISA sets(BD Pharmingen)를 이용하여 측정하였다. 

조직학적 검사
   비강 세척과 혈액채취가 끝난 후에 마우스를 희생시켜 머리를 분리하고 두부로부터 피부와 근육 등을 제거한 후 4% paraformaldehyde에 24시간 동안 고정하였다. 탈석회액(Decalcifier II, Surgipath, Richmond, IL)에 48시간 동안 담근 후 비강조직을 파라핀에 넣고 5 μm의 두께의 관상면으로 잘랐다. Hematoxyline-Eosin 염색을 시행하였고 호산구수 측정을 위해 Luna 염색을 하였다. 호산구수 측정은 400배 광학 현미경하에서 상악동이 가장 크게 보이는 위치의 비중격점막 5곳의 호산구수를 측정하여 각 실험군의 평균치를 비교하였다.

통계처리방법
   본 연구에서 얻은 측정치는 각 군을 비교하기 위하여 SPSS version 10 프로그램(SPSS INC., Chicago, IL)의 Wilcoxon rank sum test를 이용하였고, p<0.05를 통계적으로 의미있다고 하였다. 

결     과

항원 투여 후 유발된 알레르기 증상에 대한 TLR 2 작용제의 효과
   PamCys를 투여하지 않은 군(1군, 274±87%)은 음성대조군(4군, 32±15%)에 비해 알레르기 증상이 유의하게 증가하였다. PamCys를 투여한 두 군(2군：93±35%, 3군；120±51%) 모두에서 1군에 비해 알레르기 증상이 유의하게 감소하였다(Fig. 1).

비강세척액의 사이토카인에 대한 TLR 2 작용제의 효과
   마지막 비강내 점적 24시간 후에 수집된 비강세척액에서 PamCys를 투여하지 않은 군(1군, 35±7 ng/ml)은 대조군(4군)에 비해 IL-5가 유의하게 증가하였다. 비강세척액의 IL-5는 PamCys를 투여한 두 군(2군；9±4 ng/ml, 3 군；11±5 ng/ml) 모두에서 1군에 비해 유의하게 감소하였고, IFN-γ는 PamCys를 투여한 두 군(2군；404±48 pg/ml, 3군；457±39 pg/ml) 모두에서 1군에 비해 유의하게 증가하였다. IL-5와 IFN-γ의 농도가 PamCys를 투여한 두 군 간에는 유의한 차이를 보이지 않았다(Fig. 2).

비강 및 조직내 호산구 침윤에 대한 TLR 2 작용제의 효과 
   1군의 비강세척액내 호산구수 비율은 62±7% 였으며 PamCys를 투여한 두 군(2군；19±4%, 3군；16±3%) 모두에서 호산구수 비율이 유의하게 감소하였다. 조직내 호산구수도 1군(35±6 cells/field)에 비해 PamCys를 투여한 두 군(2군；16±4 cells/field, 3군；12±5 cells/field) 모두 유의하게 감소하였다. 비강세척액 및 조직내 호산구수는 PamCys를 3군이 2군보다 더 감소하는 경향을 보였으나 통계적으로 유의하지 않았다(Figs. 3 and 4).

혈청 Af 특이 항체에 대한 TLR 2 작용제의 효과
   1군의 혈청 Af 특이 IgE 농도는 650±85 U/ml 였고 PamCys를 투여한 두 군(2군；270±59 U/ml, 3군；360±60 U/ml) 모두 유의하게 감소하였다. Af 특이 IgG1 농도는 PamCys를 투여한 군과 1군 간에 유의한 차이를 보이지 않았고, Af 특이 IgG2a 농도는 2군(301±48 U/ml)이 1군(71±34 U/ml)에 비해 유의한 증가를 보였으나 3군(105±29 U/ml)은 유의한 차이를 보이지 않았다(Fig. 5).

비장세포의 사이토카인에 대한 TLR 2 작용제의 효과
   1군의 IL-4(1500±310 pg/ml)와 IL-5(2,200±550 pg/ml)는 대조군(4군)에 비해 유의하게 증가하였고 2군(IL-4；307±80 pg/ml, IL-5；320±62 pg/ml)과 3군(IL-4；511±145 pg/ml, IL-5；500±74 pg/ml) 모두에서 1군에 비해 유의하게 감소하였다. IFN-γ와 IL-10은 2군(IFN-γ；1,750±205 pg/ml, IL-10；272±45 pg/ml)과 3군(IFN-γ；1,420±179 pg/ml, IL-10；307±55 pg/ml) 모두에서 1군(IFN-γ；605±81 pg/ml, IL-10；89±27 pg/ml)에 비해 유의하게 증가하였다(Fig. 6).

고     찰

   알레르기 염증반응은 IL-4, IL-5, IL-9, IL-13 등을분비하는 Th2 세포에 의해 유도되며 조절된다. 항원미제시 T 세포가 항원에 대한 반응으로 증식과 분화를 하고 기능을 나타내기 위해서는 항원제시세포에 의해 자극되어야 하며, 항원제시세포 중 수지상세포가 주된 역할을 한다. TLR은 항원제시과정에서 수지상세포의 성숙을 유도하고 T 세포의 분화를 조절하며, 활성 T 세포, NK 세포, regulatory T 세포, 비만세포, 호산구 등 다양한 세포의 기능을 조절한다.^1,2) 현재까지 알려진 TLR 2 작용제는 lipopeptide, peptidoglycan, yeast 세포벽 성분인 zymosan 등이 있으며 동형이합체(homodimer)를 형성하는 TLR 4와는 달리 TLR 2는 TLR 1 또는 TLR 6와 이형이합체(heterodimer) 를 형성한다.²⁾
   TLR 2의 발현이 알레르기 발병률이 적은 농장의 소아들에게 증가되어 있고⁸⁾ 농장의 소아들 중 TLR 2의 유전적 변이가 알레르기 발병의 주된 인자라는 연구결과⁹⁾는 알레르기와 TLR 2의 연관성을 시사하지만 아직까지 알레르기 염증반응에서의 역할에 대해서는 좀 더 많은 연구가 필요하다. 난알부민을 이용한 천식모델에서, TLR 2 작용제인 합성 lipopeptide LP40을 비강내 항원투여 전에 감작된 마우스의 복강내로 주었을 때 폐 호산구 염증과 Th2 사이토카인이 감소하였으며,⁵⁾ Pam3Cys와 peptidoglycan을 기관내로 투여했을 때에도 투여시기와 관계없이 알레르기 염증이 감소하였다.¹⁰⁾ 그러나 TLR 2 작용제를 난알부민과 함께 항원보강제로 투여하여 감작시켰을 때는 폐 호산구 염증과 Th2 사이토카인이 증가되어, TLR 2는 면역반응 유도기에 Th2 세포로의 분화에도 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.^6,11)
   사람과 마우스의 수지상세포 및 T 세포에 대한 연구에서, 수지상세포에 대한 TLR 2의 자극은 TLR 4에 비해 Th1 세포분화에 중요한 IL-12는 적고 IL-10은 많은 양을 분비시키며,¹²⁾ 항원에 감작된 말초혈액단핵세포에 항원과 TLR 2 작용제를 투여했을 때 IL-10, IFN-γ, IL-12가 증가하고 제대혈 T 세포에서는 IL-10과 IFN-γ를 분비하는 T세포를 증가시켰다.⁵⁾ 이렇게 TLR 2에 의해 증가된 IL-10의 역할에 대해서는 아직까지 명확히 밝혀지지 않았으며, 면역억제 기능을 갖는 regulatory T세포로의 분화유도를 통해 IFN-γ와 무관하게 알레르기 염증반응을 억제한다는 주장^13,14)과 함께 사람과 달리 마우스의 수지상세포에서는 Th2 세포로의 분화유도를 통해 Th2 반응을 증가시킨다는 보고도 있다.¹⁵⁾ 이러한 차이는 IL-10이 감작과 같은 알레르기 반응의 유도시기와 감작 후 알레르기 염증이 있는 상태에서의 효과가 다르게 나타날 수 있음을 의미하며,¹⁵⁾ 이러한 IL-10의 역할이 투여시기 및 연구방법에 따라 TLR 2 작용제의 효과가 다르게 나타나는 것을 부분적으로 설명할 수 있다. 
   TLR 2 작용제는 감작된 마우스의 기도내 항원투여 전 뿐만 아니라 조직내의 알레르기 염증 반응이 형성된 경우에도 Th2 면역반응을 억제시키는 것으로 알려져 있지만,^10,16) 억제기전에 대해서는 아직 명확히 밝혀져 있지 않다.
   가능성 있는 기전으로는 우선 IL-12 증가를 통해 Th1 면역반응을 유도함으로써 Th2 반응을 억제한다는 것으로,¹⁶⁾ 일반적으로 palmitoyl 구조를 가지고 있는 lipopeptide는 피하로 주었을 때보다 점막으로 투여했을 때 Th1 면역반응을 유도하고¹⁷⁾ 본 연구에서 사용한 PamCys의 palmitoyl-lysine 구조가 TLR 2를 통해 Th1 면역반응을 유도하는 것으로 알려져 있다.¹⁸⁾ 하지만 정제된 lipopeptide는 강한 Th1 면역반응을 유도하지 않고 T세포의 IFN-γ의 분비를 오히려 감소시킨다는 보고도 있다.¹⁹⁾ 이외에도 IL-10과 관계된 regulatory T세포에 의한 억제¹³⁾와 아직 밝혀지지 않은 기전으로 Th2 세포로의 분화를 억제한다는 보고도 있다.²⁰⁾ Af 항원에 의한 알레르기 비염 마우스 모델을 사용한 본 연구에서, 난알부민을 사용한 천식모델에서의 결과와 유사하게 PamCys는 투여시기와 관계없이 알레르기 증상, 조직내 호산구 염증반응, Af 특이 IgE 농도를 감소시켰다. 또한 비강세척액의 IFN-γ 농도 증가와 혈청 Af 특이 IgG2a 농도 증가는 PamCys가 Th1 면역반응을 유도하였음을 의미한다. Th2 면역반응과 관계된 IgG1은 Aspergillus 천식모델에서의 CpG oligodeoxynucleotides(ODN) 투여에 의한 IgG1 반응과 유사하게 유의한 차이를 보이지 않았고 이것은 IgE와 IgG1 항체형성은 서로 다른 기전이 관여한다고 생각할 수 있다.⁷⁾
   본 연구에서 사용된 알레르기 비염 마우스 모델의 비장세포에서 TLR 2 작용제는 Af 항원자극에 대한 IL-4와 IL-5의 분비를 감소시켰고 IL-10는 증가시켰다. 이것은 TLR 2 작용제가 알레르기 반응을 억제하는데 있어 Th1 면역반응의 증가뿐만 아니라 IL-10의 증가에 의한 가능성을 시사하며 TLR 2 작용기전에 대한 추가적인 연구가 필요하리라 생각된다. 

결     론

   Af 알레르기 비염 마우스 모델에서 TLR 2 작용제인 PamCys는 투여시기와 관계없이 비강세척액의 IL-5 농도를 감소시키고, 조직내 호산구 침윤을 감소시켰으며 혈청내 Af 특이 IgE 농도를 감소시켰다. 이러한 TLR 2 작용제의 알레르기 염증반응 억제기전은 비강세척액의 IFN-γ 증가와 혈청내 Af 특이 IgG2a 농도 증가소견으로 보아 Th1 면역반응 증가에 의한 것으로 생각되지만 정확한 기전에 대해서는 추가적인 연구가 필요하리라 생각된다.

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