교신저자：김동욱, 140-743 서울 용산구 한남동 657번지  순천향대학교 의과대학 이비인후과학교실
교신저자：전화：(02) 709-9361 · 전송：(02) 794-9628 · E-mail：kdw1228@hosp.sch.ac.kr

서     론

   후두암은 전체 악성종양의 약 2~5%를 차지하며 갑상선암을 제외하면 가장 흔한 두경부의 원발성 종양이다. 95~98%가 편평세포암이고, 음주나 흡연 등의 문제들로 인해 그 발생이 증가 추세에 있다. 후두의 편평세포암은 수술적 방법으로 완치를 기대할 수 있으나 불가피하게 발성장애를 비롯한 술후 합병증을 남기게 되고, 수술이나 방사선 및 항암제 치료법의 발달에도 불구하고 치료의 성공률과 생존율은 크게 좋아지고 있지 못한 실정으로 새로운 치료법의 개발이 시급하게 요구되고 있다. 이를 위해서는 무엇보다도 조기 진단과 치료 결과를 예측할 수 있는 요소인 예후 인자의 활용으로 암의 초기에 치료방침을 세우는 것이 중요하다. 기존에 널리 알려져 있는 예후인자로는 병기, 경부 림프절 전이의 유무, 병리조직학적 분화도, 주위 조직에의 침윤 정도 등 여러 가지 요인이 있으며 다양한 각도로 또 다른 예후인자를 찾고자 하는 노력이 진행되고 있다.
   Vascular endothelial growth factor(VEGF)는 혈관내피세포에 선택적으로 작용하는 34~46 k Da의 단백질로 폐, 유방, 소화기계 등의 다양한 장기의 악성종양에서 발현됨이 밝혀져 왔고 여러 연구를 통해 VEGF가 혈관내피세포에서 survivin의 발현에 작용한다고 알려져 왔다.^1,2) Survivin은 염색체 17q25에 위치하는 16.5 k Da 크기의 유전자로, 세포자멸사를 억제하고 세포 분열을 조절하는 세포내 단백질로 알려져 있다.^3,4) 대부분의 암의 종류나 분화 정도에 상관없이 survivin이 과발현되는 것으로 보고되고 있고, 특히 직장암이나, 비소세포성 폐암, 유방암 등에서 survivin의 과발현에 따른 생존율이 더 낮다는 보고들이 있어 예후인자로서의 중요성에 대한 연구가 계속되고 있다.^5,6,7)
   본 연구는 후두의 편평세포암을 대상으로 survivin과 VE-GF의 발현 정도를 면역조직화학 염색을 이용하여 관찰하였고, survivin과 VEGF의 발현이 조직학적 유형과 임상 병기에 따라 어떠한 상관 관계를 나타내는지 알아보고자 하였다.

대상 및 방법

대  상
   후두 편평세포암으로 확진된 19예를 대상으로 하였다. 환자군의 연령은 41세에서 80세까지 평균 61.8세로서 모두 남성이었다. 대상 환자 19명은 M0의 환자들로서 원발 병소의 크기에 따른 T 병기는 T1 4명(21.1%), T2 3명(15.8%), T3 8명(42.1%), T4 4명(21.1%)이었다. 경부전이에 따른 N 병기는 N0 13명(63.2%), N1 2명(15.8%), N2 4명(21.1%)이었으며 N3는 없었다. 또한 발생부위에 따라 성문암 7명(36.8%), 성문상부암 7명(36.8%), 원발부위를 정확히 가늠하기 어려워 경성문암으로 분류된 경우는 5명(26.3%)이었다. 과거력상 흡연의 경력이 있었던 경우가 19명중 17명(89.5%)이었다. 수술은 후두전적출술을 시행한 경우가 7명(36.8%)이었으며 성문상부 절제술이나 성문부 부분절제술을 시행한 경우가 각각 2명(10.5%), 7명(36.8%)이었고, 인두까지 절제 범위를 확장해야 했던 경우는 3명(15.8%)이었다. 경부 곽청술을 시행한 경우는 10명(52.7%)이었으며 편측 경부 곽청술을 시행한 경우가 8명(42.1%), 양측 경부 곽청술을 시행한 경우가 2명(10.5%)이었다(Table 1). 

방  법
   각 환자의 파라핀 포매 조직을 5 μg의 두께로 연속절편을 만들어 VEGF와 survivin 단백에 대한 면역조직학적 염색을 시행하였다. 조직의 처리는 60℃의 보온기 내에서 30분간 처리 후 xylene에서 탈 파라핀을 시행하고 무수 알콜로부터 순서대로 희석된 유수 알콜로 처리하여 증류수에 함수시켰다. 3% H₂O₂와 Methanol에 30분간 처리하고, 0.1 M citrate 용액 70℃에서 10분간 처리하고 30분간 실온에 두었다. 다시 PBS에 세척 후 2% BSA가 혼합된 Blocking solution(Blocking solution, Signet laboratories, Dedham, MA, USA)에 1시간 동안 배양하였다. VEGF 염색 포본의 경우 Rabbit polyclonal anti-VEGF(Santa Cruz Technology, Inc, USA)을 1：100으로 희석하여 4℃에서 16시간 처리하고 survivin 염색 표본은 Rabbit polyclonal anti-survivin(Santa Cruz Technology, Inc, USA) 1：100으로 희석하여 4℃에서 16시간 처리하였다. 후에 PBS에 5분간 각 3회씩 세척을 하고, 2차 항체(Multi-species Reagent, Bio-tinylated Anti-mouse and rabbit immunoglobulin(Signet laboratories, Dedham, MA, USA)를 사용하여 30분간 배양하였다. 다시 PBS에 각 5분간 3회씩 세척을 한 후 avidin-biotin peroxidase complex(Vectastain Kit, Vector laboratories, Boehringer Mannheim, USA)를 사용하여 30분간 배양 후 PBS에 각 5분간 3회씩 세척하였다. DAB (3,3’-diaminobenzidine-tetra-hydrochloride) 용액으로 현미경 하에서 발색을 확인한 후 증류수로 세척을 하고, 대조 염색은 Hematoxylin-Eosin을 사용한 후 광학현미경하에서 발색부위를 관찰하였다. 음성 대조염색은 일차 항체를 생략하고 시행하였다.

결과 판독
   VEGF 염색 표본과 survivin 염색 표본을 저배율(100배 이하)로 모두 관찰하면서 염색이 잘 되어 있는 부분을 선택하여 고배율(200배 이상)에서 VEGF 염색 표본의 경우 VEGF 항체에 잘 염색된 부분을 양성으로 판독하였고, survi-vin이 세포질 내 혹은 핵에 균일하게 적갈색으로 염색되는 경우를 양성으로 판독하였다. 조직에서 염색결과를 대조군의 편평상피와 비교하여 음성, 약양성, 강양성의 세 등급으로 나눴으며, 객관적인 염색 정도를 알기 위하여, 2명의 관찰자가 3번씩 관찰하여 분류를 하였다. 양성 반응의 강도가 정상부위와 동일할 경우 음성, 염색의 강도가 약할 경우 약양성(+), 강할 경우 강양성(++)으로 분류하였다(Fig. 1).

통계처리
   본 연구는 SPSS 10.0 program을 이용하여 통계학적 분석을 시행하였다. 면역조직화학 염색 결과와 조직학적 분류 및 임상병기와의 비교는 Pearson Chi-Square test와 Fisher's exact test를 실시하였고 유의수준은 5% 이내로 하였다.

결     과

   면역조직화학검사상 VEGF의 세포내 발현 양상을 살펴보면 VEGF이 2+(강양성)으로 발현되는 경우는 총 9예(47.4%)였고, 1+(약양성)으로 발현되는 경우는 6예(31.6%)였으며, 발현되지 않은 경우는 4예 (21.1%)였다. Survivin의 발현 양상을 살펴보면, 모든 조직 표본에서 survivin이 세포 내에 발현하는 양상을 보였으며, survivin이 약양성(+)으로 발현되는 경우는 총 9예(47.4%)였고, 강양성(++)으로 발현되는 경우는 총 10예(52.6%)였다. 
   VEGF와 survivin의 발현 양상과 임상병리학적 지표 간의 상관 관계를 분석하여 보면, 종양의 T 병기와 경부 림프절 전이, 임상적 병기, 조직학적 분화 정도와의 상관 관계에 있어서 통계학적 유의성을 보이지 않았다(Table 2 and 3).
   VEGF에 강양성 반응을 보인 9예에서 Survivin에 강양성 반응을 보인 경우는 7예였고, VEGF 약양성 반응을 보인 6예에서 survivin에 강양성과 약양성을 보인 예는 각각 3예였으며, VEGF에 음성 반응을 보인 2예는 survivin에서도 약양성 반응을 보였다(Table 4). 후두암에서 VEGF와 survivin의 발현을 서로 비교하여 보면, VEGF의 발현 정도가 높을수록 survivin의 발현 정도가 통계학적으로 유의하게 높은 양상을 보였다(p<0.05).

고     찰

   한국인에서 후두암은 연간 250~400명 정도로 인구 100,000명당 3.2명 정도로 발생하며 남녀비는 10：1, 호발 연령은 60대로 알려져 있다. 후두암은 조기 발견이 비교적 용이하고 조기 치료 시 그 예후가 매우 좋은 질환이나 수술이나 항암 및 방사선치료로 인한 합병증을 피하기 어렵고 다양한 술식이나 방사선치료의 방침에도 뚜렷하게 생존율이 증가하지 않고 있다. 이에 최근에는 암 발생의 원인이나 발생 과정에 대한 연구로 해결책을 찾으려는 노력이 많다. 암은 세포 증식의 비정상적인 증가에 의해 발생한다고 설명되어져 왔으나 그 외에도 최근 세포자멸사(apoptosis)의 이상과 신생 혈관신생(angioneogenesis)이 중요한 역할을 한다는 의견이 주목받고 있다. 신생혈관 형성은 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관을 만드는 과정으로 종양의 증식과 전이에 필수적이다.⁸⁾ 이 과정은 혈관신생 인자(angiogenetic factor)에 의해 조절되는 것으로 알려져 있다. 복잡한 신생혈관 형성 과정이 기존 혈관의 기저막을 파괴하고 내피 세포의 이주를 촉진하며, 또한 종양의 신생 혈관은 정상 혈관보다 혈관벽이 약하여 보다 쉽게 암세포가 침습할 수 있어 림프절 전이의 통로가 될 수 있으므로 신생혈관 형성은 암세포의 성장과 전이에 중요하다. 1971년 Folkman 등이 종양의 성장과 혈관신생의 밀접하게 연관되어 있다는 보고를 한 이후 여러 혈관신생 인자가 알려져 있다.⁹⁾ 이 중 VEGF는 34~46 kD의 당단백으로 혈관 내피 세포에 선택적으로 작용하며, 4가지 이형체 중 VEGF121와 VEGF165가 확산성을 가지며 세포외로 분비되어 기능을 하는 것으로 알려져 있다.¹⁰⁾ VEGF는 정상인에서도 관찰되는 단백질로, 내피 세포의 증식을 유발하고, 손상된 혈관의 재생에 관여하며, 종양의 발생에서 혈관 투과성을 증가시키는 작용을 하고, 혈관 생성에 중요한 역할을 한다. VEGF가 혈관의 기질을 만드는 기전은 첫째로 VEGF가 특이적인 두 개의 tyrosine kinase receptor protein인 VEGFR-1, VEGFR-2에 결합함으로써 내피세포에 직접적으로 강력한 분열촉진인자로 작용하며,¹¹⁾ 둘째로 VEGF가 혈관투과의 매개체로 작용해 미세혈관의 투과성이 증가되어 혈장단백이 혈관 밖의 기질로 유출되어 세포외 기질에 혈관신생의 전단계가 일어난다.¹²⁾ VEGF는 신경교종에서의 역할이 밝혀진 이후 식도암, 갑상선암, 유방암, 자궁경부암 등의 암에서 발현됨이 알려졌고, 두경부 편평세포암에서 증가되어 있음이 보고되었다. 또한 VEGF가 혈관 내피 세포에서 survivin의 발현을 증가시켜 혈관 내피 세포의 분열을 촉진하고 세포자멸사를 억제하는 역할을 한다는 보고가 있다.¹³⁾
   세포자멸사란 계획된 세포사로 괴사(necrosis)와는 구별되는 세포사멸의 한 형태로써 정상적인 개체의 기능을 유지하기 위한 일종의 방어 기전이면서 또한 세포 분열과 함께 이루어지면서 생명체의 항상성을 유지해주는 기전이기도 하다.¹⁴⁾ 세포자멸사가 비정상적으로 억제되면 정상적인 세포 생사의 항상성이 파괴되고, 이에 따라 제거되어야 할 세포나 비정상적인 세포들의 생존이 지속되어 결과적으로 유해한 세포의 증식이 초래된다. 이러한 세포들의 비정상적인 생존의 연장은 일차적으로 종양을 형성하게 된다. 세포사로부터의 탈출(escaping cell death)은 암의 형성(tumorigenesis)뿐 아니라 암의 진행을 가속화시키며, 암세포가 혈류 속에서 살아남아 다른 부위의 조직에서 자라나게 하여 암의 전이를 용이하게 하고 치료적인 면에서도 세포자멸사의 역치를 올려 암 치료에 대한 내성 유발에 중요한 역할을 한다. 이러한 세포자멸사는 다단계의 cascade로 구성되어 있으며 이러한 과정은 여러 단백질에 의해 조절되고 있다.¹⁵⁾ Survivin은 IAP 가족군(inhibitor of apoptosis protein family) 중 하나로 16.5 k Da의 세포내 단백질로,³⁾ 태아기에는 체내에 정상적으로 존재하고 정상 성인 조직에서는 발견되지 않지만, 종양 세포에서는 두드러지게 증가한 소견을 보인다. Survivin은 세포자멸사를 일으키는 initiator와 effector caspase에 작용하여 그 발현을 억제시킴으로써 세포자멸사를 억제하는 효과를 낸다.¹⁵⁾ 또한 세포주기의 시작 시기에 mitotic spindle의 microtubule의 기능을 억제하는 것과 연관되어 있다. Ambrosini 등³⁾은 폐, 대장, 유방, 췌장 및 전립선 등의 선암과 고등급 림프종에서 western blot을 이용하여 보고하였다. 이 연구에 따르면 조직분화도가 나쁜 경우에 양성으로 염색된 경우가 많아 survivin이 불량한 예후인자라고 하였다. 
   본 연구의 경우 VEGF의 발현율은 78.9%로 이는 Lim 등¹⁶⁾의 100%보다는 낮은 발현율을 보였다. 면역조직화학 염색 상 원발부위 종양의 T 병기 및 N 병기에 따른 VEGF의 발현은 일정한 양상을 보이지는 않았으며 병기가 높을수록 발현율이 많았으나, 통계적 유의성은 없었고, 이는 이전에 보고된 바 있는 후두암¹⁶⁾과 구인두암¹⁷⁾에서의 발현과 비슷한 결과를 나타내었다. Survivin의 경우 발현율은 100%로 이는 Pizem 등¹⁸⁾의 98.5%보다 높은 결과를 보였다. 면역조직화학 염색상 원발 부위 종양의 T 병기 및 N 병기에 따른 survivin의 발현은 병기가 높을수록 발현율이 높았으나 통계학적으로 유의한 양상을 보이지는 않았으며, 이는 여러 악성종양에 대한 Ambrosini 등³⁾의 연구와 후두암에 대한 Pizem 등¹⁸⁾의 연구와 비슷한 결과를 보였다. 
   또한 VEGF와 survivin의 발현을 서로 비교하여 보면, VEGF의 발현이 증가할수록 suvivin의 발현이 통계학적으로 유의하게 증가하는 소견을 보였다. 이는 이미 보고된 바 있는 신경아세포종²⁾과 후두암¹⁹⁾에서의 VEGF와 survivin 발현에 대한 연구와 동일한 결과를 보였다.
   본 연구가 상대적으로 적은 표본 수로 진행되었다는 한계점이 있어, 이를 위해 앞으로 더 많은 연구대상을 필요로 하고, 또한 영향을 미치는 다른 인자의 조사가 필요할 것으로 생각된다. 

결     론

   Survivin과 VEGF의 발현은 세포자멸사의 억제와 신생혈관 생성과 관련된 세포 증식의 이상과 관련이 되며, 또한 VEGF가 survivin의 발현을 촉진시켜 survivin의 작용을 강화시킨다. 여러 암과 마찬가지로 후두암에서도 면역화학조직염색으로 암의 병기와 예후가 단백의 발현의 차이를 나타내었으나, 통계적인 유의성을 보이지는 않았다 그러나, VEGF의 발현 정도가 높을수록 통계적인 유의성을 보이며 survivin의 발현 정도가 높았다. 향 후 많은 예를 통해 VEGF와 survivin의 발현 사이의 연관성에 대한 연구가 필요할 것으로 생각된다.

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