교신저자：여상원, 137-701 서울 서초구 반포동 505번지  가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   최근 쥐의 복막내 국소염증 모델에서 복강내 비 특이적 면역자극제인 lipopolysaccharide(LPS)를 주입 후 구심성 미주신경 경로를 통해 전염증성 사이토카인(Proinflammatory cytokine)이 중추신경계로 신호를 전달한다는 내용이 보고 되었다.¹⁾ 또한 후두자극과 염증에 의해 사이토카인이 구심성상 후두신경을 따라 중추성 후두신경회로에 영향을 주는 신경면역학적 작용을 증명하여 기능적 생리학적 변화를 유발할 수 있다는 보고도 있었다.²⁾ 이와 같이 말초감각기의 면역자극이 다양한 경로를 통해 중추신경계와 상호 교통을 한다는 연구가 지속적으로 보고 되고 있다.^3,4) 
   내이에 존재하는 청신경도 구심성 미주신경처럼 신경 말단부에서 생성된 염증 전구물질이 중추신경계로 신호를 전달하여 청각신경계에 직접 영향을 미칠 가능성이 있다. 예로 돌발성 난청의 경우 동반되는 현훈, 이명 등 다양한 청각증상이 있고 시간 경과에 따른 자연회복이 되는 점은 청신경세포의 손상에 의한 말초신경계 병인만으로 설명이 어렵다. 그러나 말초 청각기관과 중추신경계와의 상호 신경세포학적 작용이 연구된 바 없다. 
   따라서 저자는 고실내 LPS 주입을 통해 실험적으로 만들어진 중이강내 염증성 자극으로 중추청각계에 전염증성 사이토카인인 interleukin-1 beta(IL-1β)가 발현되는지를 확인함으로써 말초 감각기에서 구심성 청신경계를 통한 중추신경계로 전염증성 사이토카인이 영향을 미칠 수 있는지를 알아보고자 하였다. 또한 중추청각신경활성의 표식자인 c-fos 발현 정도와 부위를 확인하여 전염증성 사이토카인의 발현과의 연관성을 알아보고자 하였다. 또한 생리 자극인 소리자극 후 c-fos 및 IL-1β의 발현을 관찰함으로써 염증성 자극 시 청각신경계에 미치는 작용과 비교 관찰하고자 하였다.

재료 및 방법 

소리에 의한 물리적 자극
   체중이 약 300 g정도 되는 Sprague-Dawley 흰쥐(수컷) 10마리를 실험에 이용하였다. 쥐를 ketamine hydrochloride(80 mg/kg) 근육 주사로 마취시킨 후 실험 전 쥐의 양측 고막을 현미경으로 관찰하여 중이염 및 고막천공의 이상이 없는지 확인하였다. 대조군 2마리와 소리자극군 8마리를 무작위로 2마리씩 나누어 나무로 제작한 상자 안에 넣고 α-chloralose(Sigma, Steinhein, Germany)(60 mg/kg)를 복강 내로 주입하여 소리를 들려주는 동안 마취를 유지시켰다. 소리자극으로 125~8,000 Hz, 90 dB의 백색잡음을 sound level meter(type 3604, Yokogawa Hokushin Electric, Japan)로 확인한 후 3시간 동안 들려주었다. 대조군도 같은 시간 동안 같은 방법으로 마취를 유지시켰다.
   소리를 들려준 직후 2마리는 4% paraformaldehyde와 PBS(phosphate buffered saline)로 심장 관류하여 와우핵(cochlear nucleus)과 하구(inferior colliculus)가 포함된 뇌를 적출하였고 20% sucrose solution으로 cryoprotec-tion 시킨 후 냉동 동결 블록을 만들어 영하 70℃로 냉장고에 보관하였다. 나머지 군은 다시 동물실에 두었다가 소리자극 시작부터 6시간 후, 24시간 후, 3일 후에 동일한 방법으로 뇌를 적출하였다. 

LPS를 이용한 염증자극
   체중이 약 300 g정도 되는 총 10마리 Sprague-Dawley 흰쥐(수컷)를 실험에 이용하였다. 쥐를 ketamine hydrochloride(80 mg/kg) 근육 주사로 마취 시킨 후 현미경 하에서 양측 고막을 관찰하여 이상이 없음을 확인하고 일측 고실 내로 LPS(Sigma, Steinhein, Germany)(100 μg/ 50 μl)를 micropippet을 이용하여 서서히 주입하였으며 α-chloralose(60 mg/kg)를 복강 내에 주입하여 마취를 유지시켰다.
   LPS 주입 후 3시간 후, 6시간 후, 1일 후, 3일 후, 7일 후 각각 2마리씩 위와 동일한 방법으로 심장 관류시키고 냉동 동결 블록을 만들었다. 

조직 슬라이드 제작
   뇌의 냉동 동결은 뇌교(pons)하방에서 연수(medulla oblongata) 상부까지 구심성 청신경부위가 포함되도록 하여(bregma로부터 -11.80 mm~-8.30 mm) 40 μm 두께로 첫 번째 절편은 c-fos 두 번째 절편은 IL-1β를 위한 각기 다른 2가지 연속되는 면역조직학적 염색 슬라이드를 얻었다. 

c-fos와 IL-1β에 대한 Free-floating 방법을 이용한 면역조직학적 염색과 면역 형광 염색 
   얻어진 절편을 PBS가 담긴 24 well 세포 배양 용기에 순서대로 담고 10분씩 3회 혼합기에서 세척하였다. 3% H2O2(in methanol) 용액에 2분간 전처치 후 PBS로 10 분씩 3회 세척하였다. c-fos와 IL-1β 염색 모두 10% normal goat serum(Zymed, San Francisco, CA)으로 20분 간 blocking 하였다. 1차 항체는 1：5000으로 희석된 c-fos 1차 항체(rabbit polyclonal serum)(Calbiochem, Darmstadt, Germany)와 1：300으로 희석된 IL-1β(rabbit polyclonal Ig G, Santa Cruz, Santa Cruz, CA)를 투여하고 72시간 동안 4℃ 냉장고에 보관하여 충분히 반응하도록 하였다. 
   조직을 실온에 30분간 둔 후 10분 동안 3회 PBS로 세척하고 N-histofine(Immuno-peroxidase polymer)(Nichirei, Tokyo, Japan)으로 1시간 반응 후, PBS로 10분간 3회 세척하였다. DAB(Zymed)로 2분간 발색하고 PBS로 10분씩 3회 세척하였다. 조직을 슬라이드로 옮긴 후 하루 동안 공기 중에서 건조시켰다.
   탈수화 과정을 위해 70%, 80%, 90%, 100% 에탄올에 순서대로 진행하여 탈수시키고 100% 에탄올에 다시 15분간 탈수시킨 후 Xylene Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ로 투명화 단계를 거쳐 Canada Balsam으로 표본제작하였다. 
   면역 형광 염색을 위해 25 μm 두께로 슬라이드를 제작하여 위의 방법과 같이 일차항체 반응 후 goat antirabbit Ig G secondary antibody conjugated with fluorescent isothiocyanate(FITC)(Zymed)와 반응시킨 후 PBS로 3회 세척하고 형광 봉입제(Dako Cytomation, Carpinteria, CA)를 첨가하여 형광현미경 하에서 IL-1β의 활성도를 관찰하였다.

신경세포핵 내에서의 양성세포의 정량적 분석
   각각 얻어진 연수 상부에서 다리 뇌 하부까지의 연속 절편 중 청각 회로가 있는 부위를 40배와 100배의 배율 하에서 Swanson의 Brain Map：Structure of the Rat Brain을 참고하여 c-fos 및 IL-1β에 대한 면역학적 양성 세포를 추적하였다. c-fos 및 IL-1β에 대한 연속 절편의 영상을 추적하여 활성화되는 청각 구심성 신경핵에서 c-fos 와 IL-1β 양성세포의 발현을 비교 분석하였다. SPSS 11.5.0을 이용하여 좌, 우측의 발현비교는 Wilcoxon 부호 순위 검정, c-fos와 IL-1β의 발현부위에 대한 상호관련성은 Spearman’s correlation을 이용하여 통계분석을 실시하였다. 통계적인 유의수준은 5% 미만으로 하였다.

결     과

백색잡음에 의한 뇌간에서 구심성 청각회로 및 비 청각회로의 활성화
   환경잡음이 20 dB인 상태에서 소리자극을 주지 않은 대조군에서도 c-fos는 청각핵인 와우핵, 능형체, 가쪽띠, 하구에서 일부 발현되었고 비 청각핵인 청반(locus coeruleus), 가측 팔곁핵(lateral parabrachial nucleus)에서 발현되었다(Fig. 1). 대조군에서는 IL-1β는 가쪽띠와 하구, 청반 등에서 일부 관찰되었다. 백색잡음으로 자극한 쥐에서는 c-fos와 IL-1β는 청각회로를 따라 와우핵, 능형체, 가쪽띠, 하구에서 발현이 증가되었으며 비 청각계인 청반에서의 발현도 증가하였다(Fig. 2). 시간경과에 따른 변화는 3시간 동안 소음자극을 준 직후에서 6시간 사이에 c-fos와 IL-1β의 발현이 가장 뚜렷하였고 시간이 경과하면서 감소하였다(Fig. 3). c-fos와 IL-1β에서 각각 좌 우 발현의 차이는 보이지 않았으며(p=0.952, p=0.170), c-fos와 IL-1β의 발현부위는 상호관련성을 보였다(r=0.3668, p=0.028). 

중이강내 면역 염증성 자극 후에 뇌간에서의 IL-1β의 발현
   LPS 주입 후 c-fos가 전정청각계인 와우핵, 능형체, 가쪽띠, 하구와 전정핵을 따라 발현되었고 비 청각핵으로는 삼차신경중간뇌핵(mesencephalic trigeminal nucleus), 청반, 가측 팔곁핵에서 발현되었다. IL-1β도 전정청각계인 와우핵, 능형체, 가쪽띠, 하구와 전정핵에서 발현되었고 비 청각핵인 삼차신경 중간뇌핵, 청반, 가측 팔곁핵에서 발현되었다(Fig. 4). LPS 주입한 후 3시간 군에서 대조군과 같은 부위의 c-fos의 활성을 보였다. 소리자극에 비해 c-fos의 양적 증가는 보이지 않았으나 대조군과 비교하여 뚜렷한 IL-1β 발현증가를 확인할 수 있었다. 시간 경과에 따른 IL-1β의 발현은 LPS 주입 후 24시간 내에 최대로 발현된 후 시간이 지나면서 감소하였다(Fig. 5). 자극측과 비 자극측 청각계 발현 비교에서는 c-fos 및 IL-1β 모두 양측의 차이는 없었으나(p=0.236, p=0.238), IL-1β는 LPS를 주입한 동측의 와우핵에서만 발현되었다. c-fos와 IL-1β의 발현은 강한 상관 관계를 보였다(r=0.703, p=0.000). 

고     찰

   청각기능과 관련된 다양한 신경학적 증상은 아직까지 그 기전이 명확히 밝혀지지 않고 있으며 그 병태생리학적 기전에 대해서도 확인된 바가 없다. 돌발성 난청, 노인성 난청과 같은 질환의 경우 단순히 말초 감각기의 신경세포의 이상만으로 다양한 청각 증상의 발현을 이해하기 어려우며 자연회복에 따른 청력 회복의 기전을 설명하기가 어려웠다. 이는 말초 감각기 뿐만 아니라 중추신경계가 관련되어 있음을 추측하게 한다. 만성 중이염 환자의 급성기에 발생하는 이명과 현훈 등은 말초 감각기의 염증 상태에 따른 여러 신경학적 증상의 발생과 관련이 있으며 말초 감각기와 중추 핵 간의 상호 작용의 가능성도 배제할 수 없다.
   전염증성 사이토카인은 비 특이적 면역자극제인 LPS에 의해 비교적 강력하게 유도되는 당 단백으로 IL-1β, tumor necrosis factor(TNF-α), IL-6가 주된 전염증성 사이토카인이며, 특히 IL-1β는 급성염증기의 중추신경계를 조절하며 말초 면역자극에 대해서도 생리학적, 신경내분비학적, 행동반응적으로 중요한 역할을 한다.²⁾
   말초감각기의 국소자극이 중추신경계에 미치는 영향에 대한 연구로 최근 미주신경계에서 국소 감각기 말단의 염증성 자극 시에 구심성 말초신경계의 상행경로를 따라 전염증성 사이토카인인 IL-1β가 교통하는 것이 보고되었다.^1,2) 이와 같은 상호간의 신호전달은 국소 면역자극과 중추신경계사이에서 관찰되어 그 경로에 대해 많은 연구가 시도되어 왔다.^4,5,6,7) 대부분의 전염증성 사이토카인이 비교적 분자량이 크고 친수성인 특징을 지니고 있어 뇌-혈관 장벽을 통과 하지 못하므로 신호전달이 뇌-혈관 장벽이 약한 뇌실주위기관이나 능동적 전달기전에 의해, 혹은 내피세포가 중재된 경로에 의할 것이라는 가정이었다.^5,8) 최근 말초 복강에 LPS를 투여한 염증성 자극의 경우 구심성 미주신경계를 통해 전염증성 사이토카인인 IL-1β가 중추 미주신경 관련 핵에서 활성화되고 횡경막하 미주신경을 절단 시에는 위와 같은 반응이 나타나지 않는 것이 보고 되기도 하였다.⁹⁾ 이는 미주신경이 분지하는 국소 염증성 자극에 의해 중추성 반응이 유도되는 것이 주로 구심성 미주신경계를 통하여 이루어질 수 있는 것임을 암시하고 있다. 청신경계도 미주신경과 같이 청신경회로를 따라 말초자극에 의한 자극이 중추신경계에 영향을 미칠 수 있음을 생각할 수 있다. 
   비 청각핵 중 활성화된 청반(locus coeruleus)은 주로 노르아드레날린성 세포들로 구성되었으며 뇌에서 70%의 노르아드레날린을 생성하고 주의집중과 경계, 인지기능, 행동장애와 관련이 있다.^10,11) 청각계와의 관련은 여러 경로를 통해 와우핵, 하구, 시상의 내측 슬상체(medial geniculate body) 및 청각피질과도 연결되어있다. 반대로 청각피질과 내측 슬상체는 편도(amygdala)를 통해 청반과 원심성 연결을 한다. 노르아드레날린은 청각핵에 대해 자발전위를 감소시키고 청각적 대조와 시간적 분석(auditory temporal contrast and timing precision)에 영향을 미쳐 새로운 소리자극에 대해 분석과 대처를 하는 데 도움을 주는 것으로 알려져 있다.¹²⁾ 따라서 노르아드레날린성 섬유의 대부분을 담당하는 청반에서 생성된 노르에피네프린이 청각증상에 영향을 미치는 매개역할을 할 수 있을 것이다.¹³⁾ 
   본 연구에서 비교적 강한 소리자극 시 청각계 뿐만 아니라 비 청각계에서 c-fos가 활성화되고 IL-1β가 관찰되어 초기에 청각 및 비 청각계 신경세포에 대한 자극적 활성화가 발생할 수 있음을 알 수 있었다. LPS 주입 후에는 c-fos가 전정핵과 청각계핵에서 활성화되었으며 비 청각계핵에서도 동시에 활성화되었다. IL-1β는 c-fos 발현 부위와 상호 관련된 전정 청각계핵과 비청각계핵에서 발현되어 청각 기능적으로 연관된 상행성 청각경로에서 IL-1β가 발현된 것임을 알 수 있었다. 소리자극과 염증자극의 결과를 대조군과 비교하면 소리자극군이 염증자극군에 비해 청각핵에서 c-fos의 발현량이 뚜렷이 증가된 후 감소하였는데 이는 소리자극이 비교적 강한 90 dB이며 넓은 주파수 영역대를 포함한 백색잡음으로, 주파수 특이적으로 활성화되는 청각핵의 넓은 지역에서 흥분을 유도할 수 있기 때문으로 생각된다. 시간경과에 따른 비교에서 염증자극시 IL-1β의 발현이 좀 더 오래 지속되었는데 이는 염증자극이 소리자극과 달리 자극 후 일정기간 중이강 내에 남아서 지속적으로 IL-1β의 발현을 유도할 수 있기 때문으로 생각된다. LPS를 주입한 동측 와우핵에서 발현되고 그 이후로 상행 경로에서 좌우의 차이를 보이지 않은 것은 신경계의 교차로 인한 영향으로 생각된다. 본 실험에서 시행한 소리자극이나 무자극 외에도 생리식염수만을 주입한 군과 비교를 하였으면 염증자극에 보다 특이적인 발현 양상을 알 수 있었을 것으로 생각된다. 
   IL-1β는 소량만으로도 청반의 활동성 증가를 유도한다고 보고 되었다.¹⁰⁾ 따라서 염증자극 시 전염증성 사이토카인인 IL-1β가 청각 경로를 따라 복측와우핵, 가쪽 띠, 하구와 비 청각핵인 청반에 영향을 미치고 노르아드레날린성 섬유를 통해 청각핵이 다시 영향을 받는 청각회로를 가정할 수 있을 것이다. 복강내 살리실린 산 주입 후 만든 가역적인 이명 모델에서 청반, 수도관주위회색질(periaqueductal gray), 가측 팔곁핵 및 청각계인 하구의 활성화가 보고되어 청반이 하구 및 와우핵과 관련하여 청각증상을 유발시킬 수 있음을 증명하였다.^14,15,16) 또한 구심성 혹은 원심성 청신경계와 자율신경계인 변연계가 상호 관련된 이명의 신경생리학적 모델에서 생체되먹임기전에 의해 이명의 인지를 조절할 수 있음은 청각 및 비 청각핵 간의 유기적인 조절이 존재하는 것을 의미한다.¹⁷⁾ 그러므로 본 연구에서 청반에서의 IL-1β의 발현은 IL-1β가 청각핵의 청각대조와 시간적 분석에 영향을 미쳐 이명과 관련된 증상발현을 유발할 수 있음을 시사하는 것이다.
   본 연구에서는 정맥 주입이나 복강내 주입에 의한 전신적 반응이 아닌 말초 청각기에 LPS를 주입하였고 뇌실주위기관보다는 청각계에서 c-fos가 활성화된 부위와 연관되어 IL-1β가 발현하였으므로 뇌혈관장벽이나 뇌실주위기관으로 전염증성 사이토카인이 확산된 것이 아니라 구심성 청각신경계를 통해 IL-1β가 발현되었다고 추론할 수 있다. 즉 중이염 환자에서의 급성 염증기 혹은 원인이 밝혀지지 않고 바이러스 감염으로 추정되는 돌발성 난청환자에서의 이명 등의 단기간에 생기는 청각적 변화가 재생 불가능한 말초 와우 외유모세포의 이상보다는 원심성 혹은 구심성 청각회로 및 청반과 노르아드레날린이 관련되어 와우핵에 영향을 미쳐 난청을 유발할 수도 있는 발병기전을 생각할 수 있다. 염증자극 외에도 강한 소리자극에서 전염증성 사이토카인인 IL-1β가 발현된 것은 강한 소음 후에 일시적인 이명 등의 청각적 증상이 말단 청각기관 외에도 중추 신경계가 관련될 수 있음을 시사하나 추가적인 연구가 필요할 것이다. 본 연구에서 청각계와 그 외 관련된 여러 핵에서 IL-1β가 발현됨으로써 말초 청각기관 자극에 대한 중추청각계 반응기전에 전염증성 사이토카인 IL-1β가 관여되어 있음을 알 수 있었다. IL-1β가 와우신경을 통해 중추신경계로 전달되는 것을 밝힘으로써 IL-1β의 발현이 상행신경계를 통한 발현임을 알 수 있었다. 즉 IL-1β가 염증성 자극 시 국소 신경면역계를 통해 전달되어 중추의 청각계는 물론, 비 청각신경계에 영향을 미칠 수 있음을 확인함으로써 말초염증성 변화가 중추청각계 이상의 한 원인이 될 수 있음을 밝힐 수 있었다. 
   결론적으로 국소 말초성 변화에 의한 중추신경계에 영향을 미치는 기전으로 신경면역학적 작용이 관여함을 확인할 수 있었으며 이를 통해 중추청각신경계에 발생하는 다양한 청각 전정질환들의 병태생리의 규명과 새로운 치료방법의 개발에 도움이 될 수 있으리라 생각된다. 

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