교신저자：여승근, 130-702 서울 동대문구 회기동 1  경희대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   경부의 림프계는 경부 자체와 안면, 구강, 상지, 흉부, 유방, 복부로부터 흉관을 통해 유입되는 복잡한 구조를 가진다. 특히 경부 림프절은 몸 전체의 림프조직과 림프절의 약 30%를 차지하며 악성종양, 세균 또는 외부 병원균 등이 몸 전체로 퍼지는 것을 막는 일차 방어의 역할을 수행한다. 림프절에는 여러 세포들이 존재하는데 이중 B 림프구는 항원 인식, 항원 제시, 항체 형성, 면역 조절 등의 중요한 역할을 수행하며, IgM, IgD에 대한 수용체를 가지고 있으며 CD19, CD20, CD21의 표면 표지자를 갖고 있다. 이런 B세포 중 CD5라는 pan-T 세포 표면 당단백질을 표현하는 기존에 알려진 B세포와는 다른 특징을 가진 B-1세포가 존재한다. 즉, B세포는 CD5양성인 B-1세포와 CD5음성인 B-2세포로 나누는데, B-1세포는 B임파구의 한 아형으로 CD5+++ 이외에 sIgM++, sIgD+, B220+, CD23+, CD43+++의 표현형을 나타내며 어른 쥐에서 주로 복강 및 흉강에서 많이 존재하는 반면 비장에서는 아주 적은 비율로 존재하고 임파선과 말초혈액에서는 존재하지 않는 것으로 알려져 있다.¹⁾²⁾³⁾ 이와는 다르게 B-2세포는(sIg)M+, sIgD+++, B220+++, CD23+++, CD43+를 나타내고 비장, 임파선, 말초혈액에서 주로 존재하는 것으로 알려져 있다. 형태학적으로 B-1세포는 B-2 세포에 비해 밀도는 적은 반면 크기는 큰 차이점을 가지고 있다. 
   B세포가 T 세포에서 생산되는 싸이토카인, 혹은 T 세포 비의존성 항원에 자극을 받게 되면 증식과 분화과정을 겪고 그 과정 중 대부분의 세포는 세포자사(apoptosis)가 되고, 분화과정 뒤 최종적인 효과세포인 형질세포(plasma cell) 혹은 기억세포(memory cell)가 된다. 
   B림프구에 대한 연구에 주로 이용되는 자극물질은 CD40L, lipopolysaccharide(이하 LPS), Interleukin-4(이하 IL-4) 등이 알려져 있다. T세포 의존성 항원인 CD40L, IL-4는 B림프구의 증식과 분화, 부착, 면역 글로블린 종류의 전환 및 세포골격 활성화를 유도하면서 림프 기관에서의 B림프구의 귀소와 국소화에 있어 중요한 역할을 하게 된다. T 세포 비의존성 항원인 LPS의 경우는 다른 세포나 싸이토카인의 도움 없이 B계통 세포의 활성화, 증식 및 분화를 자극할 수 있다.³⁾⁴⁾ 
   현재까지 보고 된 대부분의 경부 림프절에 대한 연구들이 병리상태에 치중하거나 타 실험의 대조군으로만 이용되어 왔고 정상적인 림프절의 B 림프구에 대한 연구는 미비한 실정이다. 또한 림프절에서 B-1세포가 존재하고 있지 않다고 알려져 있었지만 통계학적으로 무시할 수 있는 아주 적은 비율이지만 B-1세포가 존재할 가능성이 보고 되고 있다. 이에 저자들은 생쥐의 정상 경부 림프절에 존재하는 B림프구의 세포표면인자, 항체생산, 항체생산을 조절하는 유전자, 그리고 증식상의 특징 뿐만 아니라 B-1세포가 존재하는지 등에 대해 알아보고자 하였다.

대상 및 방법

대  상
   실험동물로 8~14주의 수컷 BALB/cByJ 생쥐를 이용하였으며 실험 1주일 전부터 실험동물 건강 및 연구실 지침서에 의하여 취급하였다.

방  법

B 림프구의 정제
   림프절은 유리 슬라이드를 이용하여 조직을 부스러뜨린 후 70 μm 크기의 나일론 그물(mesh)에 통과시켜 결합조직을 제거하였다. 그 후 1500 rpm, 4℃에서 5분간 원심 분리하여 상층액을 버린 후 남은 세포 무리에 적혈구 용해액(Sigma, MO, USA) 3 ml을 첨가하여 50 ml 튜브에 옮긴 후 실온에서 3분간 두어 적혈구를 제거하였다. 그 후 6 ml의 Hanks Balanced Salt Solutions(이하 HBSS)/2% Fetal Bovine Serun(이하 FBS)를 넣은 후 원심 분리하여 12.5 μl α-Thy 1.2(1：800)를 첨가하여 45분간 얼음에 방치한 후 다시 원심분리 한 후 HBSS/2% FBS 10 ml에 500 μl의 항체(1：20)을 첨가하여 45분간 온수에 방치하여 T 림프구를 제거하였다.⁵⁾ 또한 여러 불순물과 다른 세포의 분리를 위해 Lympholyte-M(Cedarlane, Ontario, Canada)을 이용하여 1670 rpm에서 20분간 원심 분리하여 림프구가 있는 중간층만 채취 하였다. 그 후 열처리된 5% 소 혈청 10 mM, hepes 50 μM, 2 mM L-glutamate, 100 U/ml penicillin 그리고 100 μg/ml streptomycin이 첨가된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다.
   정제된 B 림프구는 유세포 분석을 위한 0.5×10⁶개의 세포, 면역글로불린의 양을 측정하기 위한 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay(이하 ELISA) 2.0×10⁶개의 세포, 세포주기 중 합성기를 관찰하기 위해 2.0×10⁶개의 세포, 3군으로 나누었다. 

유세포 분석(Flow cytometry)：세포표면염색
   96 well에 약 5만개씩의 세포를 넣고 1500 rpm, 4℃에서 5분간 원심분리 한 후 상층액을 버리고 B 림프구를 염색하기 위해 Fluorescein isothiocyanate(이하 FITC)가 결합된 단복제성의 anti-CD220(BD Pharminogen, San Diego, CA) 또는 anti-Ig D, Phycoerythrin(이하 PE)이 결합된 단복제성의 항체인 anti-CD5, anti-CD23, anti-CD25, anti-CD43, anti-CD80(B7.1), anti CD86(B7.2) anti-CD220, anti M 또는 anti-Syndecam-1 넣고 4℃냉장고에서 45분간 방치한 후 HBSS 용액을 첨가하여 원심분리 한 후 250 μl의 stain buffer를 넣어 Falcon tube에 옮겨 놓았다. 유세포 분석은 FITC를 전방 산란신호로 삼고 PE를 측면 산란신호로 삼아 점분포를 얻었다. 사용된 단복제성 항체 중 anti-CD220는 B세포, anti-CD5는 B-1세포, anti-CD23는 활성화된 B세포, anti-CD43은 기억세포, anti-CD80(B7.1)와 anti CD86(B7.2)는 보조자극인자(co-stimulatory factor), anti IgM 와 IgD는 B cell receptor(이하 BCR), anti-Syndecam-1은 혈질세포의 감지를 위해 사용하였다. 

효소면역흡착법(ELISA)
   B 림프구를 단지 배지만 넣은 군, 25 μg/ml의 LPS 첨가 군, 10 ng/ml의 IL-4 첨가 군, 1：10의 CD40L+1：40의 CD8α 첨가 군, 4개의 소그룹으로 나누어 배양한 후 배양 1, 2, 3, 5일째에 회수하여 실험에 사용되기 전까지 -80℃에서 냉동보관 하였다. 면역 글로불린 M 항체의 양을 효소면역흡착법에 의해 다음과 같이 측정하였다. 편평한 96 well에 각각 coating buffer(1.59 g Na2CO3+2.93 g NaHCO3+5% NaN3, pH 9.6)에 goat anti-mouse Ig(H+L)(Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL)를 1：400으로 혼합하여 50 μl씩 분주하여 4℃ 방에서 하룻밤 방치하였다. 96 well을 6차례 세척한 후 저지항체용매를 사용하였다. 표준 곡선표를 위해 양성 대조군과 음성 대조군을 만든 후 채취한 상층액 표본을 50 μl씩 넣고 실온에서 3시간 배양하였다. 다시 6차례 세척한 후 PBS/Tween/BSA 용매에 horseradish peroxidase가 붙은 정제된 goat anti-mouse IgM, IgG 또는 IgA를 넣고 실온에서 배양하였다. 6차례 세척 후 기질용액 2,2'-AZINO- Bis(Sigma-Aldrich Inc., Saint Louis, Missouri)을 넣은 후 414 nm(Dynex Technologies, Chantility, VA)에서 흡광도를 측정하였다.

B 림프구의 증식(Proliferative assay)
   편평한 96 well(Costar, Cambridge, MA)에 4개의 소그룹으로 나누어 각각 3.0×10⁴개의 B 림프구를 각 군마다 4개씩 만들어 37℃, CO₂ 배양기에 24시간과 48시간 배양하였다. Tritium incorporation은 배양이 끝나기 6시간 전, 즉 18시간째와 42시간째에 0.5 μCi의 [³H]thymidine(Dupont Co, NEN Research Products, Boston, MA)를 첨가하여 6시간 동안 다시 CO₂ 배양기에 배양한 후 세포주기 중 합성기로 들어가는 세포의 수를 Liquid scintillation & Luminescence counter(PerkinElmer, Wellesley, MA)으로 측정하였다. 결과치는 평균 분당 세포수(cpm) 값으로 나타냈고, 4배수로 만든 각 군의 값은 10% 미만의 평균값을 보였다.

시약(Reagents)
   LPS는 Salmonella typhimurium으로부터 얻었으며, 가용성의 재조합된 CD40L은 chimeric CD40L/CD8α 융합단백을 분비하는 transfected J558L 세포에서 얻어 분리하였다. Anti- CD8α 항체는 53-6-72 잡종 세포의 상청액에서 얻어 분리하였다. 

통계 및 분석
   Mann-Whitney's U법을 이용하여 통계처리하였고 유의수준은 p<0.05로 하였다.

결     과

유세포 분석(Flow cytometry)
   림프절 B 림프구의 표현형은 CD5^low, CD23^high, CD43^low, B220^high, Ig(sIg)M^low, sIgD^high, CD80(B7.1)^low, CD86 (B7.2)^low, and Syndecam-1^low를 보여 전형적인 B-2 세포의 표현형을 나타냈다(Fig. 1).

LPS는 IgM 분비를 자극. 
   자발적인 IgM, IgA 또는 IgG의 분비는 없었고 LPS로 자극하였을 때 IgM 분비가 증가(1, 2일째 0 ng/ml, 3일째 3360±392 ng/ml, 5일째 3743±402 ng/ml) 하였고 IgG (1, 2, 3일째 0 ng/ml, 5일째 1164±261 ng/ml)와 IgA (1, 2, 3일째 0 ng/ml, 5일째 565±75 ng/ml)도 뒤이어 증가하였다(Fig. 2A, B and C). CD40+anti-CD8α로 자극하였을 때 IgM만 생산되었으나 IgG와 IgA는 생성되지 않았으며 IL-4로 자극했을 때도 이와 비슷한 결과가 나왔다(IgM 5일째 1017±110 ng/ml). 여러 자극 중에서 LPS가 가장 많은 IgM을 생산 하였다. 

CD40+anti-CD8α은 세포합성기로의 진입을 촉진
   LPS, CD40L, IL-4로 자극하였을 때 림프절의 B 림프구에 대한 [³H]thymidine incorporation은 배양 24시간째에는 자극되지 않다가 48시간 째 세포합성기로의 진입이 촉진된다. 
   CD40+anti-CD8α 자극 24시간째 229×10³±23×10³ cpm 48시간 째에는 3526×10³±307×10³ cpm이였다. LPS의 경우는 24시간째 256×10³±25×10³ cpm, 48시간째 2790×10³±254×10³ cpm이었으며, IL-4는 24시간째 171×10³±18×10³ cpm이고 48시간째 256×10³±28×10³ cpm값을 나타내었다. 하지만 IL-4가 전형적인 B 림프구의 성장과 분화 인자로 알려져 있지만 세포주기의 활성을 시키진 않았다(Fig. 3).

고     찰

   B 림프구는 항체 매개성 면역의 주된 기능을 담당하고있다. 항체가 체액 속에서 분비되어 존재하기 때문에 체액성 면역으로 알려져 있으며 이 세포들은 혈액, 골수, 비장, 흉선 그리고 말초 림프조직에 불균등하게 분포하고 있으며 T림프구에 대한 B 림프구의 비율도 각 조직 및 기관에 따라 다소 차이가 있다. B 림프구는 흉선에서는 거의 발견되지 않고 혈액에서는 T 림프구와 B림프구의 비율이 8：1 정도를 나타낸다. 이 비율은 비장에선 1：1 그리고 골수에서는 1：3으로 변한다.⁶⁾ 본 연구에서 생쥐 경부림프절에 존재하는 B 림프구와 T 림프구의 비율은 유세포 분석에 의하면 1：2.8±0.76으로 나와 림프절에서는 T 림프구가 많음을 알 수 있었다. 
   B 림프구는 B-1과 B-2세포로 나눠지는데 B-1세포는 범 T 세포 표면 당단백질인 CD5를 발현시켜 기존에 알려진 B-2세포와 구분된다. B-1세포의 경우 세포 표면에 CD5 이외에 sIgM^high, sIgD^low, CD23^low, CD43^high, B220^low를 나타내는 반면 B-2세포는 sIgM^low, sIgD^high, CD23^high, CD43^low, B220^high를 발현한다.⁵⁾ 본 연구에서 경부림프절의 B 림프구는 B220 양성이면서 sIgM^low, sIgD^high, CD5^low, CD23^high, CD43^low, B220^high, BCD80(B7.1)^high, CD86(7.2)^low, 그리고 Syndecam-1low을 보여 림프절의 B 림프구는 전형적인 B-2세포임을 알 수 있었다. 비장에 존재하는 B 림프구는 대부분 B-2세포이고, 복강 내 B 림프구의 구성은 주로 B-1세포이다.⁷⁾⁸⁾ 임파선과 말초혈액에서는 B-1세포가 존재하지 않는 것으로 알려져 있는데 본 연구상의 3.5 % B220+CD5+세포들은 혈액이나 림프관을 통해 경유하는 것인지 아니면 상주하는 것인지는 확실하게 알 수는 없지만 모든 종류의 림프구가 체내를 통해 이동하므로 B220+CD5+세포들 또한 조직을 통해 이동하여 혈관이나 림프관으로 들어가기 때문에 림프절에도 B-1세포가 존재하리라 생각되었다. 
   B 세포가 T 세포 의존성, T 세포에서 생산되는 싸이토카인, 혹은 T 세포 비의존성 항원에 자극을 받게 되면 증식과 분화과정을 겪고 그 과정 중 대부분의 세포는 apoptosis 되고, 분화 과정 뒤 최종적인 효과세포인 형질세포 혹은 기억세포가 된다. 경부 림프절의 B 림프구는 T 림프구 수용체인 CD40+anti-CD8의 자극이나 T림프구가 분비하는 싸이토카인 중의 하나인 IL-4보다 오히려 T 세포 비의존성의 항원인 LPS에 의해 자극 받을 때 주로 IgM을 분비했고 뒤이어 IgG와 IgA를 분비했다. LPS가 다른 세포나 싸이토카인의 도움 없이 B 세포 계열의 분화를 자극할 수 있다는 것은 잘 알려져 있다. 
   본 연구에서도 LPS가 B 림프구의 증식과 분화를 활성화시켰고 CD40L이나 IL-4와 비교해 가장 활동적으로 세포 분화를 자극시킬 수 있다는 것을 알 수 있었다. 자극의 종류 또는 병리생리학적 상태에 따라서 B 림프구에 의해 생산되는 면역글로불린의 종류는 다르다. 이비인후과 영역에서 일부 저자들은 중이와 비점막의 정상 및 병리 상태에서 B세포의 항체생산과 관련하여 B세포는 IgA 분비와 관련 있다고 보고했고 다른 저자들은 IgM 보다는 IgG분비와 관련 있다고 보고했다. 저자들은 이런 현상이 아마도 면역체계에 따른 분비기능과 연관이 있을 것으로 생각되었다. 
   세포의 유형, 즉 B-1과 B-2세포의 분포정도 또는 세포가 위치한 기관의 면역체계, 또는 자극의 종류에 따라서 면역글로불린 종류와 분비량이 영향 받을 수 있다. 
   비용종은 IgG와 IgM을 주로 생산하고 자발적인 IgA분비도 관찰되는 반면, 중이점막에서는 IgA생산 세포가 다수를 차지하고 IgM생산 세포가 소수를 차지한다.⁹⁾¹⁰⁾ 이와 반대로, 아데노이드에 존재하는 CD5+와 CD5- B림프구는 IgA와 IgM생산 세포보다는 IgG를 생산하는 세포를 많이 갖고 있다.¹¹⁾ 그러나, 본 연구를 통해 경부림프절에서 자발적인 면역글로불린 분비는 없고 자극 시 B 림프구가 IgA나 IgG 대신에 IgM을 주로 분비하여 IgM과 관련된 면역 방어체계와 관련되어 있음을 알 수 있었다. 이런 면역체계는 일차 B 림프구는 정상적으로 세포주기 중 G0기에 머물러 있다가 B 림프구 표면의 면역글로불린 수용기에 존재하는 교차 항원에 의해 대사변화를 일으켜 세포주기를 자극하여 세포 합성기로 들어가게 한다. 본 연구에서 림프절의 B 림프구는 자극 24시간째는 증식반응이 안 일어나고 48시간째 증식이 활발하게 증가함을 보여 B-2 세포의 전형적인 세포주기 특징을 보여주고 있다. Rothsteine 등¹²⁾의 보고에 의하면 항 Ig 자극시 B-1세포는 별다른 반응이 없었지만 B-2세포는 활발하게 세포주기가 진행됨을 알 수 있었는데 그 이유로 B-2세포는 충분한 phospholipase C(이하 PLC)의 활성이 일어나는 반면 B-1세포의 경우는 충분한 PLC의 활성이 일어나지 않고 D5-associated SHP-1 phosphatase에 의한 신호전달 조절에 문제가 있기 때문이라 생각된다. 하지만 phorbol ester만의 자극 시 B-1세포는 thymidine incorporation에 의한 최고 증식점은 24~30 시간 후에 일어났지만 B-2세포에서는 phorbol ester 만으로는 세포증식반응이 일어나지 않았고 phorbol ester에 calcium ionophore를 같이 첨가한 상태에서 24~30 시간이 아닌 54~60 시간 후에 thymidine incorporation 값이 최고점에 다다랐다. 이러한 B-2세포의 phorbol ester 자극에 반응이 미약하거나 없는 것은 cyclin D2가 생산이 안되고 이로 인해 cyclin D2와 cyclin D3가 cyclin dependent kinase 4/6와 복합체를 이루지 못하기 때문이라 보고 하였다. 또한 phorbol ester가 비록 B-2세포에서 cyclin D3-cdk 복합체를 만들 수 있지만 이런 복합체가 phosphorylate pRb를 일으킬 수는 없는 것도 한 이유로 보았다.^12)13)14)15) 이러한 차이점으로 인하여 다양한 물질이 B 림프구의 표면 수용기에 자극되었을 때, B-2세포는 phospholipase C는 활성화되고 cyclin D2 생산이 안되는 차이점으로 B-1세포와는 다른 세포증식반응을 보이게 된다. 본 연구에서 LPS와 CD40L 자극에 의해 B-1세포가 자극 1일째부터 점차 세포증식이 활발하게 일어난 반면 B-2세포에서는 자극 2일째에 세포증식이 일어나(Fig. 3) thymidine incorporation에 의한 최고점이 B-1세포에서 자극 1일째가 아니라는 점 이외에는 phorbol ester 단독 혹은 calcium ionophore 혼합 자극 시와 비슷한 양상을 나타내었다. 하지만 LPS와 CD40L 자극에 의한 B-1세포와 B-2세포내 신호전달체계의 차이점은 좀 더 연구가 필요하리라 판단된다. 

결     론

   본 연구를 통해 생쥐의 경부림프절에 위치한 B 세포의 표현형은 CD5^low, CD23^high, CD43^low, B220^high, Ig(sIg) M^low, sIgD^high, CD80(B7.1)^low, CD86(B7.2)^low, and Syndecam-1^low을 보여 전형적인 B-2 세포의 특징을 보였다. 자극을 받을 때 IgM 분비가 IgA와 IgG 보다 더 높게 증가하고 [³H]thymidine incorporation법에서 B림프구는 자극 2일 째부터 세포증식이 일어남을 알 수 있었다. 이상의 결과를 바탕으로 향후 병적상태의 연구에 이용될 기초자료로 이용될 수 있으리라 사료된다. 

1. Ferlin WG, Severinson E, Strom L, Heath AW, Coffman RL, Ferrick DA, et al. CD40 signaling induces interleukin-4 independent IgE switching in vivo. Eur J Immunol 1996;26:2911-5.

2. Davey EJ, Thyberg J, Conrad DM, Severinson E. Regulation of cell morphology in B lymphocytes by interleukin 4: Evidence for induced cytoskeletal changes. J Immunol 1988;160:5366-73.

3. Richard JU. Therapeutics targeting the innate immune system. Immunol 2004;4:512-20.

4. Calmame KL, Lin KI, Tunyaplin C. Regulatory mechanisms that determine the development and function of plasma cells. Annu Rev Immunol 2003;21:205-30.

5. Marshak-Rothstein, Fink P, Gridly T, Raulet DH, Bevan MJ, Gefter ML. Properties and application of monoclonal antibodies directed against determinants of the Thy-1 locus. J Immunol 1979;122:2491-7.

6. Morris DL, Rothstein TL. Analysis of B-1 cell activation. METHODS: A Companion to Methods in Enzymology 1995;8:11-25.

7. Rothstein TL. Cutting Edge: Commentary: Two B-1 or Not To Be One. J of Immunology 2002;168:4257-61.

8. Morris DL, Rothstein TL. Analysis of B-1 cell activation. Methods: A Comparison to Methods in Enzymology 1995;8:11-25.

9. Segura AS, Brieva JA, Rodriguez C. Regualtion of immunoglobulin secretion of plasma cells infiltrating nasal polyps. Laryngoscope 2000;110:1183-8.

10. Suenaga S, Kodama S, Ueyama S, Suzuki M, Mogi G. Mucosal Immunity of the Middle Ear: Analysis at the single cell level. 111. Laryngoscope 2001;111:290-6.

11. Arita M, Kodama S, Suzuki M, Mogi G. Single cell analysis of adenoid CD5+B cells and their protective contributions to nasopharyngeal immunity. Laryngoscope 2003;113:484-91.

12. Rothstein TL, Kolber DL. Anti-Ig Ab inhibits the phorbol ester-induced stimulation of peritoneal B cells. J Immunol 1988;141:4089-93.

13. Piatelli MJ, Tanguay D, Rothstein TL, Chiles TC. Cell cycle control mechanism in B-1 and B-2 lymphoid subsets. Immunol Res 2003;27: 31-52.

14. Tanguay DA, Colarusso TP, Doughty C, Pavlovic-Ewers S, Rothstein TL, Chiles TC. Cutting edge: Differential signaling requirements for activation of assembled cyclin D3-cdk4 complexes in B-1 and B-2 lymphocyte subsets. J Immunol 2001;166:4273-7.

15. Tanguay DA, Colarusso TP, Pavlovic S, irigoyen M, Howard RG, Bartek J, et al. Early induction of cyclin D2 expression in phorbol ester-responsive B-1 lymphocytes. J Exp Med 1999;189:1685-90.