교신저자：한경열, 330-721 충남 천안시 봉명동 23-20  순천향대학교 의과대학 이비인후과학교실
교신저자：전화：(041) 570-2767 · 전송：(041) 579-9022 · E-mail：meditatorhan@hanmail.net 
*저자 현 소속：강릉아산병원 이비인후과 

서     론

   표면활성단백 A(human surfactant protein A, SP-A)는 폐표면활성제(human pulmonary surfactant, PS)를 구성하는 단백질로서 폐표면활성제 본래의 기능인 폐 표면장력의 저하 및 유지 기능 이외에도 폐의 숙주방어와 염증반응에 중요하게 관여하는 것으로도 알려져 있다.¹⁾
   이러한 SP-A는 2형 폐포 세포 및 clara cell에서 분비되나, 최근의 연구에 의하면 다른 부위 즉 이관 및 부비동에서도 분비되고 있다고 보고되고 있다.²⁾ 표면활성제는 표면장력을 감소시키므로 이관의 개관압력과 관련된 정상생리에 매우 중요하고, 이관에서 염증 반응 및 면역에도 관여한다.³⁾ 이에 저자들은 삼출성 중이염군과 정상대조군의 SP-A 유전자 대립형질을 비교분석하여 SP-A가 삼출성 중이염의 병인에 관여하는지를 알아보고자 본 연구를 시행하였다. 

대상 및 방법

대  상 
   2003년 5월부터 2004년 10월까지 본원 이비인후과에 내원한 1~6세의 환아 중 2회 이상의 삼출성 중이염의 병력이 확인되면서 이학적 검사에서 편도비대가 관찰되지 않았고, 부비동단순촬영에서 아데노이드 비후나 부비동염의 소견없이 고막운동성계측에서는 삼출성 중이염으로 진단된 후, 1개월 이상의 항생제 치료 후에도 호전이 없었던 환아에서 고막 절개를 시행하여 중이 저류액이 검출되고 중이 환기관 삽입술을 시행 받은 38명(남：21명, 여：17명, 평균연령：3.2세)을 환자군으로 하였고, 신생아실에 재원 중인 정상 신생아 55명(남：29명, 여：26명)을 대조군으로 하여 이들로부터 채취한 전혈 2 ml로부터 아미노산 염기 서열의 차이를 이용하여 SP-A의 유전자형을 분석하였다. 

DNA 추출 
   채취한 전혈 2 ml를 EDTA 용기에 넣고 -70℃에 보관하였다. Genomic DNA는 Puregene DNA Isolation Kit (Gentra Systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 
전혈에서 추출하였다. 이를 간단히 기술하면, 전혈 2 ml를 EDTA 용기에 담고 -70℃에서 냉동 보관한 후 1×SSC 버퍼 160 μl를 첨가하여 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후 1×SSC 버퍼 300 μl를 첨가하고 원심분리한 후, 침전물에 1.2 M NaOAc 75 μl, 10％ SDS 5 μl와 proteinase K(20 mg/ml H₂O) 1 μl를 섞었다. 55℃ 항온수조에서 1시간 동안 방치한 후, phenol/chloroform/isoamyl alcohol(25：24：1) 100 μl를 첨가하여 30초 동안 섞고, 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 1.5 ml 미세 원심분리관에 상층부를 조심스럽게 옮기고, chloroform 100 μl를 첨가한 후 30초간 잘 흔들어 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 그 후 새로운 1.5 ml 미세 원심분리관에 상층부를 조심스럽게 옮기고, 차가운 100％ ethanol(-20℃ 보관) 500 μL를 첨가하여 -20℃에 20분간 방치하였다. 12,000 rpm에서 2분간 원심분리한 후 상층액을 버리고 침전된 침전물에 80% ethanol(4℃ 보관) 1 ml를 첨가하여 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 이후 상층액을 버리고 speed-vac에서 10분간 침전물을 건조한 다음, 증류수 50 μl에 침전물을 녹이고 genomic DNA를 55℃ 항온수조에서 1시간 동안 용해한 후 -20℃에 보관하였다. 추출된 DNA는 PCR을 위하여 50 ng/μl로 희석시켰다. 

SP-A의 유전자 분석(Genotyping of SP-A genes)
   SP-A의 유전자 분석은 PCR-cRFLP 방법을 사용하였다(Fig. 1, Table 1, 2 and 3).⁴⁾

중합효소 연쇄반응(Polymerase-chain reaction：PCR) 증폭
   SP-A1과 SP-A2 유전자는 3.3 kb의 크기로서 전혈로부터 추출하였다. SP-A1은 유전자 특수 sense 시발체(gene specific sense primer)인 326과 antisense 시발체(gene specific antisense primer)인 68A로, SP-A2는 유전자 특수 sense 시발체인 327과 antisense 시발체인 68A로 증폭시켰다. PCR 증폭의 조건은 1.5 μl 10×Buffer Ⅰ과 Buffer Ⅱ(Roche, Basel, Switzerland), 2.4 μl dNTPs(각각 1.25 mM), 0.3 μl 시발체 그리고 0.52 unit Expand Long enzyme(Roche, Basel, Switerland)를 혼합하여 95℃ 2분간 1회, 95℃ 30초간 1회, 58℃ 30초간 1회, 72℃ 3분간 33회, 마지막으로 72℃ 5분간 1회 증폭시켰다. 증폭된 PCR 생성물은 1% 아가로스 겔에서 ethidium bromide로 염색하여 전기영동하였다. 

제한 효소 분석(Restriction endonuclease analysis)
   (1) SP-A1 유전자의 대립형질 분석을 위해 증폭된 SP-A1 PCR 생성물을 시발체 787/765, 767/768, 788/21를 이용하여 2차로 증폭시킨 후 19, 50, 62, 133, 219번째에 위치한 아미노산을 결정하는 뉴클레오티드(nucleotide)를 선택적으로 자르는 제한효소를 이용하여(PCR-cRFLP-based methodology) 각 위치를 자른 후 전기영동하여 염기서열의 차이를 확인하였다(Fig. 2).
   (2) SP-A2 유전자의 대립형질 분석을 위해 증폭된 SP-A2 PCR 생성물을 시발체 726/96, 727/21, 799/28A, 805/ 494를 이용하여 2차로 증폭시킨 후 9, 91, 140, 223번째에 위치한 아미노산을 결정하는 뉴클레오티드를 선택적으로 자르는 제한효소를 이용하여(PCR-cRFLP-based method 를 확인하였다.

통계 분석
   삼출성 중이염군과 대조군 간의 비교는 Fisher의 정확검정법으로 검증하였으며, odds ratios의 95%신뢰구간은 Woolf(logit) 방법에 의하여 계산하였다. 통계처리는 SPSS(version 11.5)와 PHASE(version 2.0)를 이용하였고, 통계학적 유의수준은 p<0.05로 하였다.

결     과

   38명의 삼출성 중이염군과 정상 신생아 55명의 대조군으로 구분하여 아미노산 염기 서열의 차이에 의해 SP-A의 유전자형을 분석하여 아래와 같은 결과를 얻었다(Table 4).

정상 신생아에서 SP-A의 유전자 대립형질 분포 및 빈도
   (1) SP-A1에서는 6A, 6A², 6A³, 6A⁴, 6A⁵, 6A⁸, 6A¹⁰, 6A¹¹, 6A¹², 6A¹³ 등 10개의 대립형질이 발견되었다. 6A³가 41.8%로 가장 많은 빈도를 보였고, 6A² 29.1%, 6A⁴ 21.8%, 6A 1.8%, 6A⁸ 1.8% 순의 빈도를 보였다.
   (2) SP-A2에서는 1A, 1A⁰, 1A¹, 1A², 1A³, 1A⁵, 1A⁶, 1A⁷, 1A⁸, 1A⁹, 1A¹¹, 1A¹² 등 12개의 대립형질이 발견되었다. 1A⁰가 43.6%로 가장 많은 빈도를 보였고, 1A 12.7%, 1A⁵ 10.9%, 1A¹ 9.1%, 1A² 9.1%, 1^A8 7.3% 순의 빈도를 보였다.

삼출성 중이염군에서 SP-A의 유전자 대립형질 분포 및 빈도
   (1) SP-A1에서는 6A², 6A³, 6A⁴, 6A¹⁰, 6A¹³, 6A¹⁵, 6A¹⁸, 6A²⁰ 등 8개의 대립형질이 발견되었다. 6A²가 44.7%로 가장 많은 빈도를 보였고, 6A³ 21.1%, 6A⁴ 15.8%, 6A¹⁸ 7.9% 순의 빈도를 보였다.
   (2) SP-A2에서는 1A, 1A⁰, 1A², 1A⁸ 등 4개의 대립형질이 발견되었다. 1A⁰ 47.4%, 1A² 36.8%, 1A 13.2%, 1A⁸ 2.6% 순의 빈도를 보였다.

삼출성 중이염군과 대조군에서 SP-A 유전자 대립형질 분포 및 빈도의 비교
   (1) SP-A1에서 6A²는 삼출성 중이염군에서 대조군과 비교하여 통계적으로 유의하게 높은 빈도를 보였으며, 6A³는 대조군에서 통계적으로 유의하게 높은 빈도를 보였다.
   (2) SP-A2에서 1A²는 삼출성 중이염군에서 대조군과 비교하여 통계적으로 유의하게 높은 빈도를 보였다.

고     찰

   표면활성제는 지질과 인지질 및 4가지 표면활성단백(SP-A, SP-B, SP-C, SP-D)으로 이루어진 복합체로 특히 페 표면활성제는 미숙아에서 결핍될 경우 신생아 호흡곤란증(respiratory distress syndrome)을 일으킬 수 있는 중요한 물질이다. 최근에는 표면활성제가 이관에서도 분비된다는 사실과 동물실험에서 비강으로 분무기(nebulizer)나 계량흡입기(metered dose inhaler, MDI)를 이용하여 표면활성제를 흡입시키면 이관개구압력이 낮아지고 중이염의 유병기간이 단축된다는 결과들이 보고 되면서,⁵⁾⁶⁾ 이관에서의 표면활성제의 기능과 중이염과의 관계에 대한 연구들이 활발히 이루어지고 있다. 
   SP-A는 이관의 표면활성 단백 중 가장 큰 성분을 차지하며 섬모세포로부터 분비되는 것으로 알려져 있다. 인간의 SP-A유전자는 10q22-q23 염색체에 위치하고 있는데, 2개의 SP-A유전자(SP-A1, SP-A2)와 1개의 위 유전자(pseudogene)로 구성되어 있다.⁷⁾ SP-A유전자는 4개의 coding exons을 가지고 있으며, 각각의 유전자에서 생산된 단백질은 개별적으로도 생물학적인 활성이 있으며, 2개의 단백질이 합쳐서도 활성을 나타낸다.⁸⁾ 
   SP-A는 아미노산의 차이에 의하여 구분되어지는 각각의 대립형질(allele)을 가지고 있는데(Table 1), 이러한 서로 다른 대립형질은 서로 다른 아미노산에 기인하는 단백 특성에 의하여 기능적으로도 차이가 나게 된다. 최근의 연구에서는 이러한 대립형질에 따라 염증반응 시 오존(ozone)에 노출되었을 경우 대식세포(macrophage)가 사이토카인(cytokine)을 생성하는 데 차이가 있는 것으로 알려져 있으며,⁹⁾ 표면활성단백이 lipopolysaccharide(LPS)와 결합하여 지방소포(lipid vesicle)를 형성하는 정도와 SP-A mRNA의 발현에도 정량적인 차이도 있는 것으로도 연구되고 있다.¹⁰⁾¹¹⁾ SP-A1인 경우 6Aⁿ, SP-A2인 경우 1Aⁿ으로 표시되며, 이러한 coding 부위의 염기 서열이 다른 점을 이용하여 지금까지 밝혀진 유전자 대립형질로는 SP-A1은 6A, 6A^1-20, SP-A2는 1A, 1A^0-13까지 밝혀졌으며, SP-A1의 6A, 6A², 6A³, 6A⁴ 그리고 SP-A2의 1A, 1A⁰, 1A¹, 1A², 1A³, 1A⁵의 대립형질이 각각 1% 이상의 분포를 보이고 있다.¹²⁾ 
   정상 신생아에서 SP-A1의 빈도와 분포가 알려진 미국과 핀란드의 경우 6A²의 빈도가 월등히 높은 것과 다르게¹³⁾¹⁴⁾ 우리나라에서는 6A³의 빈도가 높은 것을 볼 수 있었다. SP-A2 경우에는 1A⁰의 빈도가 높은 것은 미국, 핀란드와 같았으나,¹³⁾¹⁴⁾ 우리나라에서는 1A⁵의 빈도도 상대적으로 높은 것을 볼 수 있었다. 이와 같은 종족 간의 SP-A의 대립형질 간에 빈도의 차이는 발병 원인, 치료, 예후 등에 참고가 되어야 할 것이다.
   본 연구에서 SP-A1 중 6A²는 삼출성 중이염군에서 대조군과 비교하여 통계적으로 유의하게 높은 빈도를 보였으며, 6A³는 대조군에서 통계적으로 유의하게 높은 빈도를 보였다. 6A²가 삼출성 중이염군에서 높은 빈도를 보인 것은 핀란드의 결과¹⁵⁾와 유사하였으나, 핀란드의 경우는 재발성 중이염(reccurent otitis media)을 대상으로 한 것이고 본 연구에서는 삼출성 중이염을 대상으로 조사하였다. SP-A2에서는 1A²가 삼출성 중이염군에서 대조군과 비교하여 통계적으로 유의하게 높은 빈도를 보였다. SP-A2 중 1A²는 9, 91, 140, 223번째 아미노산이 CGCC로 이루어진 대립형질로서, 본 연구의 경우 9.1%로 각각 13%와 9%인 핀란드와 미국의 경우와 비슷한 빈도를 보였으나,¹⁶⁾¹⁷⁾ 삼출성 중이염군에서는 월등히 높은 빈도를 보였다. 
   이상을 종합하여 보면 유전자 6A², 1A²는 삼출성 중이염에 대해 유발 인자와, 6A³는 보호인자와 연관된 가능성이 있을 것으로 추정할 수 있다. 본 연구에는 정상 소아집단 대조군 지정의 어려움으로 환자군과 연령이 정확하게 일치할 수는 없는 정상 신생아군을 대조군으로 설정하는 제약이 있었다. 그러나, 각 유전자의 RNA나 표면활성단백의 발현을 비교하지 않는 유전적 대립형질만의 비교라면 연령의 정확한 일치에 대한 고려 없이도 본 연구의 결과가 의의를 가질 수 있을 것으로 생각된다. 앞으로 연령을 고려한 대조군의 설정 및 대립형질 6A², 6A³, 1A²에 대한 직접적인 염기서열분석(DNA sequence analysis)과 이관에서 얻어진 단백질이나 RNA의 정량, 정성분석을 시행한 추가연구가 필요할 것으로 사료된다.

결     론

   삼출성 중이염군과 정상 신생아 대조군에서 아미노산 염기 서열의 차이에 의해 SP-A의 유전자 대립형질의 분포 및 빈도를 비교 분석한 결과, SP-A1에서 6A²는 삼출성 중이염군에서 대조군과 비교하여 통계적으로 유의하게 높은 빈도를 보였으며, 6A³는 대조군에서 통계적으로 유의하게 높은 빈도를 보였다. SP-A2에서는 1A²이 삼출성 중이염군에서 대조군과 비교하여 통계적으로 유의하게 높은 빈도를 보였다.
   이상의 결과로 삼출성 중이염에 대해 유전자 6A², 1A²는 유발 인자와, 6A³는 보호인자와 연관이 있을 가능성이 있는 것으로 생각되며, 대립형질 6A², 6A³, 1A²에 대해서 염기서열분석(DNA sequence analysis) 및 이관 표면활성 단백과 RNA의 정량, 정성분석을 통한 추가연구가 필요할 것으로 사료된다. 

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