교신저자：정용원, 330-715 충남 천안시 안서동 산 16번지  단국대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
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서     론

   포유류의 내이 유모세포는 임신 초기에 분화가 완료되어 출생 시에는 이미 완성된 내이구조를 가지고 있다. 따라서 이후 발생되는 유모세포의 소실 혹은 손상에 의한 청각이나 전정장애 등은 영구적이며 불가역적인 현상으로 알려져 왔으나 면역조직학, 분자생물학 등의 발전과 말초 청력기관의 조직배양이 가능해짐에 따라 유모세포의 재생에 대한 연구의 기초가 마련되었으며 손상된 유모세포의 치료 가능성도 제시되었다. 최근 포유동물에서 아미노글라이코사이드 이독성으로 손상된 전정유모세포의 재생이 보고되어 전정장애의 치료 가능성을 제시한 바 있다.^1,2) 또한 성장한 기니픽의 전정기관에 젠타마이신으로 이독성을 유발한 후에 여러 가지 성장인자의 혼합액(TGF-α, IGF-1, BDNF and retinoic acid)을 외림프액 내로 주입한 결과 자발적인 전정유모세포의 재생을 촉진하고 전정기능도 회복된다는 사실이 보고되었다.³⁾
   포유류의 전정기관은 매우 단단한 뼈 조직으로 싸여있기 때문에 수시로 변하는 체내의 생물학적 환경 또는 조건의 변화 등을 생체 내 실험으로 알아내는 데에는 많은 어려움이 있다. 반면에 생체 외 실험은 장기간 동안 안정적인 실험조건을 제공하고 면역조직화학적, 형태학적 연구를 수행하기가 용이해서 본 연구와 같이 전정유모세포의 재생에 관련된 연구에 적합한 모델 체계라 할 수 있다. 특히 조직배양(organotypic culture)은 시험관 내 실험에서 생화학, 면역조직화학, 분자생물학 등을 이용하여 세포의 발달과정에 관여하는 제반 기전에 대한 연구를 할 수 있는 좋은 방법이다. 따라서 난형낭의 조직배양은 내이의 감각유모세포를 장기적으로 유지하면서 관찰할 수 있으며 유모세포의 발달과정에 있어 성장요소들의 효과 및 기전을 밝혀낼 수 있는 방법이다.⁴⁾
   레이저는 수술 시 쓰이는 고출력 레이저와 비수술적 치료에 사용되는 저출력 레이저로 분류할 수 있다. 저출력 레이저는 항 염증 작용 및 진통 효과를 나타내고 조직을 자극하여 창상치유를 증진시켜 준다는 사실은 이미 여러 문헌에서 보고된 바 있다.⁵⁾ 또한 지속적인 저출력 레이저의 조사 후 손상된 신경조직의 활동전위와 재생속도가 증가한다는 연구 결과들도 보고되고 있다.^6,7) 
   본 연구에서는 이독성이 유발된 신생 흰쥐의 난형낭의 조직배양을 통해 전정유모세포의 자발적인 재생과정을 관찰하고 또한 저출력 레이저에 의한 재생 증진 효과를 알아보고자 하였다. 

재료 및 방법

실험동물 및 조직배양 
   난형낭의 분리 및 조직배양을 위한 실험동물로 신생 흰쥐(2~7일령, Sprague-Dawley rat)를 각 군당 15귀, 총 30귀를 사용하였다. 신생 흰쥐를 75% 에탄올로 소독한 후 경부를 절단하여 두부를 좌우로 분리하고 두피와 뇌 조직을 제거한 뒤 난형낭을 분리하였다. 상반고리관과 가측반고리관의 팽대부를 미세가위 및 미세칼로 제거하고 전정유모세포의 섬모를 온전히 보존하기 위해 이석막을 조심스럽게 제거하였다. 조직배양 중 다른 추가적인 조작 없이 공촛점 레이저 주사 현미경으로 직접 관찰할 수 있도록 바닥이 커버글라스로 되어있는 배양 용기(Fluoro Dish, World Precision Instrument, Inc, Sarasota, FL)를 사용하였고 분리된 조직을 4.5 g/L 농도의 글루코오스, 10% fetal bovine serum (FBS, Hyclone Laboratory, Logan, UT), 100 μl/10 ml 농도의 N-1 supplement(Sigma, MO, USA) 그리고 100 U/ml의 페니실린(Sigma, MO, USA) 등이 포함된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Hyclone Laboratory, Logan, UT) 배양액이 담긴 배양 용기로 옮긴 후 배양을 시작하였다. 조직을 옮기기 전에 배양 용기의 바닥면에 쉽게 부착될 수 있도록 젤라틴 코팅을 시행하였다. 5％의 탄산가스와 37℃의 온도가 유지되는 배양기에서 배양하였으며 2일 간격으로 배양액을 교체하였다.

이독성 및 저출력 레이저 조사 
   난형낭의 전정유모세포의 이독성 유도를 위해 아미노글라이코사이드 계열의 항생제인 젠타마이신(Sigma, MO, USA)을 사용하였다. 이독성 유도가 필요한 군에서 조직이 배양 용기의 바닥면에 안정되게 부착될 수 있도록 48시간 동안 배양한 후, 배양액의 농도가 1 mM이 되도록 젠타마이신을 조직배양액에 넣어 다시 48시간 동안 배양하여 이독성을 확인하였다. 그리고 이독성 유도를 하지 않은 군에서는 조직배양 3일째(3 DIV, Days In Vitro)부터, 이독성을 유도한 군에서는 5 DIV부터 매일 90분간 632 nm Diode 레이저(Biolitec, Germany)를 3.0 mW/cm²의 세기(16.3 J/cm²)로 각각의 배양 용기에 동일한 양의 레이저가 조사될 수 있도록 고안된 metal box 안에서 배양 용기의 덮개를 열고 레이저를 조사하였고 이틀마다 조직배양액을 교체하는 날에는 배양액 교체 후 레이저를 조사하였다.

형광 염색 및 공촛점 레이저 주사 현미경
   배양되고 있는 조직의 변화 과정을 확인하고 영상 자료를 얻기 위해 각 실험군에서 5, 11, 18, 24 그리고 31 DIV에 조직을 희생하지 않고 5 μM의 FM 1-43{N-(3-triethylammonium-propyl)-4-(4-(dibutylamono)-styryl) pyridinum dibromide}(Molecular probes, Eugene, OR, USA)을 배양 용기에 떨어뜨려 5분간 항온기에서 염색한 후 공촛점 레이저 주사 현미경(Confocal Laser Scanning Microscope, ZEISS510 META, Germany)으로 관찰하였다. 공촛점 레이저 주사 현미경은 조직을 수평단면으로 절단하여 영상을 얻기 때문에 세포의 밀도가 가장 높은 부분의 영상을 택하여 400배 확대한 상태에서 40,000 μm²당 염색된 유모세포의 수를 세어 정량적으로 분석하여 통계처리하였다.

실험군 및 대조군 설정 
   이틀마다 배양액만을 교체하고 추가적인 조건 없이 장기간의 조직배양을 위해 설정된 군을 대조군(C)으로 하고, 배양 3일째 전정유모세포의 이독성을 위한 젠타마이신 적용 후 자발 재생과정을 관찰할 G군, 그리고 G군에 매일 90분간 632 nm Diode 레이저를 3.0 mW/cm2의 세기(16.3 J/cm²)로 조사한 군를 GL군으로 각각 분류하였다(Fig. 3). 

통계분석
   SPSS(version 10.0) 통계프로그램을 이용하여 5, 11, 18, 24 그리고 31 DIV 시점에 생존해 있는, 즉 형광 염색되는 유모세포의 개수를 측정해 그 차이를 Mann-Whitney test로 정량적으로 분석하여 95％ 유의수준에서 검증하였다. 

결     과

조직배양
   신생 흰쥐의 난형낭을 분리한 후 이틀마다 배양액만을 교체해주고 아무 조건 없이 장기간의 조직배양을 진행한 군(C)에서는 40,000 μm² 당 염색된 유모세포 개수의 평균값이 각각 5, 11, 18, 24 그리고 31 DIV에서 123.8±14.4, 96.1±9.2, 76.4±8.7, 47.1±9.9 그리고 7.1±9.7이었다(Fig. 1). 조직배양 첫날부터 지속적으로 유모세포의 수가 감소하였지만 31일째까지도 생존해 있는 세포를 관찰할 수 있었다(Fig. 2).

이독성 평가

이독성
   아미노글라이코사이드 계열의 항생제인 젠타마이신을 3 DIV에 적용한 군(G)의 경우 48시간이 지난 5 DIV에 관찰한 결과 30±7.2개로 측정되어 C군과 같은 시점의 결과와 비교하여 약 75%의 전정유모세포의 이독성 효과를 보였다. 세포손상에 의한 유모세포의 탈락은 striola 부위가 현저하였으며 striola 부위에서 난형낭 말초부위로 갈수록 유모세포는 striola 부위에 비해 상대적으로 잘 유지되었다(Fig. 3).

이독성 유발 후 전정유모세포의 자발 재생 
   젠타마이신 이독성 유발 후 11 DIV에 64.3±7.9개가 측정되어 5 DIV와 비교했을 때 2배 이상의 세포수를 보임으로서 전정유모세포의 자발 재생이 활발히 진행되고 있음을 알 수 있었다. 18, 24, 그리고 31 DIV에서는 각각 80.5±9.7, 60.5±11.7 그리고 31.1±7.4개의 결과를 보여 본 연구에서의 이독성 후 자발 재생은 일주일 정도의 기간 내에 시작되어 활발히 진행되다가 2주일째(18 DIV) 최고조에 이른 후 서서히 감소하기 시작하는 것으로 나타났다(Figs. 1 and 3).

이독성 유발 후 전정유모세포의 자발 재생에 대한 저출력 레이저의 효과
   젠타마이신 이독성 유발 후 5 DIV부터 매일 90분간 저출력 레이저를 조사한 군(GL)에서는 5, 11, 18, 24 그리고 31 DIV에서 각각 32.1±10.9, 83.5±9.2, 83.9±6.4, 79.9±11.0 그리고 59.1±8.4개의 결과를 보였다. 이독성 유발 후 자발재생과정을 관찰한 G군과 비교하면 저출력 레이저에 의한 자발재생은 이독성 유발 후 일주일 내에 이미 최고점을 기록하고 이러한 상태가 지속적으로 유지되어 3주일 정도까지(24 DIV) 거의 변화 없는 생존율을 보였다. 또한 통계적으로도 G군과 비교하여 11, 24 그리고 31 DIV에서 유의한 차이를 보였다(^p<0.05)(Figs. 1 and 4).

고     찰

   내이 기관의 배양은 청각 또는 전정기관의 손상 후 재생이나 회복에 대한 연구를 위한 기초적인 연구로서의 의의를 가진다. 1925년 Maximov에 의한 첫 실험 이후 많은 시도가 이루어져, 1928년 Fell에 의해 병아리의 배아 이포(embryo otocyst)에서 처음 성공하였으며 Friedmann은 이포의 감각구조와 신경조직의 발달 및 신경 지배를 연구 보고하였다.^8,9,10) 그 후 Iwai는 시험관 내 실험에서 병아리 나선 신경절(spiral ganglion)을 장기간 배양할 수 있음을 보고하였다.¹¹⁾ 조류 및 포유류 이포의 배양으로부터 발전되어 Van de Water는 생쥐를 이용한 이포의 단독 배양에 관한 연구를 체계적으로 시도하여 장기간의 시험관 내 실험모델을 확립함으로써 포유류 내이의 조직 배양이 내이 질환으로 초래되는 청각 및 전정 장애를 연구하는 데 있어서 중요한 도구임을 보고하였다.¹²⁾
   한편 최근 포유동물에서 아미노글라이코사이드 이독성 유발 후 손상된 전정유모세포의 재생이 보고되어 전정 장애의 치료 가능성을 제시한 바 있다.¹⁾ 본 연구에서는 유모세포가 탈락된 자리에서 새로운 유모세포가 보이는 것을 확인하였으며, 그 기전으로 새로운 유모세포의 생성, 기존유모세포의 세포분열, 주변 지지세포에서 유모세포로 분화(transdifferentiation) 그리고 유모세포의 부분적 손상 후 회복 등의 가능성이 알려져 있으며 이는 분자생물학적 표식자 연구를 통하여 밝혀야 할 과제이다. 소음이나 이독성 약제 투여 후 손상된 유모세포 주변의 지지세포들이 유모세포로 분화한다는 보고들이 있으며 이들 연구에서는 새로운 유모를 가진 유모세포들은 내이 상피 표층에서 분화억제재의 존재하에도 발현되는 것으로 알려져 있어, 세포 증식이 아닌 재생으로 생각되고 있다.¹³⁾ 특히 생체 외 모델에서 유모세포의 재생 및 분화에 초기에 나타나는 여러 표식자 중에서 실제 포유동물 실험모델에서도 발현되는 표식자들을 확인하여야 한다.^14,15) 이러한 방법은 유모세포의 재생과정 초기에 재생여부를 확인할 수 있으며, 최근 논란이 되고 있는 새로운 유모세포의 기원과 유모세포와 지지세포 사이의 관계를 규명하는 데 도움을 줄 것이다.
   본 연구에서 사용된 styryl pyridinium계열의 형광 염색 시약인 FM 1-43은 생존하는 유모세포에만 염색이 되는 특성을 가지므로 이독성으로 손상된 유모세포의 재생과정을 장기간 관찰하기에는 상당히 효율적이며 조직의 고정이 불필요해 일관되고 연속적인 결과를 얻을 수 있다는 장점이 있다. 또한 culture dish로 사용된 Fluorodish는 바닥면이 cover glass로 되어있어 배양되는 조직을 직접 공촛점 현미경으로 볼 수 있기 때문에 불필요한 조작을 줄이고 조직의 손상을 최소화함으로써 장기간의 조직배양을 가능하게 하였다. 그리고 FM1-43은 유모세포의 부동 섬모의 첨부에 존재하는 mechanotransduction channel을 통해 유모세포 내로 들어와 염색이 되는 것으로 알려져 있으며 이 통로는 아미노글라이코사이드 계열의 항생제가 이독성을 유발하기 위해 세포 내로 들어오는 통로이기도 하므로 이독성에 노출되기 전 FM1-43의 전 처치는 이독성의 예방에 효과적이라는 연구 결과도 보고 되었다.¹⁶⁾
   레이저는 수술 시 쓰이는 고출력 레이저와 비수술적 치료에 사용되는 저출력 레이저로 분류할 수 있다. 저출력 레이저는 고출력 레이저가 열에 의한 조직반응을 이용한 것과 달리, 저출력 레이저의 빛에 의한 세포 내에서의 생화학적 변화 및 활성을 이용한다. 저출력 레이저의 biophysical effect 기전으로, porphyrins, cytochromes, mitochodrial enzyme 등이 저출력 레이저를 흡수하여 자극되면 singlet oxygen의 생성 및 mitochodria에서 Ca2+이 유리되며, ATP 생산을 자극하여 DNA와 RNA의 합성을 가속시킴으로써 세포활성이 증가하는 것으로 제시하고 있으며, 또한 교감신경에 작용하여 혈관 운동신경활동을 감소시키며, vascular smooth muscle cell의 확장, NO에 의해서 cGMP 생산을 증가시켜 혈관의 확장을 가져옴으로써 만성통증개선, 상처치유, 신경세포와 내이세포재생을 촉진한다고 설명하고 있다.^17,18)
   저출력 레이저의 신경 조직의 재생에 대한 작용 기전은 명확하게 밝혀져 있지 않다. 그러나 가능한 기전을 설명해 보면, 먼저 저출력 레이저는 신경조직을 보호하는 효과가 있다고 알려진 calcitonin gene-related peptide(CGRP)와 growth-associated-protein-43(GAP-43) 등의 합성을 촉진하고 반대로 신경 독성의 효과를 지닌 nitric oxide(NO)의 활성도를 억제하는 등의 연구 결과가 보고되었고, 최근에는 mitochondrial oxidative metabolism을 변화시켜 손상된 신경세포의 회복을 증진시킨다는 결과도 보고되었다.^19,20) 

결     론

   본 연구결과 이독성이 유발된 신생 흰쥐의 난형낭에서 전정유모세포의 자발적인 재생과정을 31일 간의 조직배양을 통해 관찰하였고 저출력 레이저의 조사가 이러한 재생 과정을 촉진하고 세포 생존율을 높이는 결과를 확인할 수 있었다. 향후 저출력 레이저에 의한 상기 효과들이 어떠한 기전을 통해 이루어지는지에 대한 생물학적 및 형태학적 연구가 추가적으로 필요할 것으로 생각된다.

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