교신저자：신승헌, 705-718 대구광역시 남구 대명4동 3056-6  대구가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   만성 부비동염은 만성 질환 중 가장 흔한 질병의 하나로 새로운 항생제의 개발과 부비동 내시경수술 등 새로운 치료법의 도입에도 불구하고 발생 빈도는 감소되지 않고 있다. 이처럼 만성 부비동염의 치료가 어려운 것은 병인으로 알레르기, 점액섬모수송 이상, 해부학적 이상 등 다양한 인자가 관여하기 때문이다.^1,2) 최근 진균과 세균 초항원의 역할에 대한 관심이 증가되고 있다.^3,4) 지금까지 10만 종에 달하는 진균 중 약 20여 종이 전신감염을 유발하고 그 중 Alternaria, Cladosporium, Aspergillus, Penicillium 등이 호흡기 질환과 연관성이 있는 것으로 알려져 있다.⁵⁾ 진균성 부비동염은 수술을 시행 받은 만성 부비동염 환자의 10% 정도로 알려져 있으나 진균 배양 기술과 분자생물학적 기법의 발전으로 진단율이 증가되고 있으며, 만성 부비동염 환자 뿐 아니라 정상인의 비즙 대부분에서 진균을 배양할 수 있어 부비동염 환자의 경우 정상인과 다른 진균에 대한 면역 반응을 보일 것으로 생각하고 있다.^3,6)
   만성 부비동염은 비강 점막의 염증성 비후와 조직과 비즙 내 호산구 증가 소견을 보이며, CD4⁺ T림프구 등 염증세포의 증가를 특징으로 한다. Major basic protein(MBP)을 이용한 면역형광염색을 시행한 경우 혈액에서 조직으로 이동한 호산구는 정상적인 형태를 유지하고 있으나 비즙 즉 비강으로 이동한 호산구는 대부분 활성화되고 MBP를 유리하여 정상적인 구조를 유지하는 세포를 찾아보기 어렵다.⁷⁾ 호산구의 활성화는 세포 내에 존재하는 세포독성 단백물질과 사이토카인, 각종 효소를 분비시켜 비강 상피세포의 손상과 활성화를 유도하게 되고 이로 인해 비강내 염증반응이 유지, 악화된다. 
   만성 부비동염은 비부비동 점막의 염증반응이 중요한 역할을 담당한다. 비강 상피세포는 세포간 폐쇄막 등의 물리적 장벽과 세포에서 만들어진 단백물질과 효소 등으로 병인성 물질을 제거하는 방어기전을 가지고 있을 뿐 아니라 알레르기 물질에 노출되거나 세균의 침입 등 염증반응이 일어나는 경우 granulocyte-macrophage colony stimulating factor(GM-CSF), interleukin-8(IL-8), Tumor necrosis factor-α(TNF-α) 등 각종 화학물질을 분비하여 염증세포의 활성화와 이주에 영향을 미치는 등 국소 염증반응에 중요한 역할을 한다.^8,9)
   만성 부비동염 환자에서 호산구의 대부분이 비강에서 활성화가 이루어지고 이때 다양한 화학매개물질이 유리된다. 지금까지 만성 부비동염 환자에서 호산구의 수가 증가하고 활성화가 이루어진다는 보고는 있었지만 활성화된 호산구가 비부비동 점막에 미치는 영향에 대한 연구는 미흡한 상태이다. 이에 저자들은 진균에 의한 호산구의 활성화가 비강 상피세포에 직접적인 영향을 미치는지 알아보기 위해 본 연구를 시행하였다.

대상 및 방법

호산구의 분리 및 Eosinophil conditioned media(EoCM)의 생성
   호산구는 정상인의 heparin 처리된 말초 혈액을 PIPES (Sigma, St. Louis, MO, USA) 완충액과 혼합하여 Percoll액 위에 놓고 원심분리하여 과립구와 적혈구 층을 분리하였다. 적혈구는 삼투성 파괴법을 이용하여 제거하였다. 이렇게 얻어진 과립구를 항-CD16 항체로 30분간 처리한 후 magnetic cell separation 방법(Miltenyi Biotec, Sunnyvale, CA, USA)으로 호산구를 분리하였다. 호산구의 순수도는 Randolph 염색을 하여 95% 이상이었고, trypan blue를 이용한 생존율 검사에서 98% 이상임을 확인하였다.
   분리된 호산구 5×10⁵/ml을 10% fetal bovine serum을 포함하는 RPMI-1640과 Alterrnaria alternata 50 μg/ ml Aspergillus versicolor 25 μg/ml, Bipolaris sorokiniana 50 μg/ml의 진균과 함께 37℃, 5% CO₂에서 4시간 동안 배양하여 활성화를 유도하였으며, 상등액을 모아 -70℃에 냉동 보관하여 EoCM으로 사용하였다.

EoCM에 의한 비강 상피세포의 활성화 유도 
   비강 상피세포는 비내시경 수술을 시행하는 만성 부비동염 환자의 비용조직에서 분리하였다. 환자는 알레르기성 비염이 동반되지 않고, 수술 전 4주 이상 항생제, 항히스타민제, 국소 및 경구용 스테로이드제재 등의 약물 치료를 시행하지 않은 자들을 대상으로 하였다. 채취한 조직을 penicillin 100 IU/ml, streptomycin 100 μg/ml, amphotericin-B 2 μg/ml을 포함한 Ham's F-12 배양액으로 2~3회 세척 후 1% dispase(GIBCO, Grand Island, NY, USA)를 포함한 Ham's F-12에서 4℃에서 16시간 동안 처리하여 조직 표면의 상피세포를 분리하였다. 37℃에서 trypsin/EDTA로 10분간 처리하여 상피세포를 얻은 후 phosphate buffer solution으로 2회 세척하였으며, 박리된 세포들을 10 cm 플라스틱 접시에 1시간 동안 두어 섬유모세포, 근육세포와 혈관 내피세포를 제거하고, 얻어진 상피세포는 gentamycin, transferrin 5 μg/ml, insulin 5 UI/ml, epithelial growth factor 25 ng/ ml, endothelial growth supplement 15 μg/ml, triiodo-thyronin 200 pM, hydrocortisone 100 nM를 포함한 bron-chial epithelial cell basal medium으로 37℃, 5% CO₂에서 배양하였다. 상피세포의 confluent monolayer가 형성되면 배양액을 EoCM으로 바꾸어 48시간 동안 배양한 후 상등액을 얻어 -70℃에 보관하였다. 상피세포의 활성화는 상등액에 포함된 IL-6, IL-8과 GM-CSF를 ELISA법(Endogen, Rockford, IL, USA)을 이용하여 측정하였으며, IL-6는 1 pg/ml, IL-8과 GM-CSF는 2 pg/ml 이상의 민감도를 가지고 있었다.

통계 분석
   각각의 실험은 5회 이상 반복하여 그 결과를 얻고자 하였으며, Mann-Whitney U test를 이용하여 음성 대조 실험과 비교분석하였으며, 통계적 유의수준은 p<0.05로 하였다.

결     과

   Alternaria, Aspergillus, Bipolaris로 호산구의 활성화를 유도하여 얻은 EoCM으로 상피세포를 배양하여 얻은 배양액에 포함된 사이토카인은 IL-6의 경우 Alternaria로 처리한 EoCM에 의해 333.3±185.4 pg/ml, Aspergillus는 310.5±168.1 pg/ml, Bipolaris는 251.0±176.2 pg/ml로 진균으로 자극하지 않은 호산구 배양액으로 상피세포를 배양한 경우의 47.5±41.3 pg/ml 보다 유의하게 많은 양이 포함되어 있었다( p<0.05). IL-8은 Alternaria로 얻은 EoCM에 의해 558.2±240.1 ng/ml, Aspergillus 828.8±370.3 ng/ml, Bipolaris 495.5±254.6 ng/ml로 대조군의 123.9±35.0 ng/ml보다 유의하게 많은 양이 생성되었다(p<0.05). GM-CSF의 경우는 Alternaria 9640.8±4065.2 pg/ml, Aspergillus 7665.5±2761.5 pg/ml, Bipolaris 9044.8±2761.5 pg/ml로 대조군의 1116.1±3863.7 pg/ml보다 유의하게 많은 양을 포함하고 있었다(p<0.05)(Fig. 1).

고     찰

   호산구는 정상인 말초혈액에 존재하는 과립구의 2~5%를 차지하고 있으며, 알레르기성 비염과 천식, 기생충 감염, 림프종 등 생리 및 병리 기전에 관여하고 있다. 만성 부비동염은 유전적 요인, 면역학적 요인, 해부학적 요인, 환경적 요인 등이 관여하는 다인자 질환으로 조직내 호산구 증가와, IL-3, IL-5, GM-CSF 등 호산구의 생성, 활성화와 이주에 영향을 미치는 화학매개물질의 증가 소견을 보인다.¹⁰⁾ Ponikau 등³⁾은 만성 부비동염 환자의 비즙 내로 호산구가 이주하여 활성화가 이루어져 호산구에서 만들어진 MBP 등의 세포독성 물질과 화학매개물질에 의해 비강 상피세포가 손상되고 염증반응이 악화된다고 보고하였으며, 호산구의 활성화는 비강내 존재하는 진균에 대한 면역학적 방어기전에 기인하는 것으로 추정하였다. 만성 부비동염 환자의 비즙에서 진균을 배양한 경우 Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Penicillium 등이 많았는데 이는 정상인의 진균 배양 결과와 유사하였다.^3,6) 본 연구에서는 한국인의 비즙에서 흔히 발견되는 Alternaria와 알레르기성 진균성 부비동염의 주된 원인으로 알려진 Bipolaris, 호흡기 및 알레르기 염증반응의 주요 원인 진균인 Aspergillus를 이용하여 호산구의 활성화를 유도하였다. 진균은 다양한 단백질과 단백질 분해효소를 함유하고 있어 호흡기 염증반응에 관여하며, 특히 Aspergillus와 Alternaria는 기관지 천식을 악화시키는 주요 인자로 알려져 있다.⁵⁾ 진균, 특히 Alternaria로 호산구의 활성화를 유도하는 경우 superoxide와 eosinophil derived neurotoxin의 생성이 증가되며, 이 과정에 진균의 serine protease가 중요한 역할을 담당하는 것으로 보고 되었다.¹¹⁾
   비강 내로 들어온 병원균이 병원성을 나타내기 위해서는 점액섬모운동의 장애가 있거나, 상피세포에서 만들어진 살균성 단백물질에 이상이 있는 경우, 병원체에서 만들어진 각종 효소나 이들 효소에 의해 활성화된 염증세포에서 만들어진 화학매개물질에 의한 국소염증반응의 악화와 세포 손상이 일어나거나 보체 체계와 항원-항체 반응이 억제되는 경우 질병이 유발되고 조직내 병원성 물질의 침투가 용이하게 이루어진다.^9,12) 진균의 항원성 물질과 단백질분해효소들은 직접 상피세포의 탈피를 유도할 뿐 아니라 호흡 상피세포의 수용체와 결합, 활성화가 이루어져 염증세포의 동원과 염증반응의 유지 악화에 관여한다. 집먼지 진드기 등의 호흡기 항원이 가지는 단백질 분해효소 또한 상피세포의 화학매개물질 생성을 유도한다. 비강 상피세포의 활성화가 이루어지는 경우 IL-1β, IL-6, IL-8, eotaxin, GM-CSF 등 다양한 화학매개물질을 만들어 낸다.^9,13) IL-6는 식세포에서 만들어져 림프구를 활성화시켜 항체의 생성을 유도하는 면역 및 염증반응에 관여 한다. IL-8은 림프구와 혈관내피세포에서 만들어지는 강력한 호중구 화학주성을 가진 chemokine으로 호중구의 탈과립을 유도하기도 한다. 많은 양의 IL-8은 호산구의 화학주성에도 관여한다. GM-CSF는 림프구, 상피세포, 혈관내피세포, 비만세포 등에서 분비되어 호산구의 생성, 이주, 수명 연장, 활성화에 관여한다. 본 연구에서 진균으로 호산구를 자극하고 활성화를 유도하여 세포외 공간으로 많은 화학매개물질을 유리하게되는데 이들 물질을 포함하고 있는 EoCM으로 비강 상피세포의 활성화를 유도한 경우 Alternaria, Aspergillus, Bipolaris 모두에서 IL-6, IL-8, GM-CSF의 생성이 촉진 되었다. 이는 진균으로 자극하지 않은 호산구 배양액으로 상피세포를 배양한 경우보다 유의하게 많은 양이 생성되어 비강 내에 존재하는 진균에 의해 활성화된 호산구에서 만들어진 여러 가지 화학매개물질에 의해 비강 상피세포의 활성화가 이루어진다는 사실을 알 수 있었다. 즉 비강내 존재하는 진균에 대한 면역방어기전에 의해 호산구가 활성화되어 진균을 제거함과 동시에 이 과정에서 만들어진 여러 물질에 의해 상피세포에 대한 세포독성과 활성화를 유도하게 되어 비강내 염증을 악화시키고 만성화시키는 것으로 생각된다. 호흡 상피세포에서의 점액 생성은 platelet activating factor, elastase, leukotriens, IL-4, eosinophil cationic protein 등에 영향을 받는데,^14,15) 저자들의 EoCM을 이용한 예비연구에서 EoCM에 의해 비강 상피세포의 점액유전자(MUC-4, MUC-5AC, MUC8) 발현에는 영향을 미치지 않았다(data not shown). 향후 호산구에서 유리된 화학매개물질 중 어느 성분에 의해 상피세포가 활성화되며, 점액유전자 및 점액 생성에 영향을 미치는지에 대한 연구가 필요하겠다. 
   이상의 결과를 종합해 보면 비강내 존재하는 진균에 의해 호산구가 활성화되고 이때 만들어진 화학매개물질에 의해 비강 상피세포의 활성화가 이루어져 염증성 사이토카인이 생성됨을 알 수 있었다. 그러나 본 연구에서는 호산구에서 만들어진 화학매개물질 중 어느 성분이 상피세포의 활성화에 영향을 미치는지 알 수 없었으며, 연구에 사용된 진균의 농도가 만성 부비동염 환자의 비강 진균의 농도를 대변할 수 있는지 알 수 없다. 또한 사용된 진균이 환자에서 배양된 것이 아니라 냉동 건조된 진균으로 생체에 존재하는 진균과 다른 병원성 혹은 항원성을 가질 수 있어 향후 비강에서 배양 된 진균을 이용한 연구가 필요할 것이다.

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