교신저자：정필상, 330-715 충남 천안시 안서동 산 16-5  단국대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실, 의학레이저연구센터
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서     론

   광역학치료는 새로운 암치료 방법으로서 최근들어 우수한 치료효과가 점차 인정되고 있다. 광역학치료에서는 최적의 치료효능과 최소의 부작용을 갖는 저렴한 광감작제의 개발이 중요한데, hematophorphyrin 유도체(HPD)를 근간으로 하는 photofrin이 광감작제로서 임상사용 허가가 나와 실제 임상에 쓰이고 있고 그 적용범위를 점차 확대하여 완전관해, 부분관해의 효과를 보고하고 있다.¹⁾ 최근에는 다양한 차세대 광감작제가 개발되어 이들의 물리화학적 특성과 작용기전에 대한 많은 연구들이 이루어지고 있다. 국내에는 현재 photofrin 등이 사용되고 있으나 약가가 매우 비싸고 수입이 어려워 임상에서 활발하게 사용되기 어려운 상황이어서 이를 대체할 수 있는 광감작제의 국산화가 시급한 실정이다.
   광역학치료의 기본원리는 먼저 체내의 풍부한 산소와 외부에서 공급되는 빛과 빛에 활성화되는 물질(광감작제)의 종합적인 광물리현상으로 이해되고 있는데 활성산소(singlet oxygen) 또는 자유 라디칼(free radical)이 생성되고 이런 물질의 생화학적, 생물리학적 반응기전에 의해 직, 간접적으로 종양세포의 파괴를 일으킨다.²⁾ HPD과 photofrin 등의 광감작제는 주로 종양의 혈관손상을 야기하여 혈행을 정지시킴으로써 간접적으로 세포괴사를 일으키고³⁾ 이외의 다른 감작제는 혈관손상보다는 활성산소와 자유라디칼에 의해 직접적인 세포손상을 일으킨다는 보고가 있으나 같은 광감작제의 치료기전은 세포주의 종류와 in vivo, in vitro 등의 치료환경에 따라서도 달라질 수 있는 가능성이 제시되었다.⁴⁾ 광역학치료 후에 DNA의 퇴화, DNA의 양적감소, 세포내 칼슘이온 농도의 변화 등이 보고되고⁵⁾ 칼슘의존형 핵분해효소의 활성증가 등의 결과가 보고되면서 세포고사를 광역학치료의 또 다른 기전으로 생각하게 되었다.⁶⁾ Agarwal 등은 림프종에서 phthalocyanine을 사용한 광역학치료시 세포고사가 일어남을 증명하였고 다양한 세포암주에서도 세포고사가 광역학치료의 주요기전으로 보고되고 있다.⁷⁾
   저자는 인체 편평세포암주에서 클로로필(chlorophyll)로부터 추출하여 만든 새로운 광감작제 9-hydroxypheophorbide-α(9-HpbD-α)와 다이오드 레이저를 이용한 광역학치료의 항암효과를 이전의 연구에서 보고하였다.⁸⁾ 본 연구에서는 생체에 이종이식된 편평세포암종에서 9-HpbD-α를 이용한 광역학치료의 항암효과를 확인하고 이의 치료기전에 대해서 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

광감작제 및 레이저
   광감작제는 금호 생명과학연구소에서 녹조류에 흔한 클로로필을 산으로 처리하여 피오파이틴 α(pheophytin α)를 만든 후 화학구조변형을 하여 개발한 9-hydroxypheophorbide-α(9-HpbD-α)를 사용하였다. 9-HpbD-α는 클로로필의 금속이온을 제거한 피오파이틴 α에서 9번 탄소의 카르보닐(carbonyl)기를 환원하여 하이드록시(hydroxy)기로 전환시키고 에스터(ester) 기를 가수분해하여 제조하였으며 기존의 다른 클로로필 추출물보다 친수성이 증가되고 광역학치료의 성능이 증가된 새로운 광감작제이다. 레이저는 630 nm 다이오드 레이저(Ceramoptec, Germany)를 사용하였다.

세포배양
   인체 하인두암 환자로부터 수립된 SNU-1041 편평세포암종의 세포주⁹⁾를 배양기(Nunc, USA)에서 RPMI-1041(Gibco BRL, USA) 배양액 500 ml에 우태혈청(Gibco, BRL) 50 ml와 antibiotic-antimycotic(Gibco, BRL) 5 ml를 섞은 세포배양액으로 5％ CO2 배양기내에서 배양하였다.

실험동물 및 사육조건
   6주령의 BALB/C/nu/nu 숫컷 nude mouse를 멸균소독된 물과 방사능으로 조사한 멸균된 사료로서 급수 급식하면서 filter-top cage내에 사육하였다.

세포주의 이종이식
   배양기에서 배양된 세포주를 트립신으로 처리하여 세포액을 시험관에 넣고 현미경하에서 세포의 수를 세고 원심분리하여 세포액의 농도를 1×10⁸/ml로 만들었다. SNU-1041 세포주를 1×10⁷/0.1 ml로 만들어 30 G 인슐린 주사기로 nude mouse에 0.1 ml씩 등에 피하로 주입하고 종양의 형성유무를 관찰하고 1주 간격으로 종양의 부피를 측정하였다.

이종이식된 인체 하인두 편평세포암종에서 9-HpbD-α와 다이오드 레이저를 이용한 광역학치료

종양의 광역학치료
   Nude mouse에 이종이식된 종양의 크기가 약 400 mm³에 도달하였을 때, 제 1 군(n=5)은 정상 대조군으로 하였고, 제 2 군(n=10)은 9-HpbD-α으로만 치료한 군으로서 30 gauge 인슐린 주사기를 먼저 종양 중심부에 넣고 주위조직으로 여러 번 삽입을 반복시켜 광감작제가 고루 퍼질 수 있는 경로를 확보한 후에 9-HpbD-α를 0.007 μg/mm³씩 일정한 압력으로 서서히 종양 내에 주입하였다(fanning technique). 제 3 군(n=10)은 레이저 치료만을 시행한 군으로서 다이오드 레이저의 diffuser tip을 삽입 후 종양 중심부와 기저부에 각각 평균 1.6 J/mm³(400 mW)의 에너지를 15분씩 6시간 간격으로 2회 조사하였다. 제 4 군(n=10)은 제 2 군에서 시행한 방법으로 9-HpbD-α의 종양내 투여와 제 3 군에서 시행한 동일한 방법으로 1.6 J/mm³(400 mW)의 에너지를 종양 중심부와 기저부에 각각 15분씩 6시간 간격으로 총 2회에 걸쳐 레이저 조사를 시행한 광역학 치료군이었다. 레이저 조사 시에는 온도센서를 이용하여 종양내의 온도변화를 기록하였다.

종양부피의 측정
   각 군에서 치료 후 1주, 2주, 3주, 4주의 시점에서 종양의 부피(평균±표준편차)를 측정하여 항암효과를 판정하였다. 부피의 계산은 다음의 공식을 이용하였다.
   V=(4/3×A×B×C)×1/2(V=부피, A=장축, B=단축, C=높이)

항암효과의 판정
   항암효과는 각 군에서 종양부위의 완전소실 및 변연부에서 재발이 없는 것을 기준으로 한 완전 치료율과 이식된 암종의 부피의 변화를 4주까지 측정한 종양부피의 변화를 비교하여 판정하였다.

이종이식된 인체 하인두 편평세포암종에서 9-HpbD-α와 다이오드 레이저를 이용한 광역학치료 후 조직병리학적 관찰
   광역학 치료를 시행한 제 4 군에서는 항암효과를 확인한 다음 조직병리학적 관찰을 위하여 다른 nude mouse를 대상으로 같은 방법으로 광역학 치료를 시행하였다. 치료 후 2, 4, 6, 24시간 후에 종양조직을 적출하여 H&E 염색과 In Situ Cell Death Detection Kit(Roche, Germany)을 이용한 TUNEL 염색을 시행하여 조직병리학적 변화를 관찰하였고 광역학 치료후의 세포내 소기관과 핵의 미세구조의 변화를 알아보기 위하여 투과전자현미경을 이용하여 관찰하였다.

통계처리
   SAS 통계프로그램을 이용하여 이종이식한 종양에서 항암효과의 차이는 repeated measure ANOVA test와 student t-test로 5% 유의수준에서 검증하였다.

결     과

이종이식된 인체 하인두 편평세포암종에서 9-HpbD-α와 다이오드 레이저를 이용한 광역학치료의 항암효과
   1군에서는 처음 종양의 부피가 420±81 mm³이었고, 4주 후의 종양의 부피는 1248±361 mm³로 지속적으로 증가하였고, 9-HpbD-α로만 치료한 2군에서는 4주 후의 종양의 부피가 1493±462 mm³로 1군과 비슷한 지속적인 종양부피의 증가가 있었다. 종양 내에 diffuser tip만을 삽입하여 레이저 치료만을 시행한 3군에서는 치료 후 2주까지는 1, 2군에 비하여 현저한 종양부피의 감소를 보였으나 3주 경부터 다시 재발하여 4주에는 588±373 mm3이었다(Fig. 1). 광역학치료를 시행한 4군에서는 3주 경까지 7마리에서 종양의 완전한 소실과 변연부에서 재발이 없는 상태를 보였고 부분반응을 보이던 3마리에서는 다시 종양이 커졌으며 치료 중 특별한 독성반응은 보이지 않았다(Figs. 2 and 3). 3군과 4군에서 레이저 치료 중에 온도센서를 이용하여 측정한 종양내의 온도는 평균 42℃이었다.

이종이식된 종양에서 광역학치료 후 조직병리학적 관찰
   광역학치료를 시행 후 채취한 종양조직에서 광범위한 괴사소견이 관찰되었고 괴사범위는 치료 후 시간경과에 따라 확대되는 양상이었다(Fig. 4). TUNEL 염색에서는 핵이 갈색으로 염색된 세포들이 다수 발견되었으나 치료 후 시간경과에 따른 발현도와 H&E 염색과의 비교할 때 양성반응을 보인 세포들을 모두 전형적인 고사세포들로 판정하기는 힘들었다(Fig. 5).

이종이식된 종양에서 광역학치료 후 투과전자현미경(TEM) 소견
   세포고사 과정중의 세포는 세포내 소기관은 자신의 원형 구조를 대체적으로 유지하면서 염색사 응축(chromatin condensation)이 핵 주변부에 보였고 괴사세포는 세포막이 파괴된 것이 관찰되었다(Fig. 6).

고     찰

   클로린 구조를 가지며 자연계에서 흔한 엽록소류를 기본으로 하는 유도체가 최근 차세대 광감작제로 주목을 받고 있다. 특히 클로로필에서 금속이온을 제거한 피오파이틴 α와 이의 파이틸(phytyl)기를 가수분해 시킨 피오바이드 α는 흡수파장이 길고 기존의 photofrin의 단점을 보완 할 수 있으며 체내에서 배설되는데 시간이 오래 걸리는 단점을 줄여 체내 누적을 방지할 수 있는 장점이 있다. 그러나 피오파이드 α는 상온에서 서서히 분해가 일어나 안정성이 떨어지는 단점이 있는데 이를 보완한 9-HpbD-α가 국내에서 자체 개발되었고 본 연구에서는 이전의 in vitro 연구를 바탕으로 in vivo에서 9-HpbD-α를 이용한 광역학치료의 항암효과를 확인하고 그 치료기전을 규명하여 광감작제의 국산화에 기여하고자 하였다.
   광역학치료에 의한 세포내 작용기전의 시작은 광물리현상으로 이해되고 있는데 바닥 상태(ground state, S0)의 광감작제를 특정파장의 빛으로 활성화시켜 단일항 상태(singlet state, S1)나 삼중항 상태(triplet state, T1)로 되고 여기서 바닥상태로 될 때 방출되는 에너지가 산소와 반응하여 활성 산소(1O2)를 생성시키거나(Type II 반응) 감작제가 전자전달계에 관여하는 경우 자유라디칼이 형성되어(Type I 반응) 세포파괴가 일어난다.¹⁰⁾ Type I 반응은 주로 극성(polar) 배지에서 일어나고, Type II 반응은 친지질성의 산소 분압이 높은 환경에서 주로 발생한다고 하여 광역학치료에서는 주로 Type II 반응이 주도적인 역할을 하는 것으로 알려졌다.¹¹⁾ 그러나 Ochsner는 국소적 저산소증이 유발된 상황에서는 Type II 반응에서 Type I 반응으로 작용기전이 변할 수 있음을 보고하였다.¹²⁾ 저자의 In vivo 실험에서 산소농도가 주변부보다 상대적으로 떨어지는 종양 중심부의 치료기전을 Ochsner의 이론으로 이해할 수 있었다. 광역학치료의 치료효과는 활성산소나 자유라디칼에 의한 직접적인 세포독성과 혈관손상에 의한 간접적인 기전에 의한다고 알려져 있고³⁾ 최근에는 세포고사에 의한 기전이 제시되고 있다.⁷⁾ 이전의 종양세포암주를 대상으로 한 in vitro 실험에서 나타난 세포독성효과는 기능적 혈관분포가 없는 세포배양 상태에서 시행되어 직접적인 세포파괴에 의한 결과를 주로 반영한 것으로 생각된다. 종양세포를 실험동물에 이종이식하고 광역학치료를 시행 후 종양의 치료효과를 관찰한 본 연구에서는 치료 후 7일 경에 종양전체에 괴사가 형성되었고, 2주 후에는 괴사조직이 떨어지면서 종양이 소실되는 것을 관찰할 수 있었다. 저자는 이러한 치료효과가 in vitro 실험에서 보인 직접적인 세포독성효과에 의한 것으로 생각되어 광역학치료를 시행한 종양조직을 절제하여 조직병리학적으로 검색한 결과 염증을 동반한 광범위한 괴사현상을 관찰할 수 있었고 이러한 현상은 in vitro 실험과 같은 직접적인 세포독성에 의한 괴사현상으로 판단된다. 광역학치료 후 나타나는 세포반응은 세포고사나 세포괴사 과정을 통한 세포파괴 과정을 밟거나 스트레스 호르몬의 변화에 의한 세포회복과정으로 나뉘는데 최근 세포내의 정보전달과정에 대한 연구가 활발히 진행중이다.¹³⁾ 광역학치료 후 일어나는 괴사의 진행과정은 직접적인 세포막 손상에 의하여 세포내 ATP 저장이 고갈되면서 세포 복제나 복구과정이 장애를 입거나 세포 내로 아미노산 이동이 저하되고 세포내 pH의 감소가 일어난다.¹⁴⁾

   또한 리소좀(lysosome) 막이 손상되면서 여러 단백질 분해효소들이 해리되고 이로 인한 종양세포의 파괴와 괴사반응이 진행하는 것으로 알려져 있다.¹⁵⁾ 이밖에 세포막의 손상은 아라키돈산 대사과정의 장애와 혈관손상이 가능하고 동반된 보체계(complement system)의 자극, 히스타민과 다른 염증매개물질의 배출은 괴사과정을 가속화한다.¹⁶⁾ 직접적인 세포손상은 세포막의 이온 전달을 매개하는 여러 단백질에도 손상을 입혀 전해질 균형에도 장애를 유발하는데 세포내 칼슘이 증가하면 내인성 핵분해효소(endonuclease)의 활성화로 DNA가 분해되는 칼슘의존형 세포고사를 유발한다.⁶⁾ 이러한 세포고사는 광역학치료 후 모든 경우에서 발견되는 것은 아니고 사용한 광감작제의 종류와 대상 세포주에 따라서 차이를 보인다.¹⁷⁾ 본 연구에서도 세포고사의 발생 유무를 파악하기 위하여 광역학치료를 시행 후 채취한 종양조직에서 TUNEL 염색을 시행하였으며 전형적인 갈색으로 핵이 염색되는 세포들이 정상세포들 중에 다수 관찰되었다. 그러나 갈색으로 핵이 염색된 세포들을 모두 고사세포로 생각하기에는 H&E 염색 결과와 비교할 때 판정이 쉽지 않았고 다른 논문결과¹⁸⁾와 비교할 때 치료 후 시간 경과에 따른 핵염색의 발현정도 차이가 미약하여, 9-HpbD-α를 이용한 광역학치료의 주된 치료기전은 직접적인 세포손상에 의한 괴사과정에 의한 것이고 세포고사는 가능성 있는 부수적인 치료기전으로 생각된다.
   본 연구에서는 이종이식된 종양의 광역학치료 시 치료효과를 높이고 종양내 광감작제 치료농도를 유지하기 위하여 광감작제를 직접 종양 내에 주입하였고, 종양중심부의 응고 및 탄화를 막아 레이저의 종양내 투과성을 향상시키기 위하여 diffuser tip을 종양 내에 직접 삽입하여 치료하는 간질성 레이저치료(interstitial laser therapy)를 시행하였다. Glassberg 등은 온열요법이 광역학치료와 상승효과가 있음을 보고하였고¹⁹⁾ 본 연구에서도 레이저 조사시간을 15분 정도로 제한하여 종양내 치료온도를 평균 42℃로 유지하여 레이저 단독효과에 의한 단백질의 파괴를 막고 광역학치료와 온열요법에 의한 상승효과를 도모하였다. 레이저에 의한 종양내 치료는 상당부분 정상조직을 같이 치료하지 않으면 종양의 변연부(marginal area)에서 재발한다.²⁰⁾ 본 연구에서도 치료 후 재발부위는 주로 종양의 변연부였으며 광감작제를 주입 시 종양내의 압력에 의하여 감작제의 역류가 있었던 경우였다.
   향후 9-HpbD-α가 효과적인 광감작제로 사용되기 위해서는 치료효과를 높이기 위한 체내외의 다른 조절물질과의 상호작용에 대한 이해가 필요하고, 정상조직보다 종양조직으로 많이 보내 광감작효과를 높이는 Targetting 방법의 개선과 조직내 광감작제의 농도를 정확히 측정하는 Dosimetry 방법에서 많은 발전이 이루어져야 할 것이다. 이러한 연구를 토대로 더 나은 광역학치료의 치료기전에 대한 이해와 효과적인 임상적 이용이 가능할 것으로 기대된다.

결     론

   본 연구결과 이종이식된 인체 편평세포암종에서 9-HpbD-α와 630 nm 다이오드 레이저를 이용한 광역학치료는 유의한 항암효과를 나타냈고 치료기전은 주로 직접적인 세포독성효과에 의한 조직 괴사에 의한 것으로 생각된다. 그 효과로 볼 때 9-HpbD-α를 이용한 광역학치료는 새로운 치료방법으로서 향후 두경부 영역에서 암 치료의 유용한 치료방법으로 기대되며, 본 연구에서 일부 관찰된 세포고사는 향후 추가적인 세포고사의 실질적인 연구방법을 토대로, 가능성 있는 또 다른 치료기전으로서 이해가 필요할 것으로 생각된다.

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