교신저자：박종성, 501-190 광주광역시 동구 학1동 8번지  전남대학교 의과대학 생리학교실
              전화：(062) 220-4264 · 전송：(062) 232-1242 · E-mail：parkjs@chonnam.ac.kr

서     론

   코티기관(organ of Corti)내의 내유모세포는 외부의 소리자극을 전기적인 신호로 바꾸어 구심성 섬유를 통해 대뇌피질의 청각영역으로 전달하고 있으며, 외유모세포는 내유모세포의 소리전달의 조절자로서 기능하고 있다. 뇌간의 상올리브핵(superior olivary nucleus)에서 기시하여 내측 올리브와우각속(medial olivocochlear bundle)을 통하여 외유모세포로 투사되는 원심성 섬유는 아세틸콜린을 신경전달물질로 사용하고 있으며, 이 아세틸콜린이 외유모세포의 기저부에 작용하여 세포의 막전압을 변화시켜 외유모세포의 수축성을 조절하는 것으로 알려져 있다.¹⁾²⁾³⁾ 유모세포의 아세틸콜린 수용체는 니코틴성(nicotinic) 또는 무스카린성(muscarinic) 수용체가 아닌 두 수용체의 특징중 약간씩을 모두 가지는 비정상적인 약리현상을 보인다.²⁾ 또한, 알파 9 니코틴성 아세틸콜린 수용체가 내측 올리브와우각속과 코티기관의 외유모세포 간의 원심성 전달을 매개하고 있음이 많은 연구에서 밝혀졌으며,⁴⁾⁵⁾⁶⁾ 이 수용체는 난모세포(oocyte)가 기능적인 아세틸콜린 수용체를 보일 때의 약리학적인 성격과 비슷한 양상을 보인다. 이러한 원심성 결합은 청취영역의 조절과 차폐의 경감 및 강한 음 자극으로부터 와우를 보호하는 역할을 한다.⁷⁾ 따라서, 원심성 섬유에 의한 외유모세포의 조절기전을 파악하기 위해서는 원심성 신경전달 물질인 아세틸콜린이 외유모세포에 미치는 영향에 대해서 연구하는 것이 필요하다. 
이에 본 연구에서는 전압고정법하의 whole-cell configuration patch clamp technique을 이용하여 기니픽에서 분리된 외유모세포의 전압의존성 칼륨 전류에 미치는 아세틸콜린의 효과와 이 전압의존성 칼륨 전류에 칼슘의 영향을 관찰하고, 아세틸콜린이 외유모세포의 길이변화에 미치는 효과를 관찰함으로써 원심성 신경전달물질인 아세틸콜린이 외유모세포에 대하여 미치는 효과를 규명하고자 하였다. 

재료 및 방법

외유모세포의 분리
   백색 기니픽(200~250 g)의 복강에 50 mg/kg의 sodium pentobarbital을 주사하여 마취시킨 후 양측의 측두골을 얻었다. 차가운 Hank's balanced salt solution (HBSS：1.25 mM CaCl₂, 5.55 mM glucose, 0.81 mM MgSO₄, 0.44 mM KH₂PO₄, 136.9 mM NaCl, 0.34 mM Na₂HPO₄, 5.4 mM KCl, 5.0 mM HEPES, 300 mOsm, pH 7.4) 내에서 와우골포(bulla)를 제거하고 와우를 노출시킨 후 조심스럽게 골벽(bony cochlear wall)을 제거하였다. 코티기관을 꺼내어 collagenase (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, USA)로 10분간 처리한 후 다시 코티기관을 효소가 없는 HBSS에 넣고 피펫을 이용하여 부드럽게 분리(trituration)하였다. 물리적인 분리가 끝나면 역상도립현미경(inverted microscope) 위의 용기에 옮기고 세포가 바닥에 가라앉도록 기다렸다. 분리된 세포 중 실린더 모양이고, 핵이 세포의 기저부에 위치하며, 세포의 첨부표면에 유모가 있는 것을 관찰하여 외유모세포임을 확인하였다. 

용액의 조성 및 시약
   칼륨 전류(IK)를 기록하기 위한 세포외 용액(단위；mM)은 3 KCl, 140 Choline-Cl, 2 CaCl₂, 10 HEPES(N-[2-hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid], 30 Glucose, pH 7.4로 하였고, 세포내 용액(단위；mM)은 140 KCl, 2 MgCl₂, 0.1 CaCl₂, 10 HEPES, 0.5 EGTA(ethylene glycol-bis(β-aminoethylether)-N, N, N', N'-tetraacetic acid), 2 Mg-ATP이며 pH는 7.3으로 하였다. 
   세포에 대한 약물 투여는 중력을 이용한 관류장치를 이용하여 용기내 용액을 순환시켰다. 본 실험에서 사용한 아세틸콜린, EGTA, HEPES 등은 미국 Sigma사 제품을 사용하였다.

이온 전류의 기록
   분리된 외유모세포에서 Hamill 등⁸⁾의 whole-cell patch clamp 방법을 이용하여 칼륨 전류를 기록하였다. 기록용 전극은 미세 유리 전극 제조기(Narishige, 일본)와 microforge(Narishige, 일본)를 이용하여 저항이 3~5 ㏁이 되도록 제작하였다. 막전압 고정과 전류의 측정은 Axopatch 200B patch clamp amplifier(Axon, 미국)를 이용하여 Digidata 1200B(Axon, 미국) interface를 통하여 컴퓨터와 연결하였다. 막전압 조절과 실험결과 얻어진 칼륨 전류의 기록 및 자료 분석은 pClamp 7.0 software(Axon, 미국)를 사용하였으며, oscilloscope를 사용하여 전류의 변화를 동시에 관찰하였다. 전류는 10 KHz로 여과하며, series resistance는 Axopatch 2200B patch clamp amplifier의 series resistance compensation circuit를 이용하여 보상하였으며 누출전류(leak current) 감산은 시행하지 않고 pClamp 7.0 software를 이용하여 교정하였다.

실험결과 분석
   기록된 자료는 pClamp 7.0 및 Microcal Origin 4.1(Microcal software Inc. 미국) 프로그램으로 분석하였다. 실험측정치는 paired t-test와 Wilcoxon signed rank test로 통계학적 분석을 시행하고 p<0.05를 유의성의 기준으로 삼았으며 평균±표준오차(standard error)로 표시하였다.

결     과

외유모세포의 칼륨 전류 
   기니픽 내이에서 분리된 외유모세포의 길이는 40.5~68.5 μm, 직경 8.1~11.5 μm였으며, 세포체는 실린더 모양이었고 핵이 세포의 기저부에 위치하였고 세포의 첨부표면에 유모가 있었다(Fig. 1). 본 연구에서는 외유모세포 중에서도 세포막이 매끄러우며 미세전극으로 접근하여 기록하기가 용이한 세포들을 대상으로 실험을 시행하였다.
   외유모세포의 membrane capacitance는 평균 -60.7±1.9 pF(n=50) 정도로 비교적 큰 편이었다. 외유모세포에서 유지전압(holding potential)을 -70 mV로 하고 10 mV 간격으로 -90 mV에서 +50 mV까지 단계적으로 탈분극 자극을 매 10초마다 400 msec 동안 가하였을 때, 전압의존성 전류가 관찰되었으며 +50 mV의 탈분극 전압에 대하여 2601±180 pA의 전류를 나타내었다. 전압-전류 곡선으로 그려보면 평형전압이 -79.1 mV에서 그려지는 전형적인 칼륨 전류임을 알 수 있었다(Fig. 2).

외유모세포의 전압의존성 칼륨 전류에 미치는 아세틸콜린의 영향
   외유모세포의 전압의존성 칼륨 전류에 미치는 내측 올리브와우각속의 영향을 관찰하기 위하여 여기에서 유리되는 신경전달 물질인 아세틸콜린의 효과를 관찰하였다.
   유지전압을 -70 mV로 하고 20 mV 간격으로 -90 mV에서 +50 mV까지 전압 고정 자극을 주면서 칼륨 전류를 기록하였다. 100 μM 아세틸콜린을 투여 후 자극하였을 때, +50 mV의 탈분극 전압에 대하여 전류는 4807±150 pA에서 4084±196 pA로 증가하였다(p<0.05, n=20)(Fig. 3).

아세틸콜린에 의하여 영향을 받는 외유모세포의 전압의존성 칼륨 전류
   전압의존성 칼륨 전류는 크게 A형 칼륨 전류, 지연성 정류형 칼륨 전류, 그리고 칼슘에 의해 활성화되는 칼슘 의존성 칼륨 전류 등이 있다. 외유모세포에서 아세틸콜린의 영향을 받는 칼륨 전류를 분리하기 위하여 세포내 칼슘을 제거한 후 아세틸콜린의 효과를 관찰하였다.
   세포내 칼슘을 제거하여 칼슘 의존성 칼륨 전류를 억제하기 위하여, 세포외 용액에서 CaCl₂를 제거하고 CoCl₂로 치환하였으며 세포내 용액에서 calcium chelating agent인 EGTA의 농도를 10 mM로 높였다. 세포 내액에 칼슘을 제거한 후 칼륨 전류는 +50 mV의 탈분극 전압에 대하여 3213±109 pA로 칼슘 존재하의 전류치 보다 낮은 전류를 나타내었다. 칼슘 제거 후 100 μM 아세틸콜린 투여에 의하여 칼륨 전류는 3379±85 pA로 대조군에 비하여 차이가 없었다(n=10)(Fig. 4). 

아세틸콜린에 의한 외유모세포 길이 변화
   외유모세포의 길이는 40.0~68.3 μm(평균 54.79±10.0 μm)였으며, 아세틸콜린 100 μm 투여 5분후에 평균 10.5% (3.4~20.4 μm)만큼 외유모세포의 길이가 증가하였다(p<0.05, n=10)(Fig. 5). 

고     찰

   외유모세포는 실린더 또는 시험관 모양의 세포로 인간에서는 약 13,400개 정도가 존재한다. 크기는 와우의 첨부로 갈수록 증가하고, 외측으로 갈수록 증가하는 경향이 있으며, 핵이 세포의 기저부에 위치하며, 수많은 미토콘드리아와 세포소기관들이 존재한다.⁹⁾
   외유모세포는 소리 전달과정에서 수축과 이완함으로써 세포의 길이가 변하고 이를 통하여 와우의 미세역학(micromechanics)을 조정하는 것으로 알려져 있다.¹⁾²⁾ 이 외유모세포의 세포막 흥분성에 가장 크게 영향을 미치는 것이 뇌간의 상올리브핵에서 기시하여 내측 올리브와우각속을 통하여 외유모세포와 연결된 원심성 경로이다. 원심성 섬유에서 유리된 아세틸콜린은 외유모세포의 기저부에 있는 알파-9 니코틴성 수용체에 작용하여 칼슘 이온의 유입을 촉진한다.⁴⁾ 그 결과 칼슘 의존성 칼륨 채널이 열리고 세포는 과분극된다.
   본 연구에서는 막전압고정법을 이용하여 기니픽 외유모세포에서 칼륨 전류를 기록하고 이 칼륨 전류에 대한 아세틸콜린의 영향이 칼슘 의존성임을 관찰하였다. 아세틸콜린에 의하여 외유모세포의 칼륨 전류는 증가하였으나, 세포 내액에 칼슘이 없는 상태에서 아세틸콜린에 의한 칼륨 전류의 변화는 관찰되지 않았다. 따라서 아세틸콜린에 의하여 영향을 받는 칼륨 전류는 칼슘 의존성임을 확인할 수 있었다. 
   최근, Blanchet 등¹⁰⁾은 막전압고정법을 이용한 실험을 통하여 gentamicin이 기니픽 외유모세포의 콜린성 수용체에서 칼슘 이온 유입을 방해함으로써 아세틸콜린에 의해 유발된 칼륨 전류를 차단한다고 보고하였으며, 높은 농도의 칼슘 이온을 투여했을 때 gentamicin의 아세틸콜린 유발성 칼륨 전류 차단을 저해하였다고 보고한 바 있다. 이는 아세틸콜린이 작용하는 칼륨 채널이 세포내 칼슘이 일정 농도로 유지될 때 활성화 되는 칼슘 의존성 칼륨 채널임을 확인한 본 실험 결과와 일치하는 점이라 하겠다. 
   외유모세포의 길이가 전기 자극이나 약물에 의하여 늘어나거나 줄어드는 것은 세포막 근처에 종으로 배열된 prestin이라는 수축성 단백질 때문이다.¹¹⁾ Brownell 등¹⁾은 200 msec의 탈분극 자극에 의해 외유모세포의 길이가 짧아지고 직경은 증가하며, 반대로 과분극 자극에 의해 길이가 증가하고 직경이 감소한다고 보고하였으며, 아세틸콜린 투여에 의한 세포 길이 변화는 전기자극에 비하여 장시간에 걸쳐 일어난다고 하였다. 그리고 Sziklai 등³⁾은 과분극과 탈분극 자극을 순차적으로 주면서 아세틸콜린을 처치하면 투여 1분 이내에 외유모세포 길이의 신장과 수축, 양방향으로 변화하는 수축성이 증가하였고 20분 후에는 아세틸콜린 투여 전 상황으로 환원되었다고 발표하였다. 본 연구에서는 순차적으로 전기 자극을 하지 않고, 아세틸콜린을 투여하면서 길이의 변화를 관찰하였는데, 아세틸콜린에 의하여 외유모세포의 길이는 증가하였다.
   또한, 외유모세포에 대한 아세틸콜린의 효과로 electromotility와 axial stiffness에 대한 영향을 들수 있는데, Dallos 등은 microchamber를 이용한 외유모세포 연구에서 아세틸콜린을 투여하였을 때, 외유모세포의 electromotility의 증가와 axial stiffness의 감소를 보고하였다.²⁾ 

결     론

   기니픽 외유모세포에서 내측 올리브와우각속에서 유리되는 아세틸콜린의 작용을 알아보기 위하여 막전압고정법하의 whole-cell configuration patch clamp 방법을 이용하여 다음의 결과를 얻었다.
   1) 아세틸콜린은 외유모세포의 전압의존성 칼륨 전류를 증가시켰다.
   2) 세포내액과 세포외액에서 칼슘을 제거하여 칼슘 의존성 칼륨 전류를 차단한 상태에서는 아세틸콜린은 외유모세포의 칼륨 전류에 영향을 미치지 않았다. 
   3) 아세틸콜린에 의하여 외유모세포의 길이가 증가하였다.
   이상의 실험 결과 외유모세포의 운동성을 조절하는 원심성 섬유인 내측 올리브와우각에서 유리된 아세틸콜린은 외유모세포의 칼슘 의존성 칼륨 전류를 증가시키며, 외유모세포의 길이 변화에 관여하여 청각신호의 증폭조절작용에 관여할 것으로 생각된다.

1. Brownell WE, Bader CR, Bertrand D, de Ribaupierre Y. Evoked mechanical responses of isolated cochlear outer hair cells. Science 1985;227:194-6.

2. Dallos P, He DZ, Lin X, Sziklai I, Mehta S, Evans BN. Acetylcholine, outer hair cell electromotility, and the cochlear amplifier. J Neurosci 1997;17:2212-26.

3. Sziklai I, Dallos P. Acetylcholine controls the gain of the voltage-tomovement converter in isolated outer hair cells. Acta Otolaryngol 1993;113:326-9.

4. Elgoyhen AB, Johnson DS, Boulter J, Vetter DE, Heinemann S. Alpha 9: An acetylcholine receptor with novel pharmacological properties expressed in rat cochlear hair cells. Cell 1994;79:705-15.

5. Glowatzki E, Wild K, Brandle U, Fakler G, Fakler B, Zenner HP, et al. Cell-specific expression of the alpha 9 n-ACh receptor subunit in auditory hair cells revealed by single-cell RT-PCR. Proc R Soc Lond B Biol Sci 1995;262:141-7. 

6. Park HJ, Niedzielski AS, Wenthold RJ. Expression of the nicotinic acetylcholine receptor subunit, alpha 9, in the guinea pig cochlea. Hear Res 1997;112:95-105.

7. Guinan JJ. Efferent physiology. In: Dallos P, Popper AN, Fay RR, editors. The Cochlea. New York: Spriger-Verlag;1996. p.435-502.

8. Hamill OP, Marty A, Neher E, Sakmann B, Sigworth FJ. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch 1981;391:85-100.

9. Santi PA, Mancini P. Cochlear anatomy and central auditory pathways. In: Cummings CW, Fredrickson JM, Harker LA, Krause CJ, Schuller DE, Richardson MA, editors. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 3rd ed. St. Louis: Mosby Year Book;1998. p.2803-30.

10. Blanchet C, Erostegui C, Sugasawa M, Dulon D. Gentamicin blocks ACh-evoked K⁺ current in guinea-pig outer hair cells by impairing Ca²⁺ entry at the cholinergic receptor. J Physiol 2000;525:641-54.

11. Zheng J, Shen W, He DZ, Long KB, Madison LD, Dallos P. Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells. Nature 2000;405: 149-55.