교신저자：윤주헌, 120-752 서울 서대문구 신촌동 134  연세대학교 의과대학 이비인후과학교실
              전화：(02) 361-8484, 8470 · 전송：(02) 393-0580 · E-mail：jhyoon@yumc.yonsei.ac.kr

서     론

   기도 상피는 생리적으로 점액을 분비하여 점막을 보호한다. 하지만 비염, 부비동염, 기관지천식 및 만성 기관지염과 같은 염증성 기도질환에서는 과분비된 점액이 중요 증상들을 야기하기도 한다.^1)2)3)4) 점액은 주요 구성성분인 점소(mucin)와 그 외에 다른 여러 단백들로 이루어져 있다. 하지만 기도상피에서 생성되는 단백이 전체적으로 어떻게 이루어져 있고 이들의 기능이 어떠한지에 대한 연구는 미비하다. 이러한 단백 및 유전자의 정보는 기도 상피에 대한 완전한 정보를 제공할 뿐 아니라 이들의 pattern은 기도상피의 생물학적 동태에 대한 좋은 정보 제공자가 될 것임에 틀림이 없다. 뿐만 아니라 분화의 과정이나 어떠한 자극에 의해 변화하는 단백 및 유전자의 정보는 여러 기도질환을 해결하는 실마리를 제공할 것으로 생각된다.
   Interleukin(IL)-1β는 비염 및 부비동염, 기관지 천식, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 만성 기관지염, 섬유성 낭종(cystic fibrosis) 등의 염증성 기도질환에 중요한 역할을 하는 사이토카인이다.⁵⁾ 또한 IL-1β는 염증성 기도질환의 병태생리에 중요한 역할을 하고 있는 점소(MUC2, MUC5AC, MUC8)를 증가시키는 것으로 알려져 있다.⁶⁾⁷⁾ 하지만 기도상피에서 IL-1β에 의해 유도되는 점액의 과분비에 관련된 유전자 및 단백을 총제적으로 조사한 연구는 아직 없다. 
   저자들은 염증성 매개물인 IL-1β에 의해 조절되는 기도상피세포의 유전자 및 단백을 2-D PAGE(2-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis) 및 MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization- time of flight) MS(mass spectrometry)와 cDNA microarray를 이용하여 비교, 분석하고자 하였다.

재료 및 방법

시  약
   사용된 시약은 다음의 회사에서 구입하였다. Complete protease inhibitor cocktail tablets(Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA), Pharmalyte 3-10(Pharmacia Corporation, Peapack, NJ, USA) trypsin(Promega Corporation, Madison, WI, USA). 다른 모든 시약은 Sigma-Aldrich(Saint Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, EttanDalt system은 Hoefer(San Francisco, CA, USA)에서, isoelectric focusing(IEF), Multiphor Ⅱ, Immobiline DryStrip Kit, Immobiline DryStrips(24 cm, pH 3-10 NL；nonlinear), IPG buffer 3-10 NL, DryStrip cover fluid는 Amersham Biosciences(Piscataway, NJ, USA)에서 구입하였다. 

세포배양 및 처치
   사람 폐의 점액상피양 암종(lung mucoepidermoid carcinoma) 세포주(NCI-H292)를 American Type Culture Collection(CRL-1848；Manassas, VA, USA)에서 구입하여 10% fetal bovine serum(FBS)과 페니실린을 첨가한 RPMI-1640(GIBCO BRL, Rockville, MD, USA) 배양액으로 37℃의 배양기 안에서 배양했다. 합류 2일 후, 세포를 10 ng/ml의 IL-1β에 0, 6, 24시간 동안 처치한 후 배양액을 제거했다. 세포 표면을 멸균된 phosphate-buffered saline(PBS)로 두 번 세척하고 시료를 채취했다.

Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2-D PAGE)

시료 준비
   채취된 시료는 즉시 액화질소에 얼린 후 -80℃ 냉장고에 보관했다. 시료를 400 μl의 lysis buffer(7 M urea, 2 M thiourea, 2% CHAPS, 2% Pharmalyte pH 3-10, 100 mM DTE)에 의해 분해하고, 고형성분을 제거하기 위하여 4℃에서 한 시간 동안 12,000×g로 원심분리했다. 부유물을 새로운 튜브로 옮기고 Bradford 방법으로 단백질의 농도를 측정한 후, 1 mg씩 나누어 -80℃에서 보관했다.

2-D PAGE
   단백질은 lysis buffer에 녹여 최종적으로 450 μl으로 맞췄다. 시료는 240 mm, immobilized pH gradient(IPG) strips(pH 3-10, nonlinear, IPG Drystrips, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)에 넣고 rehydration 과정을 10시간 가량 시행했다. Rehydration 후 isoelectric focusing(IEF, Multiphore, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)을 100 V에서 한 시간, 300 V에서 한 시간, 600 V에서 한 시간, 1,000 V에서 한 시간, 2,000 V에서 한 시간, 3500 V에서 22시간 동안 시행하여 총 75000 VHr가 되도록 하였다. IEF가 끝난 후strip을 6 M urea, 20% glycerol, 2% SDS, 0.01% bromophenol blue(BPB), 10 mM tributyl phosphine(TBP)이 함유된 용액에서 equilibration을 시행하였다. SDS-PAGE는 10~18% T, gradient 젤과 EttanDalt system을 이용하여 시행하였다. PAGE는 20℃에서 2 W/gel로 밤새 진행한 후 젤은 Coomassie G-250(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 염색하였다.

Protein visualization and software analysis
   염색된 젤을 GS-800 Calibrated Densimeter(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 영상을 얻고, Mellanie Ⅲ(SIB, Sweden)를 이용, 분석하여 변화된 발현을 보이는 단백을 찾아냈다(3배 이상 발현 증가된 단백과 0.33배 이하 발현 감소된 단백).

질량 분석을 위한 시료의 준비
   젤 조각들은 물로 한 시간, 40% methanol, 100% acetonitrile(ACN), 50 mM ammonium bicarbonate(ABC, pH 8.0)로 1~3회, 약 10분간씩 세척하고 vacuum evaporator로 약 15분간 탈수하였다. 젤 조각들에 0.1~0.2 μg Promega modified trypsin을 함유한 트립신 용액을 첨가하고 ABC buffer를 첨가한 후 이전 젤 크기로 돌아올 때까지 기다렸다. 젤은 37℃에서 밤새 두었다가 MALDI-TOF 질량분석 전에 POROS R2 column(Applied Biosystems, Foster city, CA, USA)을 이용하여 펩타이드의 농도를 증가시켰다. Column을 5% formic acid와 100% ACN으로 세척한 후 시료를 R2 column에 적용했다. 시료는 2 μl의 α-cyano-4-hydroxycinnamic acid(CHCA)와 함께 elution하여 MALDI plate(96×2, Applied Biosystems, Foster city, CA, USA)에 떨어뜨렸다.

Mass spectrometry
   MALDI-TOF 질량분석은 Applied Biosystems사의 Voyager DE-PRO spectrometer(Applied Biosystems, Forster city, USA)를 사용하였다. 스펙트럼은 트립신 자가분해(trypsin autolysis)를 이용하여 내교정(internal calibration)하였다(842.51 Da, 2211.11 Da). 펩타이드 질량분석은 SWISS-PROT(http://kr.expasy.org/)과 National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm. nih.gov)의 데이터베이스를 사용하여 시행하였다. 개별적인 2회의 실험을 통하여 실험의 재현성을 확인하였다.

cDNA microarray

Labeled cDNA의 합성과 hybridization
   Labeled cDNA은 50 μg의 총 RNA를 사용하였다. 총 RNA는 대조군과 IL-1β를 처치한 NCI-H292 세포에서 Trizol용액(MRC, Cincinnati, OH, USA)을 사용하여 추출하였다. 총 RNA에 2 μl의 oligo dT(18 mer) primer(1 μg/μl)를 첨가하고, 이 혼합물을 70℃에서 10분간 변성(denature)시킨 후 얼음 위에 2분간 놓아두었다. 다음의 시약을 첨가하여 역전사(reverse transcription)를 시행하였다：6 μl First Strand Buffer 5×(250 mM Tris-HCl pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl₂)(Invitrogen life technologies, Carlsbad, CA, USA), 3 μl DTT 0.1 M(Invitrogen life technologies), 100 μM dATP(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA), 100 μM dGTP(Amersham Biosciences), 100 μM dTTP(Amersham Biosciences), 100 μM dCTP(Amersham Biosciences), 3 mM Cyanine 3-dCTP(NEN Life Science Products, Boston, MA, USA)(대조군) 또는 3 mM Cyanine 5-dCTP(NEN Life Science Products)(실험군). 반응혼합물을 부드럽게 섞어주고 400 units의 SuperScript Ⅱ^TM RNase H-Reverse Transcriptase(Invitrogen life technologies)를 첨가하였다. 역전사 반응은 42℃에서 두 시간 동안 시행하였다. 반응을 5 μl의 stop solution(0.5 M NaOH, 50 mM EDTA)으로 정지시키고 65℃에서 10분간 열불활성화(heat inactivation)시켰다. Labeled cDNA probe는 알코올침전(alcohol precipitation)을 사용하여 준비하였다.
   Hybridization은 cDNA chip(8.6 K genes, GenoCheck, Ansan, Korea)을 이용하였으며 증류수로 습도를 유지한 통 안의 custom slide cassette에서 62℃로 밤새 시행하였다. Array는 2분 동안 washing buffer 1(2×SSC, 0.1% SDS)로, 3분 동안 washing buffer 2(1×SSC)로, 2분 동안 washing buffer 3(0.2×SSC)으로 세척하였다. Cy3와 Cy5의 signal이 1.5배 이상 차이가 나는 gene spot들을 IL-1β에 의해 차별적으로 발현되는 유전자로 규정하였다. 개별적인 2회의 실험을 통하여 실험의 재현성을 확인하였다.

결     과

2-D PAGE
   1300개의 잘 분해된 spots이 pH 3.0~10.0의 젤에서 발현되었다(Fig. 1). IL-1β에 의해 발현이 증가된 단백이 4개, 발현이 감소한 단백이 4개 존재하였다. 합성 후 변이(post-translational modification)가 있었던 단백은 14개였다. 전체적으로 발현된 spots의 1.7%에 해당하는 단백이 IL-1β에 의해 조절되었다.

발현이 증가된 단백
   발현이 증가된 단백으로는 enolase, the heat shock protein 90 beta, tubulin alpha 2, and 2-phosphopyruvate-hydratase alpha-enolase(Table 1, Fig. 2)가 있었다.

발현이 감소된 단백
   발현이 감소된 단백으로는 glutathione S-transferase, thioredoxin peroxidase 1, malate dehydrogenase와 unnamed product(Table 2, Fig. 3)가 있었다.

합성후 변이된 단백
   합성 후 변이로는 분자량의 증가 및 감소와 주위 고정된 spot과 비교하여 pI가 변화한 단백 등이 있다.

분자량이 증가한 단백
   분자량이 증가한 단백으로는 inorganic pyrophosphatase와 erythrocyte cytosolic protein이 있었다(Table 3, Fig. 4).

분자량이 감소한 단백
   분자량이 감소한 단백으로는 heterogenous nuclear ribonucleoproteins C1/C2, eukaryotic translation initiation factor 3 subunit 2, cytokeratin 1, calponin 3, heat shock protein(HSP) 27, platelet-activating factor acetylhydrolase IB beta subunit, GTP-binding nuclear protein RAN, proliferation-associated protein 2G4와 cytoplasmic antiproteinase 3가 있었다(Table 4, Fig. 5).

pI가 변화한 단백
   pI가 변화한 단백은 cytokeratin 8, annexin A8와 P43이다(Table 5, Fig. 6).

cDNA microarray
   IL-1β로 6시간 동안 처치한 시료에서 전체 cDNA chip 위에 존재하는 8672 유전자 중 6230 유전자가 검출되었고(71.8%)(Fig. 7A) 413 유전자가(6.6%) 증가하거나 감소하였다. 24시간 처치군에서는 5729 유전자가 검출되었고(66.1%)(Fig. 7B) 115 유전자가(2.0%) 증가 또는 감소하였다.
   IL-1β로 6시간 처치한 군에서 검출된 총 6230개의 유전자 중 152개의 유전자가 증가하였고(data not shown) 261개의 유전자가 감소하였다(data not shown). 24시간 처치군에서 검출된 5729개의 유전자 중 80개의 유전자가 증가하였고(data not shown) 35개의 유전자가 감소하였다(data not shown). 각각의 유전자는 대사 또는 조절 경로(metabolic or regulatory pathway)로 크게 분류되며 다시 작은 경로로 세분하였다(Table 6, 7, 8, 9). 발현의 증가 및 감소가 있었던 유전자는 주로 대사경로에 속하는 유전자였다.

2-D PAGE와 cDNA microarray 결과의 비교
   2-D PAGE에서 발현의 변화가 있었던 22개의 단백을 cDNA microarray 데이터에서 찾아 비교 분석하여 보았다. 그 중 11개의 단백에 해당하는 유전자는 cDNA microarray 데이터에 포함되어 있지 않았고 나머지 11개의 단백의 발현만을 비교할 수 있었다. cDNA microarray 결과와 프로테옴 분석의 결과를 비교한 결과 mRNA의 발현과 단백의 발현과는 큰 차이를 보이는 것을 확인할 수 있었다. 즉 cDNA microarray와 프로테옴 결과 상 일치하는 결과는 전혀 존재하지 않았다(Table 10). 이러한 결과는 발현이 변화된 단백의 조절은 전사조절(transcriptional regulation)로 인한 것이 아니라 전사후 조절(post-transcriptional regulation)에 의한 것임을 알 수 있다.

기도분비물에 관련된 유전자의 cDNA microarray 결과
   기도분비물 중 점액성(mucinous) 및 장액성(serous) 성분을 이루는 단백을 합성하는 유전자를 cDNA microarray 데이터에서 찾아 보았다. 점액유전자 중 MUC2는 검출되지 않았으며, MUC4, MUC5B, MUC9는 IL-1β의 처치에 의해 발현이 감소하였고, sialomucin만이 발현이 증가하였다(Table 11). 장액성분 중, lysozyme과 secretory leukocyte protease inhibitor(SLPI)는 IL-1β 24시간 처치에 의해 발현이 증가하였다(Table 11). 하지만 기도의 중요 점액으로 알려진 MUC5AC는 이 microarray 유전자 리스트에 포함되어 있지 않았다.

고     찰

   점액의 과분비는 비루, 가래와 호흡부전으로 인한 사망 등 여러 문제를 야기한다. 점액의 주성분으로 알려진 점소(mucin)에서 MUC5AC와 MUC5B는 인체 기도 점소 중 중요 점소(major mucin)로 알려져 있다.⁸⁾⁹⁾ 기도에서 염증성 매개물에 의해 분비되는 점소의 조절기전은 매우 중요하며 이를 이해함으로써 점액의 과분비를 억제할 수 있는 새로운 치료방법을 얻을 수 있을 것으로 사료된다. 최근 사람 기도상피세포에서 IL-1β와 TNF-α에 의해 유도되는 MUC5AC의 과발현이 ERK/p38 MAP kinases-MSK1-CREB 신호전달체계의 순차적인 활성화에 의한 것임이 밝혀졌다.¹⁰⁾ 하지만 MAP kinase, MSK1, CREB 이외에도 IL-1β에 의해 유도되는 점액의 과분비에 관련된 단백이나 유전자가 많이 존재할 것으로 예상된다. IL-1β에 의해 유도되는 점액의 과분비를 조절하는 후보물질에 대한 high-throughput 검색은 아직 발표된 바 없다. 따라서 저자들은 IL-1β에 의해 차별적으로 발현되는 점액의 과분비와 연관된 유전자 및 단백을 분석하기 위해 이번 연구를 진행하였다.
   2-D PAGE proteomic 분석에서, 발현된 1300개의 단백 중 22개의 단백(1.7%)만이 IL-1β에 의해 조절되었다. 정상 사람 코점막 상피세포[normal human nasal epithelial(NHNE) cells]를 가지고 한 같은 실험에서는 IL-1β에 의해 조절되는 단백의 수가 더 적었다(data not shown). 이것은 2-D PAGE의 제한점으로 설명할 수 있다. 즉 단백의 분자량이 120 kDa이 넘는 고분자량의 단백이거나 10 kDa 이하의 저분자량의 단백이거나, 발현의 양이 극히 적은 단백이거나(low copy proteins), pI가 9를 넘는 염기성 단백이거나, 세포막 단백과 같이 소수성(hydrophobic) 단백인 경우 2-D PAGE 젤에는 잘 나타나지 않는 단점이 있다. 게다가 시료를 채취하기 전에 나타난 조기의 일과성 변화(earlier and transient change)는 반영되지 않았을 확률이있다. 마지막으로 시료채취 전에 세포면의 세척을 통해 세포면에 존재하는 분비단백을 제거한 것도 한 원인이 될 수 있다. 즉 de novo synthesis나 탈과립/세포외이동(degranulation/exocytosis)의 효과를 배제하는 효과를 나타낼 수 있다는 것이다.
   2-D PAGE 결과에서 발현 증가된 단백 중에서 heat shock protein(HSP)이 점액분비와 관련되었다고 알려진 유일한 단백이었다. 비록 HSP이 점액분비에 미치는 영향이 모두 알려진 것은 아니지만, 미생물에 존재하는 HSP은 항염증 기능을 보이며, T 세포에 의해 매개되는 배세포(goblet cell)의 증식 및 점액 과분비를 억제하는 것으로 알려져 있다.¹¹⁾ 또한 HSP은 세포보호(cytoprotection)에 관련된 중요 효소를 보호함으로써 점막의 치유 및 점막보호기전에 일조하는 것으로 알려져 있다.¹²⁾ 발현이 증가된 HSP 90은 IL-1β에 의한 점막의 보호 뿐만 아니라, 점액의 과분비를 억제하기 위한 보상기전에 의할 것으로 사료된다. 하지만 HSP의 점액과분비에 대한 직접적인 효과에 대해서는 알려진 바 없다.
   Microarray 데이터의 유전자는 그 유전자의 기능에 따라 두 가지 경로로 분류하는데 대사경로와 조절경로가 그것이다. 대사경로에 관련된 유전자는 세포의 새로운 표현형(phenotype)에 관여하며, 조절경로에 관여하는 유전자는 세포의 적응반응(adaptive response)에 관여한다. cDNA microarray 결과에서 IL-1β에 의해 차별적으로 발현되는 유전자는 조절경로에 관여하는 유전자(6시간 처치군- 27.0%, 24시간 처치군- 36.2%)보다는 대부분 대사경로에 관여하는 유전자(6시간 처치군- 73.0%, 24시간 처치군- 63.8%)였다. 이전의 연구들에 의하면, IL-1β는 기도상피에서 표현형의 변화를 유도하지는 않았다.⁶⁾¹³⁾ 이것은 비록 그 수는 적지만 조절경로에 관여하는 유전자가 과분비에 미치는 영향이 클 것으로 유추할 수 있다.
   cDNA microarray 결과와 2-D PAGE 분석결과의 비교해 보면 mRNA와 단백의 발현간에는 상당한 차이가 존재함을 알 수 있다(Table 10). 이러한 결과는 이전의 연구결과와 일치한다.^14)15)16)17) 유전자 발현의 변화 없이 단백의 발현의 변화가 존재하는데 이것은 발현의 조절이 전사물질의활성화(transcriptional activity)에 의한 것이 아니라 전사후 조절(post-transcriptional regulation)에 의해 일어난다는 것을 암시한다. 또한 두 실험 결과의 불일치는 실험방법의 차이 및 시료준비의 차이, 상이한 탐지 민감도(detection sensitivity), 단백합성의 조절(단백합성의 활성조절), mRNA의 alternative splicing, 단백합성 후 변이(post-translational modification), 선택적인 단백의 파괴 또는 세포외 분비와 유전자 및 단백의 발현 사이에 존재하는 시간적 차이 등으로 설명할 수 있다. 유전자 양의 변화 없이 해당 단백 양의 변화는 전사후 조절 또는 유전자가 단백의 조절 이전에 유도된 후 정상으로 돌아온 이후에 시료를 채취한 경우로 설명할 수 있다. 이러한 결과는 mRNA 전사양 만으로는 단백의 발현을 예상할 수 없음을 보여주는 것이다.
   이번 연구에서 저자들은 microarray 데이터 중에서 기도 점액을 형성하는 중요 분비 단백을 따로 분석하여 보았다(Table 11). 놀랍게도 중요 점소인 MUC5B는 IL-1β 6 시간 및 24시간 처치군에서 모두 발현이 감소하였다. 이 결과는 IL-1β는 MUC5B mRNA의 발현을 유도하지 않는다는 저자들의 이전 결과와 일치한다.¹³⁾ 또한 MUC5B가 IL-1β에 의해 유도되는 중요 점소가 아니라는 것을 암시하는 것이다. 세포막의 당단백의 하나인 sialomucin CD 164는 IL-1β 6시간 및 24시간 처치군에서 모두 발현의 증가를 보였다. IL-1β에 의해 유도된 sialomucin은 기도 분비물은 산성화시키고 점도를 높여 점막의 손상, 기도 폐쇄, 점액 플러그(plug)에 의한 이차염증을 야기한다.¹⁸⁾ 이러한 결과로 IL-1β에 의해 증가된 sialomucin이 점액의 과분비와 기도염증에 중요한 역할을 한다는 것을 추정할 수 있다. 기도의 장액성 분비물인 secretory leukocyte protease inhibitor(SLPI)와 라이소자임(lysozyme)도 IL-1β에 의해 발현이 증가하였다. 이 결과는 IL-1β가 점액성 분비물뿐만 아니라 장액성 분비물도 증가시킴을 말해주는 것이다.
   생물계의 기술(description of a biological system)은 mRNA의 분석뿐만 아니라 단백의 발현과 더 나아가 그 단백의 기능을 모두 함유해야 하다. 하지만 cDNA microarray와 2-D PAGE를 이용한 이번 연구를 통해서도 세포가 어떻게 조절되는 지에 대한 정보를 완벽하게 제공하지는 못했다. HSP와 sialomucin은 점액 과분비에 밀접하게 연관될 가능성을 보여주었으나, mRNA 발현과 단백의 발현과는 연관성을 발견하기 어려운 제한점을 보여주었다. 

1. Yuta A, Ali M, Sabol M, Gaumond E, Baraniuk JN. Mucoglycoprotein hypersecretion in allergic rhinitis and cystic fibrosis. Am J Physiol 1997;273:L1203-7.

2. Kim SS, Kim KS, Lee JG, Park IY, Koo JS, Yoon JH. Levels of intracellular protein and messenger RNA of mucin and lysozyme in normal human nasal and polyp epithelium. Laryngoscope 2000;110:276-80.

3. Chung MH, Choi JY, Lee WS, Kim HN, Yoon JH. Compositional difference in middle ear effusion: Mucous versus serous. Laryngoscope 2002;112:152-5.

4. Nadel JA. Role of epidermal growth factor receptor activation in regulating mucin synthesis. Respir Res 2001;2:85-9.

5. Dinarello CA. Biologic basis for interleukin-1 in disease. Blood 1996; 87:2095-147.

6. Koo JS, Kim YD, Jetten AM, Belloni P, Nettesheim P. Overexpression of mucin genes induced by interleukin-1 beta, tumor necrosis factor-alpha, lipopolysaccharide, and neutrophil elastase is inhibited by a retinoic acid receptor alpha antagonist. Exp Lung Res 2002;28:315-32.

7. Kim YD, Kwon EJ, Kwon TK, Baek SH, Song SY, Suh JS. Regulation of IL-1beta-mediated MUC2 gene in NCI-H292 human airway epithelial cells. Biochem Biophys Res Commun 2000;274:112-6.

8. Hovenberg HW, Davies JR, Herrmann A, Linden CJ, Carlstedt I. MUC5AC, but not MUC2, is a prominent mucin in respiratory secretions. Glycoconj J 1996;13:839-47.

9. Thornton DJ, Howard M, Khan N, Sheehan JK. Identification of two glycoforms of the MUC5B mucin in human respiratory mucus. Evidence for a cysteine-rich sequence repeated within the molecule. J Biol Chem 1997;272:9561-6.

10. Song KS, Lee WJ, Chung KC, Koo JS, Yang EJ, Choi JY, et al. Interleukin-1 beta and tumor necrosis factor-alpha induce MUC5AC overexpression through a mechanism involving ERK/p38 mitogenactivated protein kinases-MSK1-CREB activation in human airway epithelial cells. J Biol Chem 2003;278:23243-50.

11. Schoolnik GK. Microarray analysis of bacterial pathogenicity. Adv Microb Physiol 2002;46:1-45.

12. Tsukimi Y, Okabe S. Recent advances in gastrointestinal pathophysiology: Role of heat shock proteins in mucosal defense and ulcer healing. Biol Pharm Bull 2001;24:1-9.

13. Yoon JH, Kim KS, Kim HU, Linton JA, Lee JG. Effects of TNF-alpha and IL-1 beta on mucin, lysozyme, IL-6 and IL-8 in passage-2 normal human nasal epithelial cells. Acta Otolaryngol 1999;119: 905-10.

14. Rha YH, Taube C, Haczku A, Joetham A, Takeda K, Duez C, et al. Effect of microbial heat shock proteins on airway inflammation and hyperresponsiveness. J Immunol 2002;169:5300-7.

15. Gygi SP, Rochon Y, Franza BR, Aebersold R. Correlation between protein and mRNA abundance in yeast. Mol Cell Biol 1999;19:1720-30.

16. Fessler MB, Malcolm KC, Duncan MW, Worthen GS. A genomic and proteomic analysis of activation of the human neutrophil by lipopolysaccharide and its mediation by p38 mitogen-activated protein kinase. J Biol Chem 2002;277:31291-302.

17. Chen G, Gharib TG, Huang CC, Thomas DG, Shedden KA, Taylor JM, et al. Proteomic analysis of lung adenocarcinoma: Identification of a highly expressed set of proteins in tumors. Clin Cancer Res 2002;8: 2298-305.

18. Lasky LA. Sialomucins in inflammation and hematopoiesis. Adv Exp Med Biol 1995;376:259.