교신저자：김경수, 135-720 서울 강남구 도곡동 146-92  연세대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   진행된 두경부암의 치료 원칙은 광범위한 근치수술과 방사선 치료 및 항암요법으로, 이러한 치료에도 불구하고 원격 전이나 이차 원발암의 발생빈도가 다른 암에 비해 높아 치료 성적이 좋지 않다.¹⁾²⁾ 이러한 원격전이나 이차 원발암 등을 극복하기 위해 여러 치료가 시도되고 있으며, 그 중 하나로 악성 형질전환을 일으킨 암세포에 대해 종양항원에 대한 면역계 반응을 이용하여 면역치료를 함으로써 암세포 성장을 억제하려는 연구가 폐암, 대장·직장암, 위암, 유방암, 두경부암 등에서 활발히 진행되고 있다.³⁾⁴⁾
   진행된 구강암 환자의 경우 말초 혈액내에서 종양항원에 의해 자극을 받은 CD4+ 보조 T 림프구가 MHC class Ⅱ 분자를 통해 항원을 인식하여 Th1 세포 반응은 억제되고 Th2 세포 반응이 활성화되는 현상이 일어나 그 결과로 Th2 사이토카인인 IL-4와 IL-10의 발현이 증가한다. 이렇게 증가된 IL-4에 의해 세포매개 면역이 약화되는 결과가 초래된다.⁵⁾ 한편 세포단위에서는 Th2 세포에서 생성된 IL-4가 염증세포 및 암세포의 표면에 있는 IL-4 수용체와 결합하여 생체반응을 조절하게 되는데, 구강암종 세포주의 경우 IL-4 수용체의 표현이 증가되어 있는 상태이므로, 증가된 IL-4와 그 수용체의 결합으로 IL-4 수용체가 활성화되어 암세포에서 다양한 생물학적 반응이 일어난다.^1)2)3)5) 
   기관·기관지 상피세포, 수지상 세포(dendritic cell), 혈액 단핵세포, 폐 선양암세포 및 대장·직장암세포 등에서 활성화된 IL-4 수용체를 통한 세포내 신호전달 과정 중에 IL-4에 의해 15-lipoxygenase-1(15-LO-1) 효소가 상향 조절되면서 발현이 증가하는 것으로 밝혀졌고, 이 15-LO-1 효소는 정상세포의 성숙, 분화 및 기도 염증 반응에 관여하는 것 외에 대장·직장암, 위암, 식도암, 유방암 등에 있어서 세포고사(apoptosis)를 유도한다.⁶⁾⁷⁾⁸⁾
   구강암종 세포에 대한 IL-4의 작용은 세포에 따라 다양하게 표현되는데 여러 표현 중 성장 억제 작용이 일어나는 경우 어떤 경로로 성장 억제가 일어나는 가에 대한 의문이 들었다. 또한 이 경로가 다른 세포처럼 IL-4에 의한 15-LO-1의 유도와 연관성이 있을 수 있다고 생각되었다. 이에 저자들은 본 연구를 통해 첫째, IL-4가 사람 구강암종 세포주 중 SCC 1483 세포주에서 세포고사를 유발하는 지 알아보고 둘째, 만일 세포고사가 일어난다면 IL-4에 의해 15-LO-1이 유도되는 가를 확인하고 셋째, IL-4에 의해 유도된 15-LO-1이 세포고사를 일으키는 지를 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

사용 재료와 구강암종 세포주 배양 
   IL-4는 R&D Systems(Minneapolis, MN, USA)에서, benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethyl ketone (z-VAD-fmk)은 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 사람 구강암 세포로서 후구삼각(retromolar trigone)에서 기원한 SCC 1483 편평세포암 세포주(Generous gift from Dr. Shah J, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, NY, USA)를 배양하여 이용하였는데, 세포는 10% fetal calf serum과 2 mM L-glutamine, penicillin(50 μg/ml), streptomycin(50 μg/ml)이 포함된 minimal essential medium 배지(Invitrogen CO., Carlsbad, CA, USA)에서 배양하였다. 

세포증식 분석 
   SCC 1483 세포를 well당 2,000개씩 분주하여 96 well plate에서 16시간 동안 배양한 다음 무혈장 상태에서 0, 1, 10, 100 ng/ml의 IL-4를 48시간 동안 투여한 후 세포증식 분석(Cell Titer 96 AQ_ueous One Solution Proliferation Assay Kit：Promega Co., Madison, WI, USA)을 시행하였다. 방법으로 kit에 포함된 tetrazolium 합성물 2 ml와 phenazine ethosulfate 100 μl를 섞은 후 well당 20 μl의 혼합용액을 첨가하였다. 이후 1시간 동안 37℃, 5% CO2의 환경에서 96 well plate를 배양한 후 spectrophotometer(490nm 파장)로 흡광도(optical density；O.D.)를 측정하였다. 

유세포 분석기를 이용한 Fluorescence-activated cell sorter 분석
   6 well plate의 각 well에 4×10⁵개의 SCC 1483 세포를 분주한 후 배양하여 세포가 50~60%정도 합류를 이루었을 때 IL-4를 48시간 동안 처치한 다음 부유세포 및 plate에 붙어있는 세포를 채취하였다. 이후 인산완충용액(phos-phate buffered saline)으로 세포를 세척한 다음 TACSTM Annexin V-FITC kit(Trevigen Inc., Gaithersgerg, MD, USA)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 propidium iodide(PI)으로 핵을 염색하고, fluorescein isothiocyanate(FITC)-Annexin V를 고사된 세포에 결합시켰다. 이후 Becton Dickinson FACSVantage SE(San Diego, CA, USA)를 이용하여 10,000개의 세포에 대해 유세포 분석기(flow cytometry)를 이용한 fluorescence-activated cell sorter(FACS)분석을 시행한 다음, 결과상 그래프의 우상방(Annexin V 양성과 PI 양성)과 우하방(Annexin V 양성과 PI 음성)의 세포수를 계측하였다. 이 수치를 전체 세포로 나누어 백분율을 구해서 세포고사 정도를 관찰하였다. 대조군으로 IL-4를 처치하지 않은 세포에 대하여 동일한 방법으로 48시간 동안 실험을 하여 세포고사를 측정하였다. 통계 검증은 one-way ANOVA를 이용하여 대조군과 비교하여 유의수준 p<0.05를 유의한 것으로 하였다. 

Western blot 분석
   배양된 세포를 radioimmunoprecipitation assay buffer (1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS)를 이용하여 cell lysate를 만든 다음, 단백질의 양을 bovine serum albumin을 이용한 bicinchronic acid protein assay로 측정한 후 단백질 30 μg씩을 각 lane에 넣어 전기영동하였다. 전기영동은 6%(poly ADP-ribose polymerase；PARP)와 8%(15-LO-1) SDS-polyacrylamide gel을 이용하였고 전기영동 후 nitrocellulose membrane에 전이시킨 다음 이 막을 0.05% Tween-20이 함유된 Tris-buffered saline(TBST)로 희석한 10% non-fat dry milk로 4℃에서 12시간 반응시킨 후 일차 항체인 PARP 항체(Cell Signaling Technology Inc., Beverly, MA, USA)(1：1000 농도)와 15-LO-1 항체(Cheyman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)(1：2000 농도)로 각각 4℃에서 밤새 반응시켰다. 이후 TBST로 세척한 다음 horseredish peroxidase가 접합된 이차항체로 1시간 동안 처치한 다음 세척하였다. 이후 enhanced chemiluminescence(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)와 autoradiography를 이용하여 밴드를 관찰하였다. 

Reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)
   Tri-Reagent(Molecular Research Center, Cincinnati, OH, USA)를 이용하여 각 조건으로 배양된 세포에서 total RNA를 얻었다. Total RNA에서 cDNA로의 역전사(reverse transcription)는 1 μg/20 μl의 total RNA를 random hexanucleotide primer와 Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase(Gibco-BRL, Carlsbad, CA, USA)를 이용하였고, polymerase chain reaction은 Perkin-Elmer Cetus DNA Thermal Cycler(Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA)를 이용하였다. 15-LO-1에 대한 oligonucleotide primer로 sense primer의 서열은 5'-GAGTTGACTTTGAGGTTTCGC-3'와 anti-sense primer의 서열은 5'-GCCCGTCTGTCTTATAGTGG-3'로, 예상되는 PCR 산물의 크기는 952 bp였다. 각 반응의 대조군으로 사용된 actin의 oligonucleotide primer는 Clontech Laboratory(Palo Alto, CA, USA)에서 구입하여 사용하였으며 예상되는 산물의 크기는 838 bp였다. 15-LO-1의 중합효소 연쇄 반응은 94℃에서 30초간 변성(denaturation) 과정과 58℃에서 90초간 결합(annealing) 반응, 72℃에서 90초간 연장(extension) 반응을 35회 진행하였고 증폭된 PCR 산물은 2% 한천 겔에서 전기 영동하여 ethidium bromide 용액으로 염색하여 밴드를 관찰하였고, 이를 sequencing하여 염기서열을 확인하였다. 확인된 밴드의 세기는 Scion Image(Scion Co., Frederick, MD, USA)를 이용하여 강도를 구한 후 해당하는 actin의 강도로 나눈 다음, 이 수치들 중 대조군에서의 수치를 1로 하여 각 실험의 수치를 비율로 나타내어 비교하였다. 통계 검증은 one-way ANOVA를 이용하여 대조군과 비교하여 유의수준 p<0.05를 유의한 것으로 하였다.

결     과

IL-4에 의한 SCC 1483 세포의 증식 억제 
   IL-4에 의해 SCC 1483 세포의 증식이 억제되는 가를 알아보기 위해 0, 1, 10, 100 ng/ml의 IL-4를 48시간 동안 첨가 배양한 다음 세포증식 분석을 시행하였다. Spectrophotometer로 측정한 O.D.는 대조군 1.42±0.18, 1 ng/ml의 경우 0.77±0.16, 10 ng/ml은 0.65±0.07, 100 ng/ml의 경우 0.38±0.11이었다(Fig. 1). 세포증식 억제율을 알기 위해 {1-(각 투여군의 평균 O.D./대조군의 평균 O.D.)} ×100의 공식으로 백분율을 구하였다. 1, 10, 100 ng/ml IL-4 투여시 각각의 세포증식 억제율은 45.9%, 54.4%, 73.2%로 IL-4 10 ng/ml의 농도에서부터 50% 이상의 증식 억제를 보여 이후 실험은 IL-4 10 ng/ml을 사용하였다(Table 1).

IL-4에 의한 세포고사 유도 및 세포고사와 15-LO-1의 연관성 
   IL-4를 10 ng/ml의 농도로 48시간 동안 투여한 SCC 1483 세포에 대해 FACS 분석으로 세포고사를 측정하였다. 결과로 IL-4를 투여하지 않은 대조군의 경우 고사된 세포의 백분율은 12.5±5.7%였고, 10 ng/ml의 IL-4를 투여한 경우 세포고사가 28.6±7.3%로 대조군에 비해 약 2.3배 증가된 소견을 보였으며 통계학적으로 유의한 차이를 보였다(p<0.05). 세포고사 과정에 15-LO-1이 관여할 가능성을 알기 위해 15-LO-1 억제제인 2.2 μM의 카페인산(caffeic acid)를 1시간 전에 전처치한 후 10 ng/ml IL-4를 투여하여 세포고사를 측정하였다. 이 경우 세포고사가 15.2±4.4%로 나와 대조군과 유의한 차이를 보이지 않았다(Fig. 2A and B). 
   IL-4에 의한 SCC 1483 세포의 세포고사를 확인하기 위한 다른 방법으로 PARP의 분할 여부를 보고자 Western blot 분석을 시행한 결과, 대조군에서는 116 kDa 크기의 PARP 밴드가 주로 나타났으나, IL-4를 투여한 경우에는 116 kDa과 89 kDa 두 개의 밴드가 확연히 관찰되어 PARP의 분할이 일어남을 알 수 있었으며 세포고사가 일어났다는 것을 확인하였다. 카페인산을 전처치한 경우에는 IL-4에 의해 분할된 89 kDa의 밴드의 세기가 약해진 모습으로 대조군과 유사한 양상으로 관찰되어 15-LO-1 억제에 의해 세포고사가 억제됨을 확인하였다(Fig. 2C). 

IL-4에 의한 15-LO-1의 유도 및 세포고사
   IL-4에 의한 15-LO-1의 유도 여부를 알아보기 위해 10 ng/ml의 농도로 IL-4를 48시간 동안 첨가하여 배양한 다음 15-LO-1에 대해 Western blot을 시행하였다. 결과상 IL-4를 첨가 배양한 경우 15-LO-1 단백이 대조군에 비해 약 2.9배 증가하였으며 통계적으로 유의한 차이를 보였다(p<0.05). 한편 카페인산으로 전처치한 경우 대조군에 비해 약 1.3배의 15-LO-1 단백이 발현되어 대조군과 유의한 차이를 보이지 않았다(Fig. 3A). 
   IL-4를 첨가 배양시 배양시간에 따른 15-LO-1 mRNA의 발현을 보기위해 RT-PCR을 시행하였다. 15-LO-1 mRNA 유도는 10 ng/ml의 IL-4를 첨가 배양한 지 8시간 이후부터 대조군에 비해 약 2.4배 증가하였다(Fig. 3B). 한편, 배양시간에 따른 세포고사는 대조군인 0시간에 10.7±5.7%, 6시간 경과시 11.9±2.1%, 12시간 경과시 12.4±4.7%, 24시간의 경우 20.5±4.3, 48시간 경과시 28.4±5.6%의 결과를 보여, 24시간 동안 IL-4를 첨가 배양한 경우부터 대조군과 비교시 세포고사가 의미있게 증가하였으며(p<0.05), 세포고사는 배양 시간에 따라 증가하였다(Fig. 4).

IL-4과 Caspase cascade와의 연관성 
   IL-4에 의해 PARP 분할이 일어나므로 caspase 효소 억제제인 10 μM z-VAD-fmk를 전처치하여 IL-4에 의한 세포고사에 caspase cascade가 관여하는 가를 알아보고자 하였다. SCC 1483 세포에 대해 10 ng/ml의 IL-4를 48시간 동안 투여한 후 유세포 분석기를 이용한 FACS 분석을 통해 세포고사를 측정한 결과 대조군의 경우 세포고사가 8.7±4.3%에서 발생하였고, IL-4만을 투여한 경우 25.2±7.3%, z-VAD-fmk를 1시간 전에 전처치한 후 IL-4를 투여한 경우는 23.3±6.5%의 세포고사가 각각 관찰되었다(p<0.05). 이러한 결과로 caspase 효소 억제제를 투여하더라도 IL-4에 의한 세포고사가 억제되지 않으므로 caspase cascade는 IL-4에 의한 세포고사 과정에는 관련성이 없음을 알 수 있었다(Fig. 5A and B). 

IL-4에 의한 다른 매개체 유도 가능성 
   IL-4에 의한 15-LO-1 유도 이외에 COX-2와 NAG-1 등이 유도되는 가를 보고자 하였다. Western blot 분석 결과 상 COX-2와 NAG-1 모두 IL-4에 의해 유도되지 않았으며, 카페인산을 전처치한 경우에도 변화를 보이지 않아 COX-2와 NAG-1은 IL-4에 의해 유도되지 않음을 알 수 있었다(Fig. 5C). 

고     찰

   IL-4는 약 20 kDa의 분자량을 가진 당단백으로 활성화된 CD4⁺ Th2 세포 외에 비만세포, NK/T세포, 호염구 등에서 분비되어 면역반응으로 인한 염증의 활성화를 억제할 뿐만 아니라 여러 암종에서 종양세포의 성장을 직접적으로 억제하는 면역학적 특성을 보인다.¹⁰⁾¹¹⁾ 한편, 구강암종 세포주에 대한 IL-4의 작용은 성장에 영향을 미치지 않는 경우, 성장을 억제하는 경우, 성장을 촉진하는 경우 등 다양한 양상을 보이게 되는데 이러한 현상은 세포 특이성에 따라 IL-4가 기능을 하는 것으로 생각되고 있다.¹²⁾
   본 연구에서 후구삼각에서 기원한 구강암종 세포주인 SCC 1483 세포주에 대해 IL-4 10 ng/ml의 용량에서부터 50% 이상의 세포증식 억제를 보였고 용량에 따라 증식 억제가 증가하였다. 이러한 성장 억제는 FACS 분석 및 PARP의 분할 등의 결과로 세포고사에 의한 것으로 밝혀졌다. 이 결과는 사람 대장·직장암종 세포주인 HT 29 및 유방암종 세포주인 MCF-7에서의 성장 억제 작용과 일치하였다.¹⁰⁾ 한편 본 연구결과는 진행된 구강암 환자의 말초혈구에서 IL-4 mRNA가 증가되어 있으며 이 결과로 세포매개 면역의 생성이 억제되어 암종이 더욱 진행될 수 있다는 보고와 상충되는 결과이다.⁵⁾ 이처럼 IL-4의 증가가 전신적으로는 세포매개 면역의 악화로 암종의 진행을 촉진한다는 결과가 있는 반면 다른 연구에서는 진행된 여러 암종에 IL-4를 피하주사할 경우 암종의 진행을 억제하는데 도움을 준다는 보고도 있다.⁴⁾ 이런 결과가 가능한 이유로 IL-4의 작용이 세포단위에서는 세포특이적으로 작용하며 전신적으로도 전신상태나 면역력 등에 따라 작용하는 개체특이성을 의미한다고 생각하며 과연 IL-4 증가가 구강암의 경우 전신적으로 암의 촉진을 유발하는지 혹은 억제를 유발하는지 어느 측면이 더욱 우세한가에 대해서는 추가 연구가 필요하리라 본다. 
   본 연구결과에서 IL-4에 의해 SCC 1483 세포에서 세포고사가 발생한다면 과연 그 기전에 15-LO-1이 관여할 것인가에 대한 의문이 들었다. 이를 알아보기 위해 우선 15-LO-1 억제제인 카페인산을 처치하여 세포고사의 억제가 일어나는 가를 보았고 또한 직접적인 15-LO-1 유도 여부를 알기 위해 Western blot 분석과 RT-PCR을 통해 15-LO-1 단백과 mRNA 유도를 알아보았다. 결과 상 카페인산을 전처치한 경우 FACS와 PARP의 분할 여부로 알아본 세포고사가 대조군 범위로 억제되어 카페인산에 의해 IL-4의 세포고사 작용이 소실됨을 확인하여 15-LO-1이 세포고사에 작용할 가능성을 알 수 있었다. Western blot 분석 상 10 ng/ml의 IL-4를 48시간 동안 처치한 경우 15-LO-1 단백이 증가하였고 이러한 증가는 카페인산을 전처치할 때 소실되므로 IL-4에 의해 15-LO-1이 유도됨을 확인하였다. IL-4에 의한 15-LO-1의 유도는 기관·기관지 상피세포를 비롯하여 단핵세포, 폐포 대식세포, 폐 상피세포암 및 대장·직장암 세포 등에서 일어나며 본 연구결과도 이와 일치하는 결과였다.⁶⁾⁷⁾
   다음 단계로 15-LO-1의 세포고사 유도를 확인하기 위하여 IL-4에 의한 15-LO-1 mRNA 유도와 세포고사 유도를 시간별로 조사하였다. IL-4 투여 후 8시간 경과 후부터 15-LO-1 mRNA의 발현이 의미있게 증가하였다. 한편, 세포고사는 IL-4 투여 후 24시간째부터 의미있게 증가하는 결과를 보여 15-LO-1 mRNA의 발현에 의해 세포고사가 일어남을 알 수 있었다. 이 결과와 카페인산 전처치에 의해 세포고사가 억제되는 결과 등으로 미루어 IL-4에 의해 유도된 15-LO-1이 세포고사를 매개한다고 생각하였다. 이처럼 15-LO-1에 의한 세포고사의 매개는 15-LO-1에 의해 리놀산(linoleic acid)이 기질로 작용하여 세포질내에서 13(S)-HODE(hydroxyoctadecadienoic acid)를 합성하여 핵 내 전사요소인 PPAR-δ(peroxisome proliferator-activated receptors)와 결합하여 PPAR-δ의 하향조절(down-regulation)을 유도함으로써 세포고사를 유도한다는 것이다.^14)15)16) 이와 대조적으로 전립선암종 세포주인 PC-3 세포주의 경우 13(S)-HODE를 외부에서 추가 공급해주면 15-LO-1에 의해 핵 내 PPAR-Υ의 하향 조절(down regulation)이 유발되어 암세포의 증식 및 종양원성이 증가되며 세포고사가 억제되었다.¹⁷⁾ 이처럼 15-LO-1에 의한 세포고사 유도가 상반된 결과가 나오게 되는 것은 IL-4의 작용과 마찬가지로 세포특이적으로 작용한 결과로 생각된다.
   세포고사와 관련지어 caspase cascade의 연관성과 여러 암종에서 세포고사와 연관된 것으로 알려진 COX-2, 비스테로이드성 소염제에 의한 세포고사와 연관된 것으로 알려진 NAG-1 등이 IL-4에 의해 유도되는 가를 알아보았다.^18)19)20) Caspase cascade 억제제인 z-VAD-fmk를 전처치한 경우에 세포고사가 유의하게 증가한 결과를 보여 caspase cascade가 IL-4에 의한 세포고사에는 관련이 없음을 알 수 있었다. 그리고 COX-2와 NAG-1은 IL-4에 의해 유도되지 않으며 카페인산을 전처치하여 15-LO-1을 억제한 경우에도 유도되지 않는 결과를 보여 이들은 IL-4나 15-LO-1과 관련되지 않음을 알 수 있었다. 

결     론

   본 연구 결과로 구강암종 세포주인 SCC 1483 세포주에서 10 ng/ml의 IL-4에 의해 세포고사가 일어나며, 이러한 세포고사 과정에는 IL-4에 의해 유도된 15-LO-1이 매개한다는 것을 알 수 있었다. 향후 임상적 이용을 위한 IL-4의 적절한 투여 경로와 용량에 대한 추가 연구 등이 필요할 것으로 본다. 

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