교신저자：오승하, 110-744 서울 종로구 연건동 28번지  서울대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   칼슘이온(Ca²⁺)은 신경세포(neuron)에서 중요한 신호역할을 하고, 수많은 세포기전을 조절하여 세포의 증식, 학습과 기억, 근육의 수축, 신경조절물질의 방출, 그리고 다양한 효소 작용 등의 항상성을 유지시키고 있다.¹⁾ 그러나 여러 가지 원인에 의해 세포의 기능이상이 나타나는 경우 세포 내 칼슘농도가 변화하게 되고 이로 인한 신경변성이 급격하게 발생하게 된다.²⁾³⁾⁴⁾ 세포 내 칼슘의 작용은 칼슘결합단백질(calcium-binding protein)들과의 상호작용에 의해 조절되고 있다고 알려져 있는데 칼슘결합단백질들 중 몇 가지들은 중추신경계에서 확인되었고 EF-hand family의 대표적인 칼슘결합단백질인 calbindin D28K, calretinin, parvalbumin은 중추신경계 내 다양한 신경세포에 존재한다.⁵⁾⁶⁾⁷⁾
   Calretinin은 29 kDa의 분자량을 가진 칼슘결합단백질로서 Rogers에 의해 닭 망막에서 처음 분리되었고, calbindin D28K와 58%의 아미노산 서열 유사성을 가진다고 알려져 있다.⁸⁾ 또한, calretinin은 다양한 종의 내이에서 존재가 확인되었고, mouse의 경우 태생 19일에서 출생일 사이에 이미 와우 기저부의 신경절세포와 내유모세포에서 면역반응이 관찰된다고 보고되었다.⁹⁾ 칼슘결합단백질들은 칼슘 완충 또는 칼슘 전달 등의 기능이 제시되었으나 신경 및 감각세포의 생리적 역할은 아직 명확히 밝혀져 있지 않다.¹⁰⁾¹¹⁾
   본 연구는 생후 5, 17, 35일된 흰쥐 와우 조직에서 2차원적 전기영동, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight) 기법 및 NCBI protein database를 이용한 프로테옴 분석으로 calretinin을 확인하여 발현정도를 비교하고, 정량적 비교분석을 위하여 Western blot을 시행하여 와우의 발생학적 변화에 따른 와우 내 calretinin의 양적 변화를 확인하기 위하여 시행되었다. 또한, 면역형광염색법으로 발생시기별 와우 내 calretinin의 분포를 비교하여 calretinin의 양적 변화와 그 기능의 연관성을 추론해 보고자 했다.

재료 및 방법

조직 처리
   생후 5일(P5), 17일(P17), 35일(P35)된 수컷 흰쥐(Sprague-Dawley male rats)의 와우가 실험에 사용되었다. 이차원적 전기영동 및 MALDI-TOF 분석을 위해서는 각 시기별로 5마리씩 와우를 채취하여 -70℃에 보관하였고 3회 반복실험을 시행하였다. Western blot 분석을 위해서는 각 시기별로 4마리씩 와우를 채취하여 3회 반복실험하였다. 또한 면역조직형광염색을 위하여 각 시기별로 3마리의 와우가 채취되어 와우 첨단의 외부 골편을 제거한 뒤 난원창과 정원창으로 1 ml의 4% paraformaldehyde로 재관류 후 24시간 동안 고정하였다.

이차원적 전기영동 및 프로테옴 분석
   각 시기별 조직을 lysis buffer 용액(9.5 M urea, 2% CHAPS, 0.8% phamalyte(pH 3-10), 1% DTT)에 넣고 분쇄기로 분쇄하여 균질화하고 원심분리로 상층액을 채취하였고 Bradford protein assay(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 각 조직의 단백질을 400 μg씩 채취한 다음 -70℃에 보관하였다. 등전점 전기영동(IEF；isoelectric focusing)은 rehydration buffer(9.5 M urea, 2% CHAPS, 0.8% phamalyte(pH 3-10), 1% DTT, 0.001% bromophenol blue)에 sample을 혼합하여 pH 4-7의 IPG strip을 이용하여 20℃, 10 V에서 12시간 동안 active rehydration하였고, 500 V(1시간), 1000 V(1시간), 8000 V (25000 Vhrs) 순으로 조건을 변화시켜 진행하였다. Equilibrium과정 후 시행된 2차 전기영동은 12% separating gel 위에 IPG strip을 얹고 bromophenol blue를 섞은 agarose gel을 덮어 5 W에서 12시간 동안 시행하였다.
   전기영동 후 gel을 분리하여 다음과 같이 은 염색(silver staining)을 시행하였다. 40% methanol, 10% acetic acid의 혼합액에서 40분 동안 고정 과정을 거친 후 30% ethanol로 세척하고 0.02% sodium thiosulfate에서 1분간 반응시켰다. 0.2% silver nitrate, 0.02% formaldehyde(37% w/w)의 혼합액에서 20분간 반응 후 증류수로 세척하고 3% sodium carbonate, 0.05% formaldehyde(37% w/w) 용액에서 다시 반응시켰다. 은 침착에 의해 spot들이 나타나면 0.5% glycine 용액에서 반응을 정지시키고 scanning하여 컴퓨터에 영상을 저장하였다.
   영상분석은 각 군의 gel을 scanning한 후에 영상분석 software program(Progenesis workstation version 2003. 03., Nonlinear Dynamics, USA)을 이용하여 전체 spot의 수를 측정하고 설정기준 크기와 농도 이하의 spot들을 제거하는 여과 및 편집과정을 거친 뒤 각 gel의 spot들을 overlapping시키는 warping을 시행하였다. 여기서 상대 image와 비교하여 3배 이상 normalized volume의 density가 증가한 spot들을 단백분석을 위한 의미있는 spot들로 선택하였다.
   발현율 차이를 나타낸 spot들 중 calretinin의 분자량으로 알려진 29 kDa 주변의 spot들을 각 gel들에서 분리하여 다음과 같은 방법으로 in-gel digestion을 시행하였다. 30 mM potassium ferricyanide와 100 mM sodium thiosulfate를 1：1로 혼합하여 50 μl를 gel이 있는 튜브에 넣어 탈색시켰다. 200 mM의 ammonium bicarbonate 150 μl를 넣고 20분간 반응 후 수세하고 acetonitrile로 gel이 불투명해질 때까지 반복 탈수 후 상온에서 건조시켰다. 50 mM ammonium bicarbonate를 30 μl 넣고 0.1 μg/μl의 trypsin 2 μl를 넣은 뒤 얼음에서 30분 반응시킨 후 상층액을 제거한 뒤 50 mM ammonium bicarbonate를 30 μl 넣고 37℃에서 12~16시간 동안 반응시키고 상층액을 채취했다. POROS 20 R2 reversed-phase media(Applied Biosystems)를 GELoader tip(eppendorf) 끝에 packing 시킨 후 acetonitrile, 0.1% trifluoroacetic acid 20 μl로 수세 후 peptide용액을 media에 붙이고 0.1% trifluoroacetic acid 20 μl로 수세 후 0.1% trifluoroacetic acid/ 70% acetonitrile에 α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid를 녹인 matrix로 0.5 μl씩 elution받아 MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight) 분석을 시행하였다.
   MALDI-TOF 분석은 M@LDI-TOF(Micromass)를 사용하였다. 단백질의 결정은 NCBI protein database에서 모든 단백질서열로부터 계산된 이론적인 peptide mass들과 실험에서 얻어진 MALDI-TOF spectrum의 peptide mass를 Mascot(http://www.matrix-science.com)과 ExPASy(http://www.expasy.ch) site에서 비교하여 이루어졌다.

Western blot 분석
   각 시기별로 채취된 와우 조직들이 ice-cold buffer [250 mM sucrose, 1 mM ethylenediaminetetraacetate (EDTA), 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF), and 10 mM Tris-HCl buffer(pH 7.6)]로 균질화되었고, US microtip으로 90% duty circle로 얼음에서 1분 동안 초음파 파쇄되었다. 조직파편과 핵 분절들은 원심분리(10,000×g for 10 min)로 제거되었고 상층액만 채취하였다. Bradford protein assay(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 각 시료의 단백질을 30 μg씩 채취한 다음 전기영동을 시행하였다. 전기영동은 12% polyacrylamide resolving gel과 5% polyacrylamide stacking gel로 구성된 discontinuous system을 이용하였고 전기영동 후 polyvinylidene fluoride(PVDF) transfer membrane에 전이시켰다. 전이된 막은 TBST[10 mM Tris-HCl(p.H 7.6), 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20]로 세척 후 5% skimmed milk in TBST로 1시간 동안 반응시켰다. 2% skimmed milk를 포함한 TBST에 goat anti-calretinin antibody(diluted 1：1000；Chemicon, CA, USA)를 넣고 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 세척하고 horseradish peroxidase 중합항체(donkey anti-goat Ig G, diluted 1：1000；Santa Cruz Biochemicals, CA, USA)로 1시간 처치하고 세척하였다. 이후 각 lane의 band들은 enhanced chemiluminescence(ECL kit, Amersham Pharmacia Biotech, England, UK)로 발색되었고 분자량 42 kDa의 Actin 항체(Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA)도 반응시켜 actin band 세기와 비교된 각 band의 강도를 비교하였다.

면역조직형광법
   4% paraformaldehyde로 고정된 조직들은 동결에 의한 세포 손상을 방지하기 위하여 자당 첨가 인산 완충용액을 10%, 20%, 30% 순으로 30분씩 세정하고 30% 자당과 OCT compound(TissueTek 4583, Sakura Finetechnical Co. Ltd., Tokyo, Japan)를 2：1, 1：1, 1：2 비율로 혼합하여 30분씩 순서대로 세정하였다. 각 조직은 OCT compound에 포매, 동결시킨 후 동결 미세절단기를 이용하여 10 μm의 연속 동결절편을 만들고 Silane coating microscope slide(15-188-52, MUTO-GLASS, Japan)에 부착시켜 -70℃에 냉동 보관하였다. 냉동 보관된 동결절편을 상온에서 10분동안 건조 후 인산 완충용액에 10분간 3회 세척하고 실온에서 10분간 10% fetal bovine serum in 0.3% Triton-X PBS 혼합액으로 반응시켰다. 일차항체로서 1：200으로 희석된 goat anti-calretinin antibody(Chemicon, CA, USA)를 넣고 4℃에서 하룻밤 동안 반응시킨 후 인산 완충용액으로 세척하고 이차항체로서 1：500으로 희석된 Alexa 555(Molecular probes, Inc., Eugene, OR, USA)에 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 3차 증류수로 10분간 3회 세척 후 Faramount로 봉입하였고 Olympus IS50(Olympus Optical Co, LTD. Japan) 현미경을 사용하여 각각의 조직절편에서 calretinin을 함유하는 신경세포를 관찰하였다.

결     과

   이차원적 전기영동으로 얻어진 gel에서 각각 2000개 이상의 단백질 spot들을 확인하였고 영상분석하여 여과 및 편집한 후 각 gel당 약 1000개 이상의 spot들이 관찰되었다. Calretinin의 분자량으로 알려진 29 kDa 주변의 주요 spot들을 선택하여 MALDI-TOF 분석한 결과 pI 4.9의 위치에서 P17, P35의 calretinin이 확인되었으나 P5는 의미있게 증가된 발현이 나타나지 않았다(Fig. 1).
   Western blot 분석에서 각 시기별 band들은 actin에서 나타난 band와 비교하여 의미있게 증가된 calretinin 단백의 발현을 나타냈다. P5는 calretinin 단백발현의 강도가 약하였으나 P17과 P35는 강한 강도를 나타냈고 P17과 P35 사이에 발현의 유의한 차이를 나타내지 않았다(Fig. 2).
   면역조직형광법을 이용하여 각 시기별 와우의 calretinin 발현양상을 비교한 결과 P17과 P35는 내유모세포와 대부분의 나선신경절에서 강한 calretinin의 발현이 나타났고 두 시기별 발현정도의 유의한 차이가 없었다. 그러나 P5는 내유모세포에서 약한 정도의 calretinin 발현이 나타났고 나선신경절의 발현도 전반적으로 매우 약하게 관찰되었다(Fig. 3).

고     찰

   칼슘결합단백질들은 특징적인 3차원적 구조를 가지는 아미노산기인 EF-hand family의 구성원이며 EF-hand는 칼슘과 높은 친화력을 가진 접합부위이다. EF-hand family는 척추 및 무척추동물에서 150개 이상의 표현형으로 알려져 있고 척추동물에서 8개의 subfamily로 분류되어 있다.¹⁰⁾ 그러한 EF-hand는 세포 내 구획에서 생리적 농도 하에 칼슘과 결합하게 되나 EF-hand loop의 돌연변이가 발생하는 경우 칼슘과의 결합력을 잃게 된다.¹²⁾ Calretinin은 calbindin subfamily의 하나로서 신경조직과 흉선에 존재한다고 알려졌으나(Kiraly and Celio, unpublished observation), 이후 와우 내 신경절과 유모세포에서도 존재함과 이와 관련된 유전자가 16번 염색체에 위치함이 밝혀졌다.¹³⁾ 동물에 따라서는 calretinin의 일시적 발현이 관찰되는데 칼슘 이온이 세포분열 및 진행, 세포이동 등을 조절하므로 이와 관련하여 발생하는 현상으로 설명되기도 한다.¹⁴⁾ 사람에서도 칼슘결합단백질의 발현이 여러 부위에서 발견되었으나 사람 와우 내 calretinin의 발현은 아직 보고된 바가 없고 주로 뇌신경계 부위의 발현이 연구되어지고 있다.¹⁵⁾ 칼슘결합단백질들이 다양한 종의 다양한 신경계 부위에서 발현의 변화(증가, 감소, 일시적 발현 등)를 보이는 것은 이들의 일반적 기능이나 특성이 발생학적 발달과 연관성이 약함을 의미할 수도 있겠으나 아직까지도 calretinin의 기능은 상세히 알려져 있지 않다. 세포 내 칼슘의 생리적 기능과 연관하여 전기적 신호전달과정에서 역할이 있을 것으로 추측되며 다른 단백질과의 상호작용, 칼슘 확산의 보조¹⁶⁾ 또는 세포질 내 국소 칼슘 농도에 대한 완충효과 제공 등을 할 것으로 생각되고 있다.⁸⁾ 또한, 세포 내 칼슘 감지자(calcium sensor)로서의 기능도 추측되고 칼슘이 관련된 효소활동을 중개한다고 생각되기도 한다.⁷⁾ 본 연구에서 calretinin은 와우의 급격한 성숙시기에 발생하는 신경학적 발달과정에서 신경학적 항상성을 조절하여 기능적으로 안정된 세포 내 상태를 유지하는 칼슘 완충자(calcium buffer)로서의 기능을 할 것으로 추측된다.
   칼슘결합단백질들은 신경계의 신경해부학적 연구분야에서 뇌신경부위의 효과적인 표지자로서 주로 사용되고 있으며 특히 calretinin 항체는 세포이식을 이용한 내이 유모세포의 분화 및 신경재생 등의 연구분야에서도 뛰어난 발현능력을 보여 많은 연구들에서 이용되고 있다.¹⁷⁾
   본 연구에서 흰쥐의 와우 발달시기를 P5, P17, P35로 분류한 것은 흰쥐 와우의 청각발달이 시작되는 시기가 생후 10일에서 14일이므로 그 이전과 직후, 그리고 초기 성숙기로 구분한 것이고 P17은 Freeman 등의 보고에서와 같이 정상적인 청력을 획득하는 시기의 말기로 정의될 수 있다.¹⁸⁾
   흰쥐의 calretinin의 발현은 와우 내 내유모세포와 대부분의 나선신경절세포에서 관찰된다고 보고되었고¹⁹⁾ 본 연구도 면역조직형광법에서 이와 유사한 결과를 나타냈다. 그러나 mouse와 비교했을 때 생후 5일에서 내유모세포와 나선신경절세포의 calretinin 발현이 매우 약하였으며 mouse에서 생후 1일부터 13일 정도까지 일시적으로 나타난다고 알려진 외유모세포의 발현이 흰쥐에서는 나타나지 않았다. 전체 와우 조직 내 단백질에서 calretinin의 양을 비교한 Western blot으로 와우 조직 내 calretinin 분포양상을 비교해보아도 P5의 calretinin은 발현은 가능하다 해도 양적으로 매우 희소할 것으로 예측되었다. 또한, Western blot 분석을 통한 정량적 분석 외에 이차원적 전기영동을 이용한 프로테옴기법으로 calretinin의 확인 및 발현정도의 비교를 시도하였는데 이차원적 전기영동법을 이용한 와우 단백의 분리를 통해서도 P5에서 calretinin의 발현이 거의 관찰되지 않음이 확인되었다. 본 연구에서는 단백 발현의 확인을 위하여 은 염색법(silver staining)을 사용하였는데 이 방법은 강염기, 강산반응으로 인해 단백질 내 일부 아미노산이 변형될 수 있는 점과 발현강도와 존재하는 단백질의 농도가 비례하지 않을 수 있는 단점은 있으나 0.6~1.2 ng 정도의 단백질 양으로도 검출이 가능하고 쿠마시 블루(Coomassie blue)에 비해 10배에서 100배까지의 향상된 검출능력을 가지고 있다. 그럼에도 불구하고 Western blot 분석 결과 P5에서도 약한 calretinin 발현이 확인되나 이차원적 전기영동에서 확인되지 않은 이유는 상기된 바와 같은 은 염색법의 한계와 낮은 발현빈도를 가지는 단백체들의 분석상 어려움 등의 문제 때문으로 생각된다. 이에 대한 해결을 위해서는 소량의 프로테옴 분석에 가장 적합한 고감도 단백질 염색법이고 은 염색법과 동일한 검출강도를 보이는 SYPRO orange나 SYPRO red같은 유기형광염료의 사용을 고려할 수 있으나 본 연구에서는 Western blot 분석에 의한 정량화를 시행하므로 기존의 은 염색법을 사용하였다.
   골조직을 제외하고 흰쥐 와우 신경의 일부를 포함한 전체 와우 조직 내 calretinin의 양은 P17과 P35에서 거의 유사하게 나타났는데 이러한 결과는 P5 이후 특정 시점부터 와우 조직 내 calretinin의 생성이 증가하기 시작하여 와우의 형태학적 및 기능적 성숙이 완성되는 시기에 정상적인 유지량에 도달하게 되는 것으로 생각되며 이에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다. 또한 나선신경절은 크기가 크고 대부분을 차지하며 내유모세포와 연결되는 제 1 형 세포들과 보다 작고 소수이며 몇몇 외유모세포들과 연결되는 제 2 형 세포들의 두 가지 서로 다른 형태의 세포들로 구성되어 있는데 본 연구에서는 제 1 형 나선신경절 세포들에서 주로 발현된 것으로 보여지며 이는 내유모세포의 calretinin 발현결과와 일치되어 두 가지 세포들의 기능과 발현에 관련된 연구를 계획하고 있다.
   최근 calretinin이 노화과정에서도 발현의 차이를 나타낸다고 보고되었는데 노화과정이 빠르게 진행되는 C57BL/6J mouse를 이용하여 와우 내 병리소견과 와우핵의 calretinin 발현을 비교한 결과 노화가 진행됨에 따라 청각 말단의 변성이 와우핵의 칼슘결합단백질의 발현을 증가시켜 신경 항상성을 조절하고 이는 칼슘결합단백질의 노화에 의한 칼슘독성의 보호역할 가능성을 제시한 것이다.²⁰⁾ 그러나 아직까지도 칼슘결합단백질의 신경보호 역할은 구체적으로 입증되어지지 않았고 이러한 칼슘결합단백질들이 세포 내 칼슘이온의 일시적 또는 영구적 증가를 감소시켜 이로 인한 세포손상을 방지할 수 있다는 것이 확인된다면 칼슘결합단백질을 이용하여 알츠하이머병(Alzheimer's disease)이나 파킨슨병(Parkinson's disease)같은 신경변성 질환에서 신경세포사를 예방하는 약물개발이 가능할 수 있을 것이다.
   결론적으로 칼슘결합단백질의 하나인 calretinin은 흰쥐 와우의 성숙시기에 내유모세포와 나선신경절세포에서 발현의 증가가 관찰되었다. 이것은 세포 내 생리적 기능의 급격한 발달시기에 발생하는 세포 내 calcium 농도 변화에 대한 칼슘결합단백질로서의 본격적인 역할을 위한 변화일 것으로 예상되며 이에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.

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