교신저자：윤주헌, 120-749 서울 서대문구 신촌동 134  연세대학교 의과대학 이비인후과학교실
교신저자：전화：(02) 361-8484 · 전송：(02) 393-0580 · E-mail：jhyoon@yumc.yonsei.ac.kr

서     론

   점액(mucus)의 과분비는 비염, 부비동염, 기관지염, 폐렴, 낭포성 섬유증 등 다양한 호흡기 질환의 주요 병리현상 중 하나이다. 이런 점액에서 주성분을 차지하는 점소(mucin)는 고도로 당질화된 고분자의 당단백질로 점액의 점성도를 결정하고 흡입된 독성물질로부터 기도 점막을 보호하는 역할을 하고 있다. 결국 점소의 과분비는 점액의 점성도를 증가시켜 임상적으로는 비루나 객담의 배출을 어렵게 만든다는 것이 가장 큰 문제점이고 실제적으로도 호흡기 염증 질환은 점액의 과분비와 관련이 있으며 이는 기도의 폐쇄를 일으킬 수도 있다.¹⁾
   최근까지 사람에서는 20가지의 점소 유전자들이 발견되었다. 대부분 영역(domain)을 기준으로 막 결합 점소(membrane-bound mucins)와 겔 형성 점소(gel-forming mucins)로 나누어지며 MUC1, MUC3, MUC4, MUC11, MUC12, MUC17, MUC18, MUC20은 전자에 속하며 MUC2, MUC5AC, MUC5B, MUC6, MUC7, MUC9, MUC19는 후자에 속한다.²⁾ 그러나 MUC8을 포함한 다른 점소 유전자들에 대해서는 아직 정확히 규명되지 않았고 다양한 호흡기 질환에서 어느 유전자가 발현되는지 또한 알려지지 않았다. 따라서 호흡기 질환에 이환되었을 때 그 점액의 점성도를 결정하는 점소 유전자의 확인은 점소 과분비로 인한 질환의 치료에 있어 획기적인 돌파구가 될 것이며 이를 기초로 점소 생산을 감소시키는 방법을 찾는 것 또한 우리의 과제이다.
   Prostaglandins(PGs)는 염증성 호흡기 질환을 포함한 많은 생리학적 혹은 병리생리학적 과정에 작용하는 중요한 지질 매개체로 그 중에서도 주요한 위치를 차지하는 PGE₂는 특이세포표면 수용체인 EP(E-prostanoid)와의 결합을 통해 생물학적인 작용을 하게 된다.³⁾ 지금까지 EP1에서 EP4로 명명된 4가지 EP 수용체가 확인되었고 그 중 EP2와 EP4는 사람 호흡기에서의 주요 수용체로 알려져 왔다.⁴⁾
   TNF-α, IL-1β, lipopolysaccharide와 같은 염증 매개체들은 사람 호흡상피세포에서 MUC5AC와 MUC2 유전자의 발현을 유도한다는 이전 보고⁵⁾⁶⁾와 같이 저자들은 아라키돈산(arachidonic acid) 대사산물인 PGE₂도 겔 형성 점소의 발현과 함께 나아가 호흡기 질환 환자의 위험도를 높일 수 있다는 생각을 하게 되었다.
   저자들은 먼저 정상 사람 코점막 상피세포에서 분화에 따른 EP2와 EP4 유전자의 발현 변화를 알아보았고 다음으로 겔 형성 점소 유전자의 발현과 점소 분비에 대한 PGE₂의 효과를 알아보았다. 마지막으로 PGE₂가 EP2와 EP4 유전자 발현에 영향을 미치는지를 알아보았다.

재료 및 방법

사람 코점막 상피세포의 배양과 Air-liquid interface(ALI)의 고안
   2×10⁵개의 인체 정상 코점막 상피세포(passage-2)를 반투과성 막(Transwell-clear, 24.5 mm, 0.45 μm pore size, Costar Co., Cambridge, MA)이 있는 0.5 ml의 배양액에 심었다. 여기서 사용된 배양액은 basal epithelial growth medium(BEGM)과 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)을 1：1로 혼합한 용액⁷⁾이며 세포들은 첫 9일간은 배양액에 잠긴 상태로 두었으며 이 기간동안 배양액을 첫날 그리고 그 이후로는 격일로 갈아 주었다. 9일째 배양액의 윗부분을 제거하고 아래 부분에만 배양액을 주어서 ALI를 만든 이후 배양액을 매일 갈아 주었다. PGE₂ 실험군에서, 배양된 인체 정상 코점막 상피세포는 합류 2일 후 1×10^-7M의 PGE₂로 24시간 처치하였고 PGE₂로 유도된 겔 형성 점소 유전자의 발현 증가가 AH 6809(EP2 receptor antagonist, Sigma-Aldrich Inc., St. Louis., MO) 혹은 AH 23848(EP4 receptor antagonist, Sigma-Aldrich Inc., St. Louis., MO)의 전처치로 억제되는지 알아보기 위해서 배양된 상피세포는 1×10^-5M의 AH 6809 혹은 AH 23848로 PGE₂의 처치 2시간 전에 전처치 하였다. 그 후 상부 분비물과 총 RNA를 24시간 동안 채취하였고 위상차 현미경(phase contrast microscopy)에서 세포독성의 형태학적인 소견이 없은 안정된 세포층을 관찰할 수 있었다. 또한 배양된 상피세포의 분화기능을 알아보기 위해서 이전 방법대로 합류를 이루고 난 후 2일, 7일, 14일, 21일에 총 RNA를 채취하였고 전체 세포의 총 RNA는 제조사의 방법에 따라 Trisol^®을 사용하여 동정되었다.

MUC5AC, MUC5B, MUC6, MUC7, EP2 and EP4 mRNA에 대한 reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) 
   Oligonucleotide primer를 Table 1에서 나열된 것처럼 기존에 보고된 염기서열에 근거하여 디자인하였다. Beta-2 microglobin에 대한 oligonucleotide amplimer는 RT-PCR의 대조군으로서, Clontech Laboratories(They generated a 335 bp PCR fragment)로부터 구입하였다. RT-PCR은 Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler를 이용하여 제조사의 방법대로 시행하였다. 또한 각 배양 상황에서의 상대적인 mRNA의 정량을 비교하기 위해 기존에 보고 된 비교역학분석(Comparative kinetic analysis)를 시행하였다.⁷⁾ PCR 산물은 50 ng/ml ethidium bromide를 함유하는 2% Seakem agarose gel(FMC, Rockland, ME)에서 전기영동으로 분리하여 폴라로이드 55 필름으로 사진을 찍었다. 음성군(negatives)은 Molecular Dynamics Densitometer(Sunnyvale, CA)로 스켄하였고 신호(signal)는 ImageQuant software로 분석하였다. 최종 산물(amplified products)이 mRNA에서 생기고 오염이 없었다는 것을 증명하기 위해 역전사 반응에서 역전사 효소(reverse transcriptase)를 생략하여 어떤 PCR 산물도 없음을 확인함으로써 음성 대조군(negative control)으로 삼았다. 또한 증폭된 목표 유전자에 대한 검증을 위하여 PCR 산물에 대한 sequencing(ABI 3100 Genetic Analyzer, Appleid Biosystem, Foster City, CA)을 병행하였다.

총 점소와 MUC5AC 점소의 Immunodetection과 정량
   Immuno-dot blotting 분석은 기존에 보고 된 방법으로 시행하였고⁸⁾ 요약하면, 총 점소는 단클론 항체 17Q2(1：2000；Covance Inc., Berkely, CA)로 MUC5AC 점소는 anti-human MUC5AC antibody(1：1000；NeoMarkers Inc., Fremont, CA)로 각각 검출하였다. 채취한 분비물들과 표준들을 일정한 비율로 희석하여 니트로 셀룰로즈막에 이동 후 일차 항체와 반응시킨 후 이차항체(horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse 혹은 anti-rabbit IgG)에 반응시켰으며 chemiluminescence(ECL kit, Amersham, Little Chalfont, UK)로 발색시켰다. 표준 곡선은 선형회귀분석을 이용하여 그린 후 각 검사물의 발색정도와 비교하여 정량화하였다. 분비물에 대한 세 번의 중복실험을 통한 실험결과는 평균±표준편차로 표시하였으며 Student t- test(SPSS ver. 11.5 Chicago, IL)로 통계처리 하였다(p<0.05).

결     과

사람 정상 코점막 상피세포에서 분화에 따른 PGE2 수용체의 mRNA 발현
   EP2와 EP4는 인간 호흡기의 주요 수용체이기 때문에 그에 대한 연구를 진행하였다. 일차호흡상피세포는 레티노익산의 존재 하에 점액섬모세포로 분화한다.⁹⁾ 따라서 저자들은 EP2와 EP4의 유전자 발현 정도가 사람의 일차 코점막 상피세포에서 분화에 따라 변화하는지를 알아보았다. EP2 유전자 발현은 점액섬모세포로의 분화에 따라 증가하였으나 EP4 유전자 발현은 변화가 없었다(Fig. 1). 이는 점액섬모세포로의 분화도는 EP4 mRNA의 발현이 아니라 EP2 mRNA의 발현에 영향을 줌을 알 수 있다. 저자들은 RT-PCR을 사용함에 있어 EP2 mRNA 포화가 늦게 나타날 수 있으므로 연속적인 모든 실험에서 합류 2일째에 세포를 이용하였다.

겔 형성 점소 유전자 발현에 대한 PGE₂의 효과와 PGE₂ 수용체 길항제의 효과
   흥미롭게도, PGE₂는 다른 겔 형성 점소 유전자의 발현이 아니라 오직 MUC5AC 유전자의 발현을 1.68배로 증가시켰다. 또한 EP2 수용체 길항제(AH6809)는 PGE₂에 의한 MUC5AC 유전자 발현을 억제시키지 못하였으나 EP4 수용체 길항제(AH23848)는 MUC5AC 유전자 발현을 의미 있게 억제시켰다(Fig. 2). 이는 사람 코점막 상피세포에서는 PGE₂가 EP4 수용체를 통해 MUC5AC 점소 유전자의 발현을 증가시킨다는 것을 알 수 있다.

총 점소와 MUC5AC 점소 분비에 대한 PGE₂와 PG 수용체 길항제의 효과
   PGE₂는 총 점소 분비를 증가시켰고 MUC5AC 점소 분비를 4배로 증가시켰으며 EP4 길항제는 총 점소와 MUC5AC 점소 분비를 모두 의미 있게 억제시켰다. 그러나 EP2 길항제는 총 점소와 MUC5AC 점소 분비를 억제시키지 못하였다(Fig. 3). 총 점소와 MUC5AC 점소 분비가 모두 PGE₂의 처치로 유사한 정도로 증가한다는 사실과 EP4 길항제의 전처치로 억제된다는 사실은 아마도 MUC5AC 점소가 호흡기의 주요 점소로써 그 역할을 한다는 것을 짐작할 수 있다. 흥미롭게도, PGE₂에 의해 MUC5AC 유전자의 발현은 1.68배의 증가를 보였고 그의 당단백치가 4배가 증가했다는 실험 결과는 PGE₂에 의해 유도되는 MUC5AC 점소 분비가 주로 전사 후 수준(post-transcriptional level)에서 조절됨을 보여 준다.

EP2와 EP4 수용체 유전자 발현에 대한 PGE₂의 효과
   다음으로 저자들은 일부 물질들이 그들의 수용체 수를 증가시킴으로 그 영향을 미치는 것에서 착안하여 PGE₂가 PGE₂ 수용체 유전자 발현에 대해서는 어떤 영향을 미치는지를 알아보았다. 그림에서 보는 바와 같이 PGE₂는 EP2와 EP4 수용체 유전자의 발현에는 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다(Fig. 4).

고     찰

   조직이 생리적이거나 병리적인 다양한 자극에 노출되었을 때 막의 인지질로부터 유리된 아라키돈산(arachidonic acid)은 cyclooxygenase에 의해 PGs과 thromboxanes을 포함하는 프로스타노이드(prostanoids)로 전환하게 된다. 그 중 PGE₂는 염증부위에 고농도로 존재하게 되며 점막 면역조절에 관여하여 그 역할을 수행해 왔다.¹⁰⁾ IL-1β나 TNF-α와 같은 염증 매개체에 의해 분비된 PGE₂는¹¹⁾ 점막상피세포에 autocrine 및 paracrine 효과를 나타내며 따라서 점막상피세포에서는 MUC5AC와 MUC8을 포함하는 점소 분비와 점소 유전자 발현이 증가하게 된다.^{5)12)13)14)15)}
   한편, PGE₂가 토끼 위점막 상피세포¹⁶⁾와 사람 장점막 상피세포¹⁷⁾에서 EP2혹은 EP4 수용체에 작용한다는 보고가 있었다. 그러나, 비록 PGE₂가 사람 장점막 상피세포에서는 EP4 수용체를 통해 MUC2 유전자의 발현을 유도하지만 사람 호흡기 점막 상피세포에서는 어떤 수용체를 통해 그 역할을 수행하는지 규명되지 않았다. 또한, 사람 일차 상피세포는 배양시 그 증식과 분화에 있어 기간 연장을 보였고 EP 수용체 유전자의 발현치는 분화도와 다르게 나타났다. 그러나, EP 수용체 유전자의 분화도에 따른 발현치에 대한 보고가 없었으며 이에 저자들은 본 연구에서 호흡기 상피세포는 레티노익산의 존재하에 점액섬모 상피세포로 분화하므로 EP2 수용체 유전자의 발현이 점액섬모 분화도에 따라 증가한다는 것을 알 수 있었고 또한 EP4 수용체 유전자 발현은 분화도에 따라 변화하지 않는다는 것을 알 수 있었다. 결국 이 결과는 점액섬모로 분화는 EP2 수용체 유전자의 발현을 유도하고 EP4 수용체 유전자 발현에는 별다른 영향을 주지 않는 것을 알 수 있었다.
   다음으로 저자들은 겔 형성 점소 유전자 발현에 대한 PGE₂의 영향을 조사하였는데 PGE₂는 MUC5B, MUC6, MUC7이 아니라 오직 MUC5AC 유전자 발현만을 증가시켰다. 또한, Gray 등⁴⁾도 오직 EP2와 EP4 수용체 촉진제인 미소프로스톨(misoprostol)을 사용함으로써 사람의 기관, 기관지 상피세포에서 EP2와 EP4 수용체가 PGE₂로 유도되는 MUC5AC 유전자 발현에 큰 역할을 담당함을 보고하였으나 각 수용체들의 기능에 대해서는 규명하지 못하였다. 이에 저자들은 PGE₂에 의한 MUC5AC 유전자 발현은 EP2 수용체 길항제가 아닌 EP4 수용체 길항제에 의해 억제됨을 알 수 있었으며 또한 MUC5AC 점소와 총 점소가 단백질 수준(protein level)에서 PGE₂에 의해 증가됨을 알 수 있었다. 그리고 PGE₂에 의한 점소 분비도 EP4 수용체 길항제에 의해 억제됨을 알 수 있었다. 이 결과는 PGE₂가 EP4 수용체를 통해 MUC5AC 유전자 발현과 점소 분비를 증가시킴을 의미함을 알 수 있다. 이는 Takahashi 등¹⁶⁾이 토끼 위점막 상피세포에서 PGE₂가 EP4 수용체를 통해 점소를 분비한다는 내용과 일치한다. 또한 Belly와 Chadee는 PGE₂가 EP4 수용체를 통해 쥐(rat)와 사람의 장점막 점소의 방출(exocytosis)을 자극한다는 보고도 있었다.¹⁷⁾ 흥미롭게도, PGE₂가 MUC5AC 유전자 발현은 1.68배 증가시키고 MUC5AC 점소 분비를 4배 정도 증가시킨다는 사실은 PGE₂가 MUC5AC 유전자 발현은 전사 수준(transcriptional level)에서 그리고 MUC5AC 점소 분비는 전사 후 수준(post-transcriptional level)에서 자극함을 알 수 있다.
   마지막으로, 저자들은 일부 물질들이 각각 그들의 수용체 수를 증가시킴으로 그 영향을 미치는 것에서 착안하여 PGE₂가 EP2와 EP4 수용체 유전자 발현에 어떤 영향을 미치는지를 조사하였다. EP2와 EP4 수용체 유전자 발현은 PGE₂에 의해 변화를 보이지 않았고 이는 MUC5AC 점소에 대해 PGE₂는 그 분비량과 활성화된 하위조절 신호 분자(activating downstream signaling molecules)에 의해 주로 매개된다는 사실을 알 수 있었다. 결국 사람 코점막 상피세포에서 PGE₂는 전사 수준(transcriptional level)에서 MUC5AC 유전자 발현을 유도하고 또한 EP4 수용체 유전자 발현에는 영향을 미치지 않으면서 EP4 수용체를 통해 그 역할을 수행함을 알 수 있었다.¹⁸⁾ 향후 EP4 수용체의 중요한 역할을 확인하기 위한 세포수준에서의 분자 연구가 필요하다.

결     론

   위의 결과로 미루어 보아, 사람의 정상 코 점막에서 PGE₂에 관한 수용체는 EP2와 EP4가 주로 분포하고 있으며, PGE₂에 의해 MUC5AC 유전자의 발현을 증가시켰고, 총 점소와 MUC5AC 점소도 증가됨을 알 수 있었다. 그리고 이런 작용이 EP4 수용체에 의해 활성화됨을 알 수 있었다. 

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