교신저자：김상철, 411-706 경기도 고양시 일산구 대화동 2240번지  인제대학교 의과대학 일산백병원 이비인후과
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서     론

   살리실산은 소염, 해열 및 진통에 효과를 보이는 약물로 오래전부터 널리 사용되어져 왔다. 하지만 살리실산의 이러한 다양한 이점 외에도 고농도의 살리실산은 여러 가지 부작용을 유발하기도 한다. 그 대표적인 증상으로 알려져 있는 것이 가역적인 청력의 소실이나 이명 등의 이독성(ototoxic) 증상들이다. 즉, 고농도 살리실산은 사람이나 동물에서 이명을 유도시키는 것으로 널리 알려져 있다.²⁾ 그러나 지금까지 광범위한 연구가 진행되어 왔지만 살리실산으로 유도되는 이명 현상의 기본적인 병태생리는 아직까지도 완전히 규명되지 않고 있다. 이전에 저자들은 실험적으로 살리실산에 의해 이명이 유발된 흰쥐에서 청각 중추신경계와 비청각 중추 신경계를 c-fos 면역조직화학염색 방법을 통해 대조군과 비교해 본 결과 비청각 중추 신경계인 LC(Locus coeruleus, 청반)에서의 c-fos 발현율이 증가된 것을 바탕으로 하여(Fig. 1),¹⁾ LC 신경핵이 이명의 발현에 주도적인 역할을 한다는 것을 밝혔다. 그러나 살리실산이 이명을 유도하는데 있어서 LC 신경핵에 직접적으로 작용하는지 혹은 간접적인 다른 영향이 있는지 여부는 불분명하다. 본 연구에서는 LC 신경핵을 대상으로 살리실산 농도에 따른 세포외 단일 전기신호 기록(extracellular single unit recording) 및 전세포 전류 고정 신호(whole-cell current-clamp recording)를 조사하여 살리실산의 처치가 세포막의 기본 전기 생리학적 특성과 자발 활동 전위율(spontaneous firing rate)에 어떠한 영향을 주는지에 관하여 조사하였다.

재료 및 방법

   실험동물은 평균체중 180~220 g 정도의 8주령 이상 Sprague-Dawley 계통의 수컷 흰쥐(rat)(대한 실험동물)를 사용하였고, ketamine(50 mg/Kg)(유한양행, Korea)과 Xylazine hydrochloride(럼푼^®, Bayer Korea Ltd., Korea)(5 mg/Kg)를 주사하여 마취시켰다. 마취된 동물에서 뇌를 재빠르게 두개골로부터 적출하였으며, 냉장 인공 뇌척수액(cold artificial CSF)(4℃, pH 7.4)(124 NaCl, 1.3 MgSO₄, 7 H₂O, 3 KCl, 1.25 NaH₂PO₄, 26 NaHCO₃, 2.4 CaCl₂, 10 glucose：단위, mM)에 잠시 보관하였다. 적출된 뇌는 냉각 후에 뇌간과 시상하부를 포함한 블록으로 정돈하였다. Vibroslicer(World Precision Instruments, Sarasota, FL)를 사용하여 전기 생리학적 기록을 위한 뇌 조직 절편(brain slices)을 LC 신경핵들이 포함되게 두께 450 μm정도로 절단하여 제작하였다. 이렇게 준비된 뇌 조직 절편을 modified Hass-type recording chamber(Haas et al, 1979)로 이동 시킨뒤 95% O₂와 5% CO₂로 환기시킨 따뜻한 인공 뇌척수액(warm artificial CSF)(35℃, pH 7.4)로 계속해서 관류시킨다.³⁾ 단일 신경핵(single neuron)인 LC 신경핵의 세포외 신호(extracellular signals)는 3M NaCl(pH 7.4)로 채워진 유리 미세전극(glass electrodes)(저항：4~5 MΩ)를 사용하여 기록하였다. 유리 미세 전극은 Micropipette Puller(Sutter Instrument, Novato, CA)를 이용하여 직접 제작하였다.⁴⁾⁵⁾ 대조군은 규칙적인 자발 활동 전위를 관찰할 수 있는 SCN (Supra-Chiasmic Neucleus) 신경핵을 사용하였다.⁶⁾ 표본 추출은 실험군인 LC 신경핵과 대조군인 SCN 신경핵의 어떤 특정 부위로 국한하지 않았다. Axoclamp-2B amplifier(Axon Instruments, Foster City, CA)에 각 세포들의 전기적 신호가 입력되고, 순차적으로 입력된 신호의 증폭(amplification)과 AC coupling(注：아날로그 신호체계에서 직류 전류를 배제하고 교류 전류만을 통과시키는 상태)을 위한 differential amplifier를 거치게 된다. 일련의 과정을 거쳐 가공된 전기적 신호는 Digitizer와 소프트웨어(Digidata 1320A, Axoscope 8.1：Axon Instruments, Foster City, CA)를 통해 아날로그 신호에서 디지털 신호로 변환된 후 개인용 컴퓨터로 보내진다. 기록된 신호자료(signal data)의 분석을 위해 각 단일 신호 활동(single unit activity)의 시간에 따른 분포도(rate histograms)를 이용하였으며 소프트웨어는 spike 2(CED, UK)를 사용하였다.
   LC 신경핵의 Whole-cell current-clamp recordings을 위해 whole cell patch technique을 사용하였다.⁷⁾⁸⁾ 전기적 신호는 Axoclamp-2B amplifier를 사용해 수집하였다. 신호 기록용 유리 미세전극(첨단 직경：2 μm, 저항：3MΩ)은 140 K-gluconate, 10 HEPES, 2M MgCl₂, 1 CaCl₂, 11 EGTA, 2 K₂ATP(단위：mM)로 구성된 용액(pH 7.2~7.3)으로 채워져 있다. LC에서의 약물에 대한 반응도를 결정하기 위해 다양한 농도의 살리실산으로 수차례의 동일한 실험을 반복하였다. 이러한 약물 농도의 결정은 과거 연구들에서 이미 시행되었던 흰쥐 뇌척수액에서의 약물 실험 결과로부터 얻어진 것이다.⁹⁾¹⁰⁾ 세포외 전기 신호의 기록(extracellular recording)뿐만 아니라 whole-cell current-clamp recording도 약물의 영향을 알아보기 위해 살리실산 투여 후 약 30~60분에 분석되었다. 살리실산의 투여는 따뜻한 인공 뇌척수액(warm artificial CSF)을 관류시키는 튜브를 통하여 실시하였으며, 이러한 약물의 영향이 가역적인지 혹은 비가역적인 것인지의 판단은 약물의 세척(wash-out)후 30분에 분석하였다. 실험군과 대조군의 비교분석을 위해 t-test가 사용 되었다. 모든 수치상의 결과는 Mean±SEM으로 나타내었다.

결     과

   살리실산이 생체 외 실험에서 LC에 어떠한 영향을 미치는지 증명하기 위해 세포외 단일 전기 신호 기록(extracellullar single unit recording)을 이용하여 LC 신경핵의 약물에 따른 반응도를 조사 하였다. 모든 LC 신경핵은 0.5~4 Hz의 전형적인 자발 활동 전위율(spontaneous firing rate)를 보여 주었으며, 약물반응에 대한 본 연구에는 규칙적인 양상의 자발 활동 전위세포(regular firing pattern cell)을 선택하여 사용하였다. 살리실산에 대한 LC 신경핵의 반응도 조사에 50개의 LC 신경핵과 비교 대조군으로 5개의 SCN(Supra-Chiasmic Neucleus) 신경핵이 사용되었다. 살리실산에 반응을 보이는 세포인 경우 대부분 약물 투여 약 10~30분 내외로 활동 전위율(firing rate)이 변화하였다. 서로 다른 용량의 살리실산을 사용하는 동안 LC 신경핵은 다양한 반응들을 보여 주었다. 20개의 LC 신경핵을 0.3 mM의 살리실산으로 처치한 후 반응을 살펴보았다. 이들중 15개의 LC 신경핵들은 0.3 mM의 살리실산 투여 후 기본 활동 전위(basal firing activity)의 증가를 보여 주었다. 0.3 mM의 살리실산에 반응을 보인 세포에서 평균 기본 활동 전위율(mean control basal firing rate)을 비교해 보면 1.5±0.3 와 2.4±0.3 Hz이었다(p<0.05). 즉, 약물 처치에 따라 유의하게 활동 전위율이 증가함을 발견할 수 있었다. 나머지 5개의 세포에서는 다른 유의한 변화가 관찰되지 않았다. 또한 0.3 mM의 살리실산은 LC 신경핵에서 활동 전위율의 증가를 유도하는데 고농도의 약물에서 보다 시간이 더 오래 걸렸다.
   1 mM과 2 mM 살리실산에서는 한개의 LC 신경핵을 제외 하고는 모두 활동 전위율을 증가시켰다(n=20). 1 mM과 2 mM 살리실산에 반응을 보이는 세포들에서 평균 기본 활동 전위율은 1 mM에서는 2.1±0.4와 4.8±0.6 Hz, 2 mM에서는 1.8±0.4와 4.2±0.3 Hz이었으며 모두 통계학적 유의성이 있었다. 이러한 약물의 영향은 대부분의 경우 약물의 세척(wash-out)후 본래의 자발 활동전위로 돌아가는 가역적인 회복 양상(reversible recovery manner)을 보여 주었다. 그러나 5 mM 살리실산 처치군에서는 모든 LC 신경핵에서 폭발적인 자발 활동전위의 증가(bursting firing response)를 유발시킨 후 세포사망(cell death)으로 이어져 회복되지 못하는 비가역적인 반응을 보였다(n=10)(Fig. 2). 자료는 보여주지 않았지만, 대조군인 SCN에서도 동일한 실험을 해본 결과, 약물농도에 따른 자발 활동 전위율(spontaneous firing rate)에는 변화가 없었다(n=5). 5 mM 살리실산에서도 1시간 이상의 처치하는 동안 SCN 신경핵에서는 자발 활동 전위율에 변화를 주지는 않았다.
   LC 신경핵에서 세포막의 전기적 특성을 규명하기 위해 whole-cell patch-clamp technique이 사용되었다. 2 mM 살리실산 처치 실험군과 살리실산을 처치하지 않은 대조군을 비교하여 전기 신호를 기록하였다. LC 신경핵에서는 두 가지의 전기 생리학적 특성을 가지는 세포 형태를 관찰할 수 있었다. 첫 번째는 자발 활동 전위 세포(spontaneous firing cell)(-46±0.7 mV, n=8)이며, 이들 세포는 안정막 전위(resting membrane potential)에서 활동 전위 spike를 보여 주었다. 나머지 세포들은 비-자발 활동 전위 세포(non-spontaneous firing cell)(-58±0.7 mV, n=7)였다. 하지만 LC 신경핵에서 모든 형태의 세포들은 살리실산 처치 동안에 세포막의 기본 전기적 특성뿐 아니라 전류 유도 유발전위(current induced spike) 그래프에서 나타나는 활동 전위 spike에서도 대조군과 비교하여 유의한 차이를 나타내지 않았다(Fig. 3).

고     찰

   Jastreboff는 살리실산이 이명을 유발하는 물질로 작용한다는 실험동물의 이명 모델을 동물 행동 연구(animal behavior model)를 통해 증명하였으며, 이 후 실험동물의 청각 중추 신경계인 하구(inf. colliculus)에서 전기 생리학적 차이를 발견하였으나¹¹⁾ 최근까지 이명의 발생 기전에 있어 주도적 역할을 수행하는 것이 청각 중추인지, 비 청각 중추인지에 관하여서는 이견이 있어왔다. 이전에 저자들이 발표한 연구에서 c-fos가 스트레스나 기억에 관련된 과정에서 조기 표식자(early marker) 역할을 하는 immediate early antigen으로서 신경 활동성(activation)을 반영하는 선별 검사로 사용된다는 점을 이용하여¹²⁾ 살리실산에 의해 이명이 유도된 실험동물의 뇌에서 c-fos의 발현율을 조사한 결과, 청각 중추가 아닌 비 청각 중추, 그 중에서도 LC 신경핵에서 대조군과 유의한 차이를 나타낸 것이 확인되었기 때문에(Fig. 1)¹⁾ 본 연구에서도 LC를 전기 생리학적 변화를 관찰하는 지표로 삼을 수 있었다. LC 신경핵은 스트레스나 불안 상태에서 활동성이 증가하고 심혈관계 등의 심부 장기에서 유입되는 자극에 반응하는 상행성 망상 중추 신경계(ascending reticular central nerve system)의 한 부분으로 알려져 있다. 전기 생리학적 특징으로 1~3 Hz의 전형적인 강직성(tonic)의 자발 전위를 가지며, 저명한 후과분극(afterhyperpolarization) 후에 뒤따르는 긴 활동전위(action potential)를 특징으로 한다. LC에서의 자발 전위는 분리된 뇌조직 절편에서도 나타나고 tetrodotoxin과 같은 물질로 신경접합부를 차단하여도 측정되는 것으로 미루어 내재적인 전류 조절 기준이 있을 것으로 보고 있다.¹³⁾ 또한 LC 신경원은 다수의 신경 전달 물질 체계에 의해 영향을 받고 있고 glutamate, substance P, vaso-active intestinal peptide, acetylcholine 등의 물질은 LC의 활동 전위율을 증가시키며, epinephrine, enkephalin, somatostatin, γ-amino-butyric acid(GABA) 등은 반대의 작용을 한다고 보고되고 있다.¹³⁾ LC는 해부학적으로 제 4 뇌실 기저부의 측면의 뇌교 부위에서 Perivenricular gray(PVG) 외측벽의 세포들이 길어져서 구성되어 있으며, 또한 와우핵(cochlear nucleus), 하구(inferior colliculus), 내측 슬상체(medial geniculate body), 청각 피질(auditory cortex) 및 대뇌 변연계(limbic system)인 편도핵(amygdala)과 같이 스트레스나 통증 상태에 영향을 받는 뇌 부위와 노르아드레날린 경로(noradrenergic bundle)를 통해 연결되어 노르아드레날린(noradrenalin)을 합성 분비하는 곳으로 알려져 있다.¹⁴⁾¹⁵⁾ 이전의 연구들은 LC가 흰쥐의 중추신경계에서 노르아드레날린을 방출하는 원발 부위(primary site)이며 청각 중추 신경계와 다양한 연결 경로를 통해 연관성이 있다는 것을 보여 주었다.¹⁶⁾¹⁷⁾ 이러한 결과는 살리실산으로 유도되는 이명 현상이 다양한 영역의 중추신경들 사이의 복잡한 상호 작용에 의해 조절되어 진다는 것을 암시한다 하겠다. 과거 연구들에서 살리실산으로 유도되는 독성증상에서 보여지는 이명을 포함한 다양한 증상들은 노르아드레날린성 교감 신경계(noradrenergic sympathetic system)에 의해 유발된다는 사실이 알려져 있으며, 뿐만 아니라 노르아드레날린 작용물질(noradrenalin agonist)을 사용한 실험동물 모델에서 살리실산에 의한 청력의 소실이나 이명 현상이 더 증가되는 것으로 밝혀졌다.¹⁸⁾ 또한 최근 연구에서는 노르아드레날린 알파-1 수용체 작용물질(noradrenalin alpha-1 receptor agonist)의 사용이나 LC 신경핵의 전기 자극에 의해 와우핵(Cochlear nucleus)의 활동성이 증강된다는 보고가 있었다.¹⁹⁾²⁰⁾
   본 연구에서는 살리실산이 직접적으로 LC에 작용하여 자발 활동 전위율을 증가시킨다는 것이 밝혀졌다. 그리고 이러한 약물의 영향이 약물 농도 의존성(dose dependent manner)을 가지고 있다는 사실도 알게 되었다. 이번 연구의 중요한 발견중 하나는 LC 신경핵의 자발 활동 전위율을 증가 시키는 살리실산의 약물 농도가 1~2 mM이라는 것이다. 이러한 사실은 흰쥐 이명 모델에서 살리실산(450 mg/kg, i.p)이 이명을 유도하며 이러한 약물이 2~3시간 후에 뇌척수액에서 1.5~2 mM의 농도에 도달한다는 사실과 일치한다.⁹⁾¹⁰⁾ 본 연구에서 저자들은 살리실산이 직접적으로 LC 신경핵에 약물 농도에 따라 영향을 끼친다는 점을 증명하였으며, 이러한 결과는 살리실산에 의해 유도된 이명이 LC의 교감 신경성 전달 과정과 연관성이 있다는 간접적인 증거가 된다고 할 수 있겠다. 그리고 반응도 조사에서 30분 이상 살리실산을 처치한 후에 반응이 나타나는 것과 whole-cell current-clamp recording에서 변화가 없는 것 등으로 미루어 짐작하건데 살리실산에 의한 신경핵 세포내의 변화는 수용체(Receptor) 단위의 직접적인 작용이 아니라 2차 전달물질(2nd messenger)을 통한 간접적인 변화에 기인한다고 사료되며, 이에 LC 신경핵 세포의 수용체 및 2차 전달물질에 관한 심도 깊은 분자생물학적인 연구가 뒷받침 되어야 한다고 생각된다.

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