교신저자：노영수, 134-701 서울 강동구 길동 445  한림대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
교신저자：전화：(02) 2224-2279 · 전송：(02) 482-2279 · E-mail：ys20805@chol.com

서     론

   구강 및 구인두암의 90% 이상은 편평상피세포암종으로 세포의 이질성이 많아 진행 양상이 다양하며 예측이 어렵고 발생 부위별로 다양한 생물학적 특성과 전파 경로를 가지기 때문에 조기 진단과 치료의 발달에도 불구하고 5년 생존율은 아직 낮은 상태이다.¹⁾ 이에 따라 구강 및 구인두암의 전이, 재발 등을 예측하고 치료에 적극적으로 도움을 주기 위하여 암의 발생과 진행에 관여하는 여러 인자의 변화를 치료 방침 결정에 이용하려는 노력이 꾸준하게 시도되어 왔다. 이러한 연구의 일환으로 최근에는 세포 성장과 분화에 중요한 역할을 할 것으로 판단되는 간세포 성장 인자(Hepatocyte Growth Factor：HGF)와 그 tyrosine ki-nase 수용체인 c-met 유전자의 발현에 대해 새롭게 기능이 규명되고 있다. c-met 발암 유전자 산물인 c-Met 단백은 암세포의 이동에 관여하는 운동 인자 중 하나이며 tyrosine kinase 활성능을 가진 고친화성 수용체로서 염색체 7q21.1에 위치한 HGF에 의해 활성화된다. 이러한 기전으로 세포 내 신호전달 체계를 연속적으로 활성화시켜 HGF/c-Met pathway를 형성하여 종양 발생 시 이 두 유전자에서의 단백 과발현이 일어난다는 보고들이 있다.^2,3,4,5) 이에 본 연구에서는 40예의 구강 및 구인두 편평상피암종과 10예의 이형성병변을 대상으로 하여 HGF/c-Met pathway에 관련된 단백 및 mRNA 발현을 각각 면역 조직 화학 검사법과 RT-PCR 기법으로 분석하여 임상적 및 조직 병리학적 예후인자와 비교하고자 하였다.

대상 및 방법

대  상 
   1998년 1월부터 2002년까지 구강 및 구인두 편평세포암종으로 확진되어 수술을 시행받은 예 중 수술 시 신선 조직을 얻을 수 있었고 환자의 임상 추적 기록이 잘 정리되어 있으면서 파라핀 블록의 상태가 양호한 40예를 연구 대상으로 하였다. 각각의 예에서 신선 조직과 파라핀 블록 중 종양 세포의 분포가 50% 이상이 되는 부위를 선정하여 신선 조직은 mRNA 검출을 위한 역전사 중합 효소 연쇄 반응에 이용하였으며 파라핀 블록은 면역 조직 화학적 검사에 이용하였다. 또한 연구 대상 40예 중 이형성 병변이 뚜렷하게 존재하는 10예를 비교군으로 하였으며 연구 대상 각각에서의 정상 구강 점막 조직과 정상 림프절 조직을 정상 대조군으로 하였다. 

방  법

면역 조직 화학적 검사 
   10% 중성 포르말린 고정과 파라핀 포매를 거친 조직을 5~6μm 두께로 연속 절편을 만들어 100% xylene으로 3~5분간 탈파라핀하고, 증류수로 함수시킨 후 HGF(goat polyclonal antibody, Sigma Co, St. Louis, MO), c-Met(rabbit polyclonal antibody, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)에 대하여 면역 조직 화학적 염색을 시행하였다. 단백의 항원성을 유지하기 위해 pressure cooker를 이용하고 끓는 phosphate buffered saline(이하 PBS)에 5분간 처리하였다. 4℃의 PBS에 다시 5분간 처리한 후, 내인성 peroxidase의 활성을 억제하기 위해 3%의 과산화수소를 도포하였고 1：100으로 희석된 1차 항체를 상온에서 2시간 반응시킨 후 PBS로 세척하였다. 2차 항체인 biotinylated link antibody(LSAB kit, DAKO, USA)와 20분간 반응시킨 후 PBS로 세척하였다. Streptavidin(Zymed Co, San Francisco, USA)과 peroxidase가 결합된 용액에 30분간 반응시키고, 이후 발색 반응은 3, 3-diaminobenzidine tetrachloride(DAB)(Sigma Co, St. Louis, MO)로 발색시킨 다음 Meyer's hematoxylin으로 대조 염색 후 흐르는 물에 세척하여 실온에 건조시킨 후 봉입하고 광학현미경으로 관찰하였다. 

역전사 중합 효소 연쇄 반응 

Total RNA 추출 
   구강 및 구인두 편평세포암종 신선 조직을 수술 중 채취하여 액체 질소에 담근 후 영하 80℃에서 동결하였다가 TRIZOL 방식으로 RNA를 추출하였다. 냉동된 조직을 PBS로 수세 후 0.5 cm³ 크기로 절단한 조직편 약 50~100 mg을 액체 질소하에서 Polytron homogenizer(Brinkmann, Westbury, NY, USA)로 분쇄한 후 TRIZOL reagent(GIBCO BRL, Grand Island, NY, USA) 1 ml를 넣고 혼합하여 상온에서 5분간 방치하였다. 0.2 ml의 chloroform을 넣은 후 15초간 세게 흔들고 10분간 상온에 두었다가 4℃에서 12,000 rpm으로 15분간 원심 분리하고, 수용성 상층액을 피펫으로 새 시험관에 조심스럽게 옮긴 후 0.5 ml의 isopropanol을 넣고 vortexing하여 상온에 10분간 보관했다가 12,000 rpm으로 원심분리하여 RNA를 침전시켰다. 상층액을 버리고 75% ethanol 1 ml를 넣고 섞은 후 원심분리하여 RNA pellet을 세정하고, 상층액을 다시 제거한 후 상온에서 RNA pellet을 건조시킨 후 diethyl pyrocarbonate로 처리된 증류수에 녹여서, 분광 광도계(150~20, Hitachi Co., Tokyo, Japan)로 260 nm의 분광 광도에서 농도를 측정하고 영하 80℃에 보관하였다. 

RT-PCR 수행 
   정제된 total RNA를 poly-dT primer와 annealing 시킨 후 AMV reverse transcriptase(USB)를 사용하여 first strand cDNA를 만들었다. 이 cDNA를 가지고 HGF, c-Met mRNA 검출을 위한 각각의 해당 시발체(primer)를 사용하여 중합 효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction：PCR)을 수행하였으며, 시발체는 GIBCO사(USA)에 주문 제작하였다(Table 1). PCR 반응은 thermal cycler (Perkin Elmer Cetus 9700, Foster City, CA)를 사용하였고 제작 회사에서 제안한 방법으로 수행하였다. 이 때 PCR 용액의 구성은 3 μl template(cDNA 용액)에 1 μl의 primer-5', primer-3'(2 mM), 1 μl의 dNTP 혼합액(2 mM), 1 μl 의 10× buffer(20 mM MgCl2, Takara), 1 μl의 Taq polymerase(Takara, 5 U/μl)를 넣어 증류수를 가하여 20 μl의 용액을 만들었다. PCR 조건은 기본적으로 변성 전단계는 94℃ 5분, 변성 반응은 94℃ 1분, 결합 반응은 58℃ 1분, 연장 반응은 72℃ 90초로 30주기 시행한 후 최종 연장 후 반응은 72℃ 10분으로 하였다. β-actin의 경우, 결합 반응은 59℃ 1분으로 하여 시작하였다. 이때 β-actin에 대한 실험을 먼저 시행하여 그 결과에 따라 cDNA template의 양을 조정하였고 다시 PCR을 시행하여 β-actin의 PCR 산물의 양이 일정하게 된 것을 확인하였으며, 그 이후의 PCR은 조정된 양의 cDNA template을 사용하여 얻은 각각의 primer로 PCR을 수행하여 각각의 PCR 산물의 양을 1.5% agarose gel에서 전기영동하여 예상된 크기의 분자에 해당하는 띠(band)에서 분석하고 확인하였다. 

결과 판정과 통계 처리 

면역 조직 화학적 염색의 판정 
   HGF, c-Met 단백 면역 조직 화학적 염색 반응의 판정은 염색된 세포의 밀도가 높은 부분을 광학현미경으로 400배 시야에서 10개를 관찰하였다. 단백 발현의 강도는 종양 세포에서 전혀 염색이 되지 않은 경우를(-), 매우 미약하게 세포질 염색이 된 경우(+), 약하게 일부 세포의 세포질과 세포막에 염색이 된 경우(++), 50% 이상의 세포들에서 진하게 염색된 경우(+++)로 구분하였다. 이 중(++) 강도 이상의 발현 증례를 양성으로 판정하였다. 

역전사 중합 효소 연쇄 반응 결과의 판정 
   정상 림프절 조직을 대조군으로 강도 1로 정했을 때 정상 조직 20예의 HGF 및 c-Met mRNA 발현 강도의 각각 평균은 0.82(±0.25), 0.87(±0.38)이었다. 암종에서의 mRNA 과발현을 평가하기 위한 기준치는 평균치에 표준 편차의 2배치를 합한 값으로 정했으며 이 기준에 따라 HGF mRNA는 1.32, c-Met mRNA는 1.63이 산출되었다. 

통계학적 분석 
   모든 자료 처리와 분석은 SPSS version 10.0 for windows 프로그램을 이용하였으며 임상적 예후 인자와 조직병리학적 소견의 비교 및 환자의 검체당 HGF, c-Met의 단백발현, mRNA 검출 결과의 비교는 Pearson의 Chi-square 검정과 Fisher의 정확 확률 검정으로 분석하였다. 유의 수준은 p값이 0.05 이하인 경우를 통계학적으로 유의한 것으로 판정하였다. 

결     과 

임상 및 병리학적 소견 
   성별은 남자가 30예, 여자가 10예였다. 종양의 조직학적 소견상 종양의 분화도에 따른 분류에서는 고분화군이 16예, 중등도 분화군이 16예, 저분화군이 8예였다. 종양의 국소병기(T stage)별로 분류하면 T1이 13예, T2가 19예, T3가 8예로 T1과 T2가 32예, T3 이상이 8예였다. 경부 림프절 전이 유무를 기준으로 한 분류에서는 전이성 암종은 19예, 비전이성 암종은 21예였으며 종양의 조직병리학적 병기(TNM stage)별로는 I기가 11예, II기가 10예, III기가 13예, IV기가 6예로 I, II기의 조기암이 21예, III, IV기의 진행암이 19예였다. 

면역 조직 화학적 검사에 의한 HGF, c-Met 단백의 발현 

HGF, c-Met 단백의 발현 양상 
   면역 조직 화학적 염색으로 검출된 HGF 및 c-Met 단백 발현은 암종에서 각각 55%, 62.5%가 양성으로 검출되었고, 이형성 병변과 정상 점막 조직에서는 모두 음성으로 통계학적인 유의성이 있었다(Table 2)(p=0.001, p=0.001).

HGF, c-Met 단백 발현과 임상 병리학적 특성과의 상관관계(Table 3 and 4) 
   종양의 분화도에 따른 HGF, c-Met 단백 발현의 양성은 고분화성 암종에서 각각 7예(43.8%), 10예(62.5%)이었고, 중등도 분화성 암종에서는 각각 8예(50.0%), 10예(62.5%)이었고, 저분화성 암종에서 각각 7예(87.5%), 5예(62.5%)로서 통계적 유의성은 없었다(p=0.076, p=0.084). 종양의 국소병기(T stage)에 따른 HGF 단백 발현의 양성은 T1의 경우 6예(46.2%), T2는 11예(57.9%), T3는 5예(62.5%)로 T1, T2 암종과 T3 이상 암종 사이에 유의한 차이가 없었다(p=0.082). C-Met 단백 발현의 양성 또한 T1의 경우 6예(46.2%), T2는 13예(68.4%), T3는 6예(75.0%)로 T1, T2 암종과 T3 이상 암종 사이에 차이가 없었다(p=0.062). 종양의 림프절 전이에 따른 HGF 단백 발현을 보면 전이성 암종에서 11예(57.9%), 비전이성 암종에서 11예(52.4%)에서 양성으로 발현되어 차이가 없었다(p=0.162). c-Met 단백도 전이성 암종에서 14예(73.7%), 비전이성 암종에서 11예(52.4%)에서 양성으로 발현되어 의미 있는 차이는 없었다(p=0.087). 종양의 조직병리학적 병기(TNM stage)에 따른 HGF 단백 발현은 I기는 5예(45.5%), II기는 6예(60.0%), III기는 7예(53.8%), IV기는 4예(66.7%)에서 양성으로, c-Met 단백 발현은 I기는 4예(36.4%), II기는 7예(70.0%), III기는 9예(69.2%), IV기는 5예(83.3%)에서 양성으로 HGF와 c-Met 단백 발현 모두 초기암(I, II기)과 진행암(III, IV기) 사이에 유의한 차이는 발견되지 않았다(p=0.076, p=0.089). 

역전사 중합 효소 연쇄 반응에 의한 HGF, c-Met mRNA의 발현 

HGF, c-Met mRNA의 발현 양상 
   HGF 및 c-Met mRNA는 모든 정상 점막 조직과 암종에서 발현되었으며 정상 조직에서의 발현 강도는 매우 희미하였다(Figs. 1 and 2). 40예의 종양 중 HGF, c-Met mRNA 과발현은 암종에서 각각 67.5%, 57.5%가 검출되었고, 10예의 이형성 병변에서는 각각 10%, 20%에서 검출되어 암종에서 이형성 병변에 비해 의미있게 높은 검출률을 보였다(Table 2)(p=0.001, p=0.003). 

HGF, c-Met mRNA의 발현과 임상병리학적 특성과의 상관관계(Table 3 and 4) 
   종양의 분화도에 따른 HGF, c-Met mRNA의 과발현은 고분화성 암종에서 각각 10예(62.5%), 10예(62.5%)이었고, 중등도 분화성 암종에서는 각각 12예(75.0%), 8예(50.0%)였고, 저분화성 암종에서 각각 5예(62.5%), 5예(62.5%)로 HGF, c-Met mRNA 모두 종양의 분화에 따른 통계적인 차이는 없었다(p=0.096, p=0.087). 종양의 국소병기에 따른 HGF mRNA 과발현을 보면 T1의 경우 6예(46.2%), T2는 13예(68.4%), T3는 8예(100%)로서 T3 이상의 암종은 T1, T2 암종에 비해 유의성 있는 과발현을 보였다(p=0.035). c-Met mRNA 과발현을 보면 T1의 경우 4예(30.8%), T2는 13예(68.4%), T3는 6예(75.0%)로서 T3 이상의 암종과 T1, T2 암종 사이에 유의한 차이가 있었다(p=0.048). 종양의 림프절 전이에 따른 HGF mRNA 과발현을 보면 전이성 암종에서 16예(84.2%), 비전이성 암종에서 11예(52.4%)에서 검출되어 유의성 있는 발현 차이가 있었다(p=0.044). c-Met mRNA 과발현을 보면 전이성 암종에서 14예(73.7%), 비전이성 암종에서 9예(42.9%)에서 검출되어 전이성 암종에서 높은 c-Met mRNA 과발현율을 보였고 통계학적인 유의성이 있었다(p=0.040). 종양의 병기에 따른 HGF mRNA 과발현은 I기는 5예(45.5%), II기는 6예(60.0%), III기는 11예(84.6%), IV기는 5예(83.3%)로서 조기암(I, II기)과 진행암(III, IV기) 사이에서는 유의성 있는 발현 차이가 있었다(p=0.041). c-Met mRNA 과발현은 I기는 3예(27.3%), II기는 6예(60.0%), III기는 9예(69.2%), IV기는 5예(83.3%)로서 조기암(I, II기)와 진행암(III, IV기) 사이에 유의한 발현 차이를 보였다(p=0.047). 

고     찰

   암세포의 이동에 관여하는 운동 인자들 중 하나인 HGF는 유전자가 염색체 7q21.1에 위치하며, 이 단백 산물은 tyosine kinase 활성능을 가진 고친화성 수용체인 c-Met 단백에 결합, 세포 내 신호 전달 체계를 연속적으로 활성화시켜 암종의 발생에 기여한다고 알려져 있다.⁶⁾ c-met 유전자는 골육종 세포에서 최초로 규명된 유전자로 염색체 7q31에 위치하고 이 유전자의 산물인 c-Met 단백은 tyrosine kinase activity를 갖는 190kDa transmembrane heterodimer로 간세포 외에도 다양한 장기에서 발현되며 HGF에 의해 활성화되어 주로 상피 조직에서 발현되고 세포 내 신호전달 체계에 관여할 것으로 추정되고 있다.²⁾ 또한 HGF에 대한 특이 수용체로서의 c-Met 단백은 기본 분자 구조가 세포막에 걸쳐 있는 형태를 하고 있으며 세포 외로 50kDa의 α-chain과 세포막에 걸친 β-chain이 이황화 결합으로 되어 있는 구조로, 세포 내측으로는 tyrosine kinase 활성을 가진다.⁷⁾ 따라서 HGF가 이 수용체인 c-Met 단백에 결합하게 되면 tyrosine kinase 효소에 의해 인산화됨으로써 활성화되고 동시에 다른 tyrosine kinase들의 활성을 조절하여 다양한 세포들의 성장, 운동, 분화, 이동, 형태에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 최근의 연구에 의하면 c-Met 단백은 위, 간, 췌장, 대장, 뇌, 갑상선, 전립선 등 다양한 장기의 암종에서 발현이 증가된다고 한다.^{2,5,8,9,10,11,12)} 또한 HGF/c-Met pathway에 관한 다른 연구에 의하면 Northern blot과 RT-PCR 기법을 이용하여 악성종양 세포에서 c-Met 단백 발현이 정상 세포와 비교하였을 때 증가하였으며 c-Met 단백 발현이 증가된 군에서 세포주의 침습성이 증가되고 HGF가 종양 세포 내에서 autocrine induc-tion 기전을 통해 MMP(matrix metalloproeinase)-2 등의 발현을 조절, 활성화시켜 악성 진행에 기여함을 보고하였다.^6,9) 본 연구에서는 구강 및 구인두의 편평세포암종에서 면역 조직 화학 염색을 통해 HGF와 c-Met의 발현 양상을 파악하고 RT-PCR 기법으로 mRNA의 발현 정도를 정량화하여 HGF/c-Met pathway를 조사하고자 하였다. 뿐만 아니라 HGF와 c-met의 발현을 임상적, 조직 병리학적 예후 인자와 비교함으로써 종양의 악성도와의 관계를 규명하고자 하였다. 또한 대조군으로 정상 구강 점막을 이용함은 물론 암종 주위의 이형성 병변을 비교군으로 하여 정상 조직, 이형성 조직, 그리고 암 조직을 함께 비교하였다. 본 연구에서 면역 조직 화학적 검사법으로 검출된 HGF 및 c-Met 단백의 발현은 암종에서 각각 55%, 62.5%의 양성율을 보여 양성 발현이 없었던 정상 조직 및 이형성 조직과 유의한 차이를 보였다. 그러나 임상적 조직 병리학적 예후 인자별로는 종양의 분화도, 종양의 국소 병기, 림프절 전이 여부 및 종양의 조직 병리학적 병기에 따른 HGF, c-Met 단백의 발현에 유의한 차이가 없었다. 최근 진행된 대부분의 연구는 면역 조직 화학 검사법에 의한 것으로 구강암종에서는 57.1%에서 발현이 양성이었고, 정상 조직은 모두 음성이었음을 보고하였으며, HGF 발현의 경우 정상 조직에서 3.1%, 이형성 병변에서 52.0%, 편평세포암종에서 71.9%의 유의한 발현의 차이를 보였으며, c-Met의 발현도 정상 25.8%, 이형성 53.0%, 암종 73.0%의 발현율을 보여 유의한 발현의 차이를 보고하였다.^3,13) 본 연구에서 시행한 RT-PCR 기법에 의한 HCF와 c-Met mRNA의 발현에서는 암종에서 각각 67.5%, 57.5%가 검출되었고, 이형성 조직에서는 각각 10%, 20%에서 검출되어 암종에서 이형성 조직에 비해 의미 있게 높은 검출률을 보였다. 또한 HGF, c-Met mRNA 발현의 임상적 조직 병리학적 예후 인자와의 상관관계를 보면 분화도와는 상관성이 없었지만, 종양의 국소 병기가 진행된 병기(T3 이상)일수록, 림프절 전이가 있는 군에서, 그리고 종양의 조직 병리학적 병기가 진행된 병기(병기 III+IV)일수록 유의하게 높은 발현율을 보였다. 본 연구에서 면역 조직 화학 검사법과 RT-PCR 기법에 의한 HGF와 c-met 발현과 임상적 조직 병리학적 예후 인자와의 관계가 서로 다르게 나타난 것은 검사법의 차이와 양성 판정의 기준의 상이함에 그 원인이 있다고 생각되며 이에 대해서는 앞으로 추가 연구가 필요할 것으로 생각된다.

결     론 

   두경부의 악성 종양 중 구강 및 구인두에 발생한 편평세포암종 40예를 대상으로 연구한 결과 HGF와 c-Met 단백 발현이 편평세포암종에서 유의하게 높았으며, HGF와 c-Met 단백 및 mRNA의 발현을 임상적 예후 인자와 비교한 결과 종양의 국소병기가 높을수록, 림프절 전이가 있는 경우, 종양의 조직병리학적 병기가 높을수록 높게 나타났다. 또한 RT-PCR 결과에서 HGF, c-Met mRNA의 발현이 구강 및 구인두 편평세포암에서 예후 인자로 활용될 수 있는 가능성을 발견하였다. 
   결론적으로 HGF및 c-Met 발현이 구강 및 구인두 편평세포암종 발생과 진행에 기여할 것으로 생각되며 HGF/c-Met 신호 전달 체계에 대한 구체적인 기전을 알아볼 수 있는 추가적인 연구가 진행된다면 구강 및 구인두 편평세포암종의 진단에 활용될 수 있는 이론적 뒷받침을 얻을 수 있을 것으로 생각된다. 

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