교신저자：이승신, 158-710 서울 양천구 목 6동 911-1  이화여자대학교 의과대학 이비인후과학교실
교신저자：전화：(02) 2650-6166 · 전송：(02) 2648-5604 · E-mail：seungsin2@ewha.ac.kr

서     론

   비용은 분비선 증식, 편평상피화생 등의 상피의 구조적 변형과 기저막 비후, 세포외기질의 침착, 섬유화 등의 점막하조직 변형을 가져오는 상기도의 만성 염증성 질환으로 알레르기성 비염, 만성 부비동염 등의 질환과 동반된다. 비용의 발생기전은 명확히 밝혀지지 않았으나 현재 알려진 바로는 알레르기성 및 비알레르기성 염증반응,¹⁾ 해부학적 구조의 이상,²⁾ 신경혈관 이상³⁾ 등이 비용의 발생에 관여한다는 주장이 있다.
   Transforming growth factor-beta(TGF-β)는 림프구, 섬유아세포, 호산구, 호흡기 상피세포 등에서 분비되는 사이토카인으로 기능의 차이가 없는 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3의 아형이 알려져 있고 기저막의 비후와 기질의 섬유화, 혈관의 형성, 상피분비선의 과형성 등의 작용을 한다. 이것이 과다 생성되면 세포외기질(extracellular matrix)이 병적으로 축적되고 조직의 섬유화가 심해져 비용의 발생을 유발할 수 있다.⁴⁾
   Interleukin-10(IL-10)은 Th2 세포, B 림프구, 각질세포 등에서 분비되어 IL-10, TNF-α, IL-8, MIP-1α 등의 전염증 사이토카인의 합성을 억제하여 염증반응을 하향조절한다.⁵⁾
   스테로이드는 비용 및 알레르기 질환에서 가장 널리 사용되는 약제로 그 효과는 인정되나 정확한 작용 기전의 규명을 위해서는 아직도 많은 연구가 필요하다. 특히, 스테로이드가 TGF-β 및 IL-10의 발현에 미치는 영향에 대한 연구는 현재까지 발표된 보고가 적고 또, 보고자마다 많은 차이를 보인다. 이에 저자는 수술 전 전신적 스테로이드의 투여가 비용조직에서 TGF-β1 및 IL-10의 발현에 미치는 영향을 알아보고자 이 연구를 시행하였다.

대상 및 방법

대  상
   2005년 5월부터 10월까지 비용을 동반한 만성 부비동염으로 본원 이비인후과에서 부비동 내시경 수술을 받은 환자 22명에서 수술 시 채취한 비용조직을 대상으로 하였다. 환자들의 연령분포는 12세부터 67세까지로 평균연령은 42.8세였고 남자가 18명, 여자가 4명이었다. 비용의 정도는 중비도를 부분적으로 막고 있는 경우를 1점, 중비도를 완전히 막고 있는 경우를 2점, 비전정까지 확장되어 있는 경우를 3점으로 점수화하였다. 모든 대상 환자들은 MAST (multiple allergosorbent test)를 시행하여 집먼지 진드기에 대한 혈청내 특이 IgE가 2등급 이상의 농도를 보인 경우 알레르기 양성으로 판정하고 모든 항원에 대한 특이 IgE가 음성인 경우 알레르기 음성으로 판정하였으며 집먼지 진드기 외의 다른 항원에만 양성을 보인 경우는 연구 대상에서 제외하였다. 대상 환자를 무작위로 스테로이드 처치군과 대조군으로 나누어 스테로이드 처치군에게는 수술 전 프레드니솔론(prednisolone)을 하루 30 mg씩 1주간 경구적으로 투여하였다. 대조군이 10예, 처치군이 12예였고, 각 군의 반은 알레르기 양성이었고 나머지 반은 알레르기 음성이었다. 대조군과 처치군에서 좌, 우 비강의 비용의 정도에 대한 점수 평균은 각각 1.9/1.8점, 2.2/2.1점으로 두 군 사이에 유의한 차이가 없었다. 모든 환자들은 수술 전 최소 2주 이상 2세대 cephalosporin계 항생제인 cefprozil(Cefzil(r), BMS)을 하루 500 mg 복용하였다. 진균성 부비동염, 점액낭종(mucocele), 상악동 후비공 용종(antrochoanal polyp), 반전성 유두종(inverted papilloma)으로 수술을 받은 환자들은 연구대상에서 제외하였다. 모든 대상환자에서 수술 전 상기 연구목적으로 비용의 채취에 대한 동의서를 받았고 본 연구는 검토 결과 1975년 헬싱키 선언 윤리기준에 부합하였다.

비용조직소견
   비용은 채취한 즉시 3% 중성 포르말린에 24시간 고정한 후 파라핀으로 포매하여 4 μm 두께의 절편을 제작하였다. Hematoxylin-Eosin 염색을 시행한 후 400배 시야에서 무작위로 선택한 다섯 곳에 침윤된 호산구 수를 세어 평균을 구하였다.

면역조직화학적 검사
   비용을 3% 중성 포르말린에 24시간 고정한 후 파라핀으로 포매하여 4 μm 두께로 박절하여 유리 슬라이드에 부착시키고 100% xylene에서 10분간 3회 탈파라핀 과정을 거친 후 90%, 85%, 80%, 70%, 60%, 50% 에탄올로 함수과정을 거친 후 증류수로 세척하였다. 내인성 과산화효소(peroxidase)를 억제하기 위해 3% hydrogen peroxidase용액에 10분간 처리 후 phosphate buffer saline(PBS, pH 7.4)으로 5분간 세척하였다. 비특이적 항원-항체반응을 억제하기 위해 10% fetal bovine serum으로 15분간 반응시켰다. 일차항체로 rabbit polyclonal anti-TGF-β1 및 anti-IL-10(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)을 1：100으로 희석하여 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 이후 PBS로 10분간 3회 세척한 후 biotin이 부착된 이차항체(goat anti-rabbit IgG, Dako Co., Copenhagen, Denmark)를 이용하여 실온에서 20분간 반응시켰다. PBS로 10분간 세척한 후 horseradish peroxidase(HRP)-conjugated streptavidin(Dako Co.)과 실온에서 20분간 결합시킨 후 PBS로 10분간 세척하였다. 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride로 5분간 발색반응을 시킨 후 PBS로 10분간 세척하였다. 대조염색은 Mayer’s hematoxylin을 이용하였다. 광학현미경을 이용하여 400배 시야에서 상피층과 기질층에서 각각 염색결과를 분석하였다. 각 세포에서 발현되는 정도는 전혀 발현되지 않는 경우를 0점, 전체세포 중 10% 미만으로 발현되는 경우를 1점, 10~50% 발현되는 경우를 2점, 50% 이상 발현되는 경우를 3점으로 판독하였고 통계학적 처리를 위하여 0점과 1점의 경우를 저발현군, 2점과 3점의 경우를 고발현군으로 분류하였다.

ELISA를 이용한 TGF-β1 및 IL-10의 측정 
   비용 조직을 1 mL lysis buffer(50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glycerol, 200 μM sodium orthovanadate, 10 mM sodium pyruvate, 50 mM glycerophosphate, 1% Triton X-100)로 처리하고 전기 조직 분쇄기를 이용하여 분쇄하였다. 2 μg/mL TGF-β1 항체 및 IL-10 항체를 각 well당 100 μL씩 투여한 후 실온에서 12시간 처리하여 coating하고 PBS-T(5% Tween 20 in PBS with 0.05% NaN3, Sigma, St. Louis, MO, USA)로 실온에서 한 시간 동안 처리하여 비특이적 항원-항체반응을 억제하였다. 각 well당 추출한 총 단백의 40 μg씩 투여하고 실온에서 두 시간 동안 반응시킨 후 세척하였다. Biotin이 부착된 항체(anti-human TGF-β1, anti-human IL-10) 300 ng/mL를 각 well당 100 μL씩 투여한 후 실온에서 두 시간 동안 반응시켰다. Streptavidinhorseradish peroxidase를 1：200으로 희석하여 각 well당 100 μL씩 투여한 후 실온에서 20분간 반응시켰다. Substrate solution(R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA)을 각 well당 100 μL씩 넣고 실온에서 20분간 반응시키고 2N H₂SO₄를 각 well당 50 μL씩 넣어 반응을 종결시킨 후 450 nm에서 optical density(OD)를 측정하였다.

통계학적 분석
   결과는 mean±SEM(standard error of measurement)으로 표시하였고 모든 통계처리는 SPSS version 13(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하였다. 호산구 수의 비교 및 ELISA를 이용한 농도의 분석에는 Mann-Whitney U test를, 면역조직화학적 검사 결과의 분석에는 Fisher's exact test를 이용하였다. 통계적 유의성은 p값이 0.05 미만인 경우로 하였다.

결     과

비용에 침윤된 호산구 수
   비용에 침윤된 호산구 수는 대조군에서 15.18±4.94개, 처치군에서 7.35±1.68개로 처치군에서 감소하였으나 통계적 유의성은 없었다(Figs. 1 and 2). 두 군 모두에서 침윤된 호산구 수는 알레르기 양성인 비용에서 음성인 비용보다 많았으나 통계적 유의성은 없었다.

비용에서 TGF-β1 및 IL-10의 발현
   TGF-β1은 기질층에 비해 상피층에서, IL-10은 상피층에 비해 기질층에서 높게 발현되었다(Fig. 3). TGF-β1의 경우 상피층에서는 대조군에 비해 처치군에서 통계적으로 유의하게 감소하였으나(p=0.043) 기질층에서는 유의한 차이가 없었다(Table 1). IL-10의 경우 상피층과 기질층에서 대조군에 비해 처치군에서 발현이 증가하였으나 기질층에서만 통계적 유의성을 보였다(p=0.008, Table 2, Fig. 4). 두 군 모두에서 알레르기 양성과 음성인 비용 간의 TGF-β1 및 IL-10의 발현 정도에 차이는 없었다.

비용에 존재하는 TGF-β1 및 IL-10의 농도
   ELISA를 이용하여 측정한 비용에서의 TGF-β1의 농도는 대조군은 1943.33±299.34 pg/mL, 처치군은 2208.78±328.26 pg/mL로 두 군 사이에 유의한 차이가 없었다(Fig. 5). IL-10의 농도는 대조군은 1.61±0.35 pg/mL, 처치군은 4.69±1.11 pg/mL로 대조군에 비해 처치군에서 통계적으로 유의하게 증가하였다(p=0.021)(Fig. 6). 두 군 모두에서 알레르기 양성과 음성인 비용 간의 TGF-β1 및 IL-10의 농도에는 차이가 없었다.

고     찰

   본 연구는 알레르기의 병인 연구와 면역 치료의 진전으로 최근 관심이 증가하고 있는 TGF-β 및 IL-10이 비용의 치료에 가장 많이 사용되는 약제인 경구용 스테로이드에 어떤 영향을 받는지 알아보고자 시행하였다. 비용의 생성과 스테로이드에 대한 반응에 있어서 알레르기 비염이 교란 변수로 작용할 수 있기 때문에 대조군과 치료군에서 반 수는 알레르기 음성, 나머지 반 수는 양성인 환자의 비용을 대상으로 하였다. 알레르기에 의한 영향의 차이를 최소화하기 위해 MAST상 집먼지 진드기에 반응을 보인 경우만 양성으로 하고 그 외 항원에 반응을 보인 경우에는 대상에서 제외하였다. 그러나 두 군 내에서 알레르기 음성과 양성인 비용 사이에 호산구 수, TGF-β 및 IL-10의 면역염색정도, 농도에 유의한 차이가 없었다. 이는 기존에 알려진 대로 비용의 발생에 알레르기의 영향이 적고 스테로이드의 비용에 대한 영향도 알레르기 반응의 조절을 통해 이루어지는 것이 아님을 시사하는 소견이다.⁶⁾ 가능한 다른 교란변수로 모든 환자에게 동반된 부비동염이 있다. 만성 부비동염은 병태생리학적으로 염증상태이고 따라서 이 또한 스테로이드에 의해 영향을 받게 되므로 스테로이드의 투여로 변화된 부비동염의 중증도가 비용의 상태에 간접적인 영향을 줄 수 있다. 그러나 부비동염에 의한 교란을 배제하거나 정량화하여 결과에 반영하는 것은 in vivo 연구에서는 현실적으로 많은 제약이 따를 것으로 생각된다.
   본 연구에서 호산구는 주로 비용의 기질층에 침윤되었으며 통계적으로 유의하지는 않으나 처치군에서 감소하였고 알레르기 양성인 비용에서 증가하는 경향을 보였다. 두 군 간에 침윤된 호산구 수의 평균치에는 비교적 큰 차이를 보임에도 불구하고 통계적 유의성이 없었던 원인 중의 하나로 개체별로 보였던 큰 편차를 들 수 있다. 이미 알려진 바와 같이 비용의 조직학적 유형으로 염증형과 알레르기형이 있고 조직학적 유형과 알레르기 비염의 유무가 반드시 일치하지는 않는다.⁷⁾ 따라서 본 연구결과는 각 유형에 따라 호산구 수를 포함하여 조직학적인 차이가 있음을 시사하고 개체 간 침윤된 호산구 수의 큰 편차는 비용의 발생에 호산구가 관여하는 비중은 개체별로 차이가 있다는 이론⁸⁾과 부합되는 소견이다.
   TGF-β는 림프구, 섬유아세포, 호산구, 호흡기 상피세포 등에서 생성되어 상피세포의 증식과 세포외기질의 형성을 촉진시켜 손상된 조직의 재생을 돕지만 이 작용이 지나치면 비용의 형성을 유발할 수 있다. TGF-β1 유전자가 비용에서만 발현되고 정상 하비갑개에서는 전혀 발현이 되지 않은 보고가 비용 형성에 TGF-β1이 관여함을 시사한다.⁹⁾ TGF-β의 다른 중요한 기능은 림프구, 대식세포, 중성구, 비만세포 등에 작용하여 광범위한 염증 억제작용을 하는 것으로 알려져 있다.¹⁰⁾ 또한 TGF-β는 CD4+ T 세포가 조절 T 세포로 분화하도록 작용한다.¹¹⁾ 따라서 이론적으로 TGF-β는 비용의 형성을 촉진할 수도 억제할 수도 있다고 짐작할 수 있겠다.
   한편 스테로이드에 의한 TGF-β의 변화는 보고자에 따라 다양한 결과를 보인다. Bachert 등은 경구용 스테로이드를 사용한 환자의 비용에서 eosinophil cationic protein과 알부민이 대조군과 비교 시 의미 있게 감소하였으나 TGF-β1은 차이가 없음을 관찰하고 경구용 스테로이드 치료는 TGF-β1의 양을 증가시키기보다는 직접적인 호산구성 염증의 하향조절과 비용에서 알부민 축적과 혈관 외 유출의 감소로 인해 비용의 수축을 유도할 것이라 하였다.¹²⁾ 그러나 Mastruzzo 등은 비강 내 국소적 스테로이드로 비용에서의 TGF-β의 증가를 관찰하여 국소적 스테로이드가 TGF-β의 항염증 기능을 증진시켜 비용의 형성을 억제한다고 하였다.¹³⁾
   한편 Elovic 등과 Wen 등은 각각 비용종과 태아 폐섬유아세포를 이용한 in vitro 연구에서 스테로이드가 TGF-β1을 감소시키고 이로 인해 TGF-β1의 세포외기질 침착, 섬유아세포 증식, 상피세포의 증식작용이 억제되어 비용과 천식을 포함한 만성 염증성 폐질환에서 보이는 기도 재형성(airway remodeling)의 치료에 사용되는 스테로이드의 작용을 설명하였다.^14,15) 또한 스테로이드는 CD4+ T 세포를 조절 T 세포로의 분화를 유도하고 조절 T 세포의 면역억제능을 촉진하는 것으로 알려져 있다.¹⁶⁾ 본 연구에서 TGF-β1의 경우 기질층보다는 상피층에서 더 강하게 발현되는 양상이었는데 이는 고유층에서 더 강하게 발현된다는 기존의 보고들과 상반되는 결과이다.^13,17) 가능한 이유로는 비용 채취 전에 투여한 항생제에 의한 영향과 TGF-β1의 측정방법의 차이에서 기인하는 것으로 생각되고 이에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다. 상피층에서 발현되는 TGF-β1의 양은 처치군에서 대조군보다 통계적으로 유의하게 감소하였으나 기질층에서는 두 군 사이에 유의한 차이가 없었다. 
   이러한 결과는 상피층과 기질층에 분포하는 TGF-β1을 분비하는 세포의 종류가 서로 다르고 이들 서로 다른 세포의 스테로이드에 대한 반응에 차이가 있기 때문으로 생각된다. 결과에 기술하지 않았지만 본 연구에서 두 군 모두에서 호산구 수와 ELISA로 측정한 TGF-β1의 농도 사이에는 상관관계가 없었다. 이 결과도 비용에서 TGF-β를 생성하는 주된 세포가 호산구만이 아님을 시사하는 소견이다. 상피층은 주로 상피세포로 구성이 되고 스테로이드의 영향으로 상피세포에서 발현되는 TGF-β1의 양이 감소하게 되지만 기질층은 호산구, 림프구, 비만세포 등 더욱 다양한 종류의 세포로 구성이 되고 이들 각 세포의 스테로이드에 대한 반응은 다양할 수 있다. 또한 스테로이드가 염증세포에 미치는 직접적인 작용 외에 조절 T 세포의 활성화를 통한 간접적인 작용도 염증세포에 영향을 미치기 때문에 본 연구의 결과는 in vivo 연구의 한계로 생각된다. ELISA를 이용하여 측정한 비용의 TGF-β1 농도는 대조군과 처치군에서 유의한 차이가 없었는데 이것은 ELISA의 경우 상피층과 기질층을 분리하지 않고 단백을 추출하여 측정하였기 때문으로 생각된다. 따라서 비용에서 스테로이드에 대한 TGF-β의 반응에 관하여 기존의 보고가 다양한 결과를 보이는 원인은 각각의 실험 방법의 차이에도 기인하지만 본 연구에서 보인 바와 같이 비용의 부위에 따른 반응의 차이에도 기인할 것으로 생각된다.
   IL-10은 림프구, 대식세포, 각질세포 등에서 생성되어 IL-1, TNF-α, IL-8, MIP-1α 등의 전염증 사이토카인의 합성과 Th 세포, 항원제공세포의 활성을 억제하고 조절 T 세포의 활성을 유도하여 염증반응을 하향조절한다.^18,19) 그러므로 IL-10의 증가는 비용의 형성을 억제하는데 관여할 것으로 생각할 수 있다. Roca-Ferrer 등은 국소적 스테로이드의 투여가 비강 점막에서 IL-1β, TNF-α의 발현은 감소시키나 IL-10의 발현은 감소시키지 않는다고 하였다.²⁰⁾ 본 연구에서 IL-10은 상피층보다 기질층에서 더 많이 발현되었고 이는 기존에 알려진 대로 기질층의 염증세포가 IL-10의 주된 분비세포임을 반영한다. 처치군에서 대조군보다 기질층의 IL-10 발현이 증가한 것은 스테로이드가 기질층에 침윤된 염증세포에서 IL-10의 발현을 상향조절하기 때문일 것으로 생각되나 주로 어느 종류의 염증세포에 작용을 하는지는 추가적인 연구가 필요하다. ELISA를 이용해 측정한 IL-10의 농도는 역시 스테로이드를 사용한 군에서 증가하였으며 이러한 결과들로 전신적 스테로이드가 IL-10의 발현을 증가를 통해서도 비용형성을 억제하는데 관여할 것임을 추측할 수 있겠다.

결     론

   스테로이드가 비용 형성을 억제하는 기전으로 기존에 보고된 TGF-β의 발현 감소를 통한 비용에서 보이는 섬유아세포 증식 및 세포외기질 침착의 억제와 비용 조직으로의 호산구 이주 억제 외에 본 연구결과에 따라 다음의 기전으로도 비용 형성을 억제한다고 추론할 수 있겠다. 첫째, 상피층에서 TGF-β의 발현의 감소를 통해 상피세포의 증식, 분화, 편평상피화생을 억제한다. 둘째, 기질층에서 IL-10의 발현을 증가시켜 비용에서 보이는 염증반응을 하향조절한다. 한편 비용의 형성에 알레르기 비염의 역할은 크지 않을 것으로 생각된다.

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