교신저자：손영익, 135-710 서울 강남구 일원동 50  성균관대학교 의과대학 삼성서울병원 이비인후과
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서     론

   정상세포가 암세포로 변하면 종양세포의 세포막 표면에 정상세포에는 없었던 물질인 종양특이항원이 출현하게 된다. 종양항원이 면역감시체계에 의하여 이물질로 인식되는 경우 체액성 및 세포성 면역반응의 활성화가 일어나 암세포의 증식억제 및 파괴가 일어나며 생체로부터 암세포가 제거되게 된다. 하지만 어떤 원인들에 의해 면역감시기능의 저하나 부전이 발생하는 경우 변형된 세포의 종양화를 저지할 수 없어 임상적인 암으로 진행하게 된다.¹⁾ 생체 내 정상적으로 존재하는 면역감시기구 중 종양세포를 인지하고 소멸시키는 것은 T 세포나 NK 세포와 같은 세포성 면역기능의 활성화가 주된 역할을 담당한다. 종양세포에 대하여 특이적으로 작용하는 T 세포의 효과적인 활성화를 위하여는 항원제공세포의 역할이 선행되어야만 하는데, 수지상세포(dendritic cells, DC)는 체내에서 알려진 가장 전문적이고도 강력한 항원제공세포이다.²⁾ 실제 두경부암 환자에서 종양 내로의 수지상세포의 침윤이 많을수록 환자의 생존율이 높거나 전신전이가 적은 등의 상관관계가 보고된 바 있어 두경부 편평세포암종 환자의 경우에도 항암과 관련하여 수지상세포의 기능이 중요함을 알 수 있다.³⁾
   두경부 편평세포암종 환자는 전신적인 또는 국소적인 면역기능이 저하되어 있으며, 암의 진행과 면역기능의 저하는 직접적인 상관관계가 있음이 밝혀져 있다.⁴⁾ 이는 두경부 편평세포암종의 대부분이 고령에서 발생하며, 음주나 흡연과 관계가 깊어 진행된 병기의 편평세포암종 환자에서 관찰되는 면역기능의 저하는 기타 암의 경우보다도 암의 진행 및 예후와 더욱 밀접한 관계가 있다고 사료된다. 두경부 편평세포암종에 관련한 면역치료의 시도나 연구가 아직은 부족한 실정이지만, 두경부암 환자에서 면역기능이 저하되어 있고 면역기능의 저하는 환자의 예후와 밀접한 관계가 있으나, 다양한 생물학적 접근을 통하여 저하된 두경부암 환자의 면역기능을 자극할 수 있고 항진된 면역감시기능을 통하여 항암효과를 거둘 수 있음 또한 꾸준히 보고되고 있어 면역치료의 가능성을 짐작할 수 있다.
   저자들은 편평세포암종 동물모델에서 수지상세포의 치료효과를 연구하여 수지상세포의 주입과 함께 interleukin-2를 전신 투여하는 경우 종양성장 억제의 효과가 있음을 확인한 바 있었다.⁵⁾ 하지만 종양의 소멸을 초래할 정도의 효과를 관찰할 수 없는 등, 진행된 편평세포암종에서의 수지상세포를 이용한 치료는 한계가 있을 것으로 판단되었다. 이에 본 연구에서는 편평세포암종에 대한 예방 백신으로서 수지상세포의 효과를 파악하여 보고자 하였다.

대상 및 방법

실험동물과 편평세포암종 세포주 
   실험에 사용된 SCCVII(H-2^k) 세포주는 C3H/HeJ mouse의 피부에서 자연 발생한 편평세포암종으로부터 얻어진 세포주로서,⁶⁾ 서울대학교병원 이비인후과에서 보유하고 있는 세포주를 분주 받아 본 실험에 사용하였다. 편평세포암종 세포는 RPMI 1640 배양액에 10% fetal bovine serum, 1% L-glutamine, 100 μg/ml penicillin과 streptomycin을 첨가한 뒤, 5% 이산화탄소가 유지되는 37℃ 배양기에서 배양하였다. 배양된 세포주는 trypsin/EDTA를 이용하여 flask 바닥에서 떼어낸 뒤, trypan blue dye 염색을 이용하여 생존해 있는 세포를 계수한 뒤 이후 실험에 사용하였으며 3개월마다 Mycoplasma의 감염 여부를 확인하였다. 
   실험에 사용된 동물은 Jackson Immuno-Research Labs(West Grove, PA, USA)에서 분양 받아 "대한바이오링크"(음성, 충북)에서 사육하고 있는 암컷, 생후 4~6주령의 C3H/ He mouse를 구입하였다. 구입한 동물은 최소 2주간에 걸친 검역과 안정기간을 거친 후 실험에 이용하였으며, 미국 NIH(National Institutes of Health) 및 ILAR(Institute of Laboratory Animal Resources)이 권장하는 지침을 준수하여 삼성생명과학연구소 소속의 실험동물연구센터에서 specific pathogen free 환경하에 사육하였다. 

수지상세포의 배양 및 확인
   골수 수지상세포의 배양을 위하여 C3H mouse의 장골과 단골을 적출하여, 뼈의 양측 마디 부분을 절단하고 RPMI 1640 용액과 27G, 10 ml 주사기를 이용하여 골수를 추출하였다. 이후 0.8% NH4Cl buffer를 이용하여 RBC를 제거한 뒤 불순물 및 추출물을 nylon mesh(size 50 μm, Sigma, USA)로 걸러내고 세척과정을 거친 뒤 6-well plate에 10⁶ cells/5 ml/well의 농도로 분주하고 1,000 U/ml의 recombinant murine GM-CSF와 IL-4를(Schering-Plough, USA) 첨가하였다. 배양 4일에 동량의 cytokine을 추가로 첨가하고 배양 6~7일에 수지상세포를 최종 분리하기 위하여 14.5%의(w/v) metrizamide를(Sigma, USA) 이용하여 gradient separation을 시행하고 중간 층에 분리된 세포를 수거하였다. 
   배양된 수지상세포의 확인 및 성숙도의 판단은 CD11c, I-A^k, CD86, CD40의 세포표면 표현 정도를 유세포분석을 통하여 비교하였다. 배양된 수지상세포 5×10⁵ 세포를 100 μl의 cold staining buffer에(0.5% bovine serum albumin and 0.05% sodium azide in PBS) 풀어내고 fluorescein isothiocyanate(FITC) 또는 phycoerythrin(PE)의 fluorescent로 conjugate된 antimouse CD11c, I-A^k, CD86, CD40 등의 monoclonal antibody(PharMingen, USA)와 4℃에서 30분간 반응시켰다. 이후 2% paraformaldehyde에 고정시키고 FACScan^TM(Becton Dickinson, USA)을 이용 분석하였다.

편평세포암종 세포의 세포고사 유도 및 수지상세포의 종양항원으로의 교육
   편평세포암종 세포주의 세포고사(apoptosis) 유도를 위하여 건강한 SCCVII 세포를 6-well plate에 1×10⁶ cells/ 5 ml/well씩 파종한 후 10 cm 거리를 두고(1.5 mW/cm²) 90분간 자외선-B(ultraviolet-B, UVB；Spectroline^® UV lamp, Spectronics, USA) 조사하였다. 이는 24시간 이후 mitochondrial membrane dye인 nonyl-acridine-orange 염색⁷⁾ 및 Hoechst 33258 염색⁸⁾을 통하여 95% 이상이 안정되게 apoptosis를 유발하는 조사량임이 확인된 바 있다. UVB 조사가 끝난 암세포를 수거하여 6일 째 배양이 진행 중인 수지상세포 culture plate의 각 well 당 10⁵개의 세포를 첨가하고 24~36시간 동안 함께 배양하였다. 이후에 metrizamide를 이용한 gradient separation으로 수지상세포만을 분리 수거하여 SCCVII 세포로 교육 전후의 수지상세포의 세포표현형을 유세포분석으로 확인하였다. 또한 수지상세포의 IL-12 분비능을 ELISA를 이용하여 측정하였다. 수지상세포로부터 IL-12의 분비를 촉진시키기 위하여 1,000 U/ml의 IFN-γ와 CD40 ligand gene이 이입된 J558 cell line을⁹⁾ 이용하였다.
   수지상세포에 의하여 세포고사가 유도된 종양세포가 탐식되는지 여부의 확인은 confocal 현미경 검사를 이용하였다. 배양 6일 째 수지상세포를 metrizamide를 이용 분리하여 수거한 뒤 세포막에 염색되는 녹색의 형광물질인 PKH-GL(Sigma, USA)로 처리하였으며, UVB 조사를 받은 SCCVII 세포는 0.2 μg/ml의 붉은 형광의 carbocyanine dye DiI(Molecular Probe, USA) 염색약으로 처리하였다. 수지상세포와 편평세포암종 세포를 2：1의 비율로 6-well plate에서 18시간 배양하였으며, cytospin 과정을 거쳐 microscope slide glass(Fisher Scientific, USA)에 2% paraformaldehyde로 고정하였다.

예방백신 모델의 동물실험
   자외선 조사를 받은 apoptotic SCCVII 세포의 종양항원으로 교육된 수지상세포(apoptotic tumor pulsed DC, A-DC)를 일주일 간격으로 3회에 걸쳐 한 마리당 10⁶개씩, 0.2 ml 생리식염수와 함께 일측의 서혜부에 피하 주사하였다. 대조 실험군으로는 첫째, 생리식염수 치료군(normal saline, NS), 둘째, 종양항원에 교육되지 않은 수지상세포만으로의 치료군(naive DC, N-DC), 셋째, apoptotic SCCVII만으로의 치료군(apoptotic tumor, AT) 등이었으며, 각 군마다 3~10마리씩 동일 실험을 3회 이상 반복하였다. 마지막 3회의 백신 주입 2주 후, 종양의 형성에 필요한 최소한 세포의 5배가 되는 양인 5×10⁵개의 건강한 SCCVII 세포를 반대편 피하에 주사하여 종양의 생성 및 성장을 관찰하였다. 종양의 크기는 실험군의 종류를 모르고 있는 제 3 의 연구자에 의하여 측정되었으며,“평균 종양면적±표준편차”로 표시하였다. 종양세포 주입 4주까지 종양의 성장을 관찰한 뒤 종양이 성립된 동물은 안락사 시켰으며, 관찰 과정에서 종양의 괴사가 발생되어 종양 크기의 측정에 문제가 되는 경우 이 후의 종양크기의 측정에서 제외하였다.

종양특이적 전신면역 성립의 확인
   종양 주입 21일째 각 실험군 동물의 비장세포를 추출하여 적혈구를 제거한 뒤 24-well plate의 각 well 당 10⁷개씩 분주하였다. 이후 apoptotic SCCVII 세포 또는 대조 자극을 위하여 악성흑색종 세포주인 B16F10 세포를 UVB 조사 과정을 거쳐 세포고사를 유발한 뒤 이를 비장세포의 0.1, 1, 10, 30 배로 분주한 뒤 4일 동안 37℃에서 반응시켰다. 배양 상층액에서 IFN-γ의 양을 상품화된 ELISA kit를(PharMingen, USA) 이용하여 비교하였고 구체적인 방법은 product inserts에 준하였다. 약술하면 50 μl의 상층액을 비특이적 결합을 차단시킨 ELISA plate에 넣고 두 시간 반응시킨 뒤 biotin-labeled anti-IFN-mAb를 넣어 30분 반응시키고 세척과정을 거친 후 HRP-conjugated streptavidin과 TMB substrate 용액을 이용하여 발색시켰다. 이후 450 nm에서 optical density를 측정한 후 기준 곡선에 대비한 IFN-γ 양을 정량하였다. 종양이 지나치게 성장하는 경우 체중감소나 전신쇠약 등 비특인적인 전신적인 면역기능의 저하 가능성이 있을 것으로 우려되어 종양 주입 21일째 가능한 비슷한 크기의 종양을 가진 동물을 각 실험군에서 선택하여 전신면역의 비교실험에 활용하였다.

통계처리
   실험군에서의 평균적인 종양의 크기 비교 및 비장세포로부터의 IFN-γ의 분비 비교를 위하여 Wilcoxon Rank Sum Test를 이용하였다. Windows용 SigmaStat(version 8.0) 프로그램(SPSS Science, USA)으로 유의수준 p=0.05를 기준으로 분석하였다.

결     과

수지상세포의 배양 및 확인
   저자들이 개발하여 보고한 바 있는 bulk-culture 방법으로¹⁰⁾ 골수로부터 수지상세포를 배양하여 배양 7일째 한 마리 당 30±5×10⁶개의 세포를 수획할 수 있었으며, 유세포분석에서 CD11c 및 I-A^k에 double fluorescence를 보이는 세포를 순수한 수지상세포로 계산하였을 경우 88.7±5.0%의 순도로 측정되었다. 이는 기존에 널리 사용되고 있는 전통적인 Inaba 법¹¹⁾으로 얻어진 수획량인 10±4×10⁶/ animal 및 45.0±8.2%의 순도를 비교할 때 평균 약 6배 정도의 순수한 수지상세포를 얻을 수 있음에 해당한다. 배양 6일 째 얻어진 수지상세포의 B7.2 costimulatory molecule(CD86) 및 MHC class Ⅱ molecule(I-A^k)의 발현은 CD11c 양성세포 중 각각 75~80% 및 85~90%로 측정되어 충분히 성숙된 수지상세포임을 알 수 있었다(Fig. 1). 반면 UVB 처리된 편평세포암종 세포와 함께 배양과정을 거치기 전후의 수지상세포는 CD80, CD86, CD40, I-A^k 등의 물질의 발현 정도에 의미 있는 차이는 없어서 추가적인 성숙이 이루어지지는 않음을 확인하였다.

편평세포암종 세포의 세포고사 유도
   SCCVII 세포를 약 10 cm의 거리를 두고(1.5 mW/cm²) 30분부터 15분 간격으로 90분까지 UVB로 조사한 뒤 24시간 후 이를 수거하여 apoptosis 정도를 Hoechst 33258 염색으로 확인하였다. 각각 26.7±4.9%, 41.0±6.1%, 63.7±4.1%, 67.0±4.7%, 92.0±6.1%로 확인되어 이후 실험에는 90분간 UVB에 노출시킨 편평세포암종 세포를 수지상세포의 교육에 이용하였다(Fig. 2).

편평세포암종 세포 처리 이후 수지상세포의 기능 변화
   수지상세포와 UVB로 처리된 다양한 수의 편평세포암종 세포를 24시간 함께 배양한 뒤 수지상세포에서 분비되는 중요한 Th1 cytokine의 하나인 IL-12p70 subunit을 배양 상층액으로부터 ELISA 방법으로 측정하였다. IFN-γ의 첨가여부에 따라 수지상세포 단독으로 배양한 경우에 IL-12p70 분비량은 각각 8.9 및 87.6 pg/ml이었으며 1：1의 비율로 UVB로 처리된 편평세포암종 세포를 함께 배양한 경우에는 64.6 및 189.5 pg/ml 이었다. 즉, IL-12p70의 분비 유도를 위하여 IFN-γ를 첨가하거나 첨가하지 않았을 경우 모두 UVB로 처리된 편평세포암종 세포를 함께 배양한 수지상세포의 경우에 IL-12p70의 분비능이 증가됨을 관찰하였다(Fig. 3).

수지상세포에 의한 apoptotic body의 탐식 확인
   녹색 형광물질인 PKH-GL로 염색된 수지상세포와 UVB를 조사한 뒤 붉은색 형광물질인 DiI로 염색된 편평세포암종 세포를 함께 배양한 뒤 confocal 현미경을 이용하여 관찰하였다. 성숙된 수지상세포에서 볼 수 있는 특징적인 가지 모양의 많은 dendrites 들이 관찰되고 있으며, 세포고사에 의하여 조각난 apoptotic body의 일부는 수지상세포 내부로 탐식되어 있고, 그 중 일부는 수지상세포의 dendrites에 의하여 붙잡혀 있는 상태로 관찰되었다. 이는 수지상세포가 apoptotic tumor cell을 섭취(phagocytosis)할 수 있음을 의미한다(Fig. 4). 

수지상세포 백신에 의한 항암예방효과
   대조군인 생리식염수 치료군(NS), apoptotic tumor 치료군(AT), 특별한 처치를 하지 않은 수지상세포를 이용한 치료군(N-DC)에서는 모두 비슷한 정도의 지속적인 종양 성장이 관찰되어 apoptotic tumor 만으로 또는 종양항원의 교육을 받지 않은 수지상세포만으로의 백신은 효과가 없음을 알 수 있었다. 반면 apoptotic tumor로 교육(pulsing)된 DC로 치료한 군(A-DC)은 크게 두 부류의 결과를 보였다. A-DC의 약 19%는(n=6/31) 종양의 생성시기가 늦고 성장이 지연되어 종양세포 주입 후 28일 째 측정한 종양의 크기가 NS 대조군에 비교하여 의미있게 작았으며(p=0.0029), 나머지 대부분을 차지하는 81%에서는(n=25/31) 종양이 생성이 되지 않거나 또는 2주 이내에 종양이 완전 소실되었다(Fig. 5). 최종 치료 10주 후 종양이 성립되지 않은 A-DC군 동물 중 6마리를 택하여 처음 주입하였던 종양의 10배에 해당하는 5×10⁶ 편평세포암종 세포를 재차 주입하여 그 중 50%에 해당하는 3마리에서 종양이 성립되지 않았으며 나머지 3마리에서는 대조군에 비교하여 종양의 성장이 지연되고 종양의 크기가 상대적으로 작은 경향이 있음을 관찰하였다. 

종양특이적 전신면역 성립의 확인
   치료를 받은 각 실험군 동물의 비장세포를 종양 주입 21일째 분리하여 UVB 조사를 거친 SCCVII 세포로 자극하거나 실험과 무관한 악성흑색종 세포로 자극하여 백신에 사용된 편평세포암종 세포에 대한 특이적 IFN-γ의 분비 여부를 측정하였다. 종양의 성장이 지연된 A-DC군이나 종양이 성립되지 않는 A-DC군 모두에서 SCCVII 세포로 자극하는 경우 IFN-γ의 분비가 대조군에 비교하여 의미 있게 상승됨을 관찰하였다(p<0.0001). 반면 악성흑색종 세포로 자극한 경우에는 A-DC군에서도 대조군과 마찬가지로 자극한 양에 관계없이 IFN-γ의 분비의 증가가 관찰되지 않아 예방백신에 사용된 SCCVII 세포에 대한 특이적인 전신면역능이 형성되었음을 확인할 수 있었다(Fig. 6).

고     찰

   수술 수기의 많은 발전과 새로운 화학치료 약제의 개발, 새로이 개발된 여러 방사선 치료 기법에도 불구하고 지난 30년 간 두경부암 환자의 치료 성공율이나 생존율의 향상이 없는 현실이다.¹²⁾ 치료의 실패는 이차중복암 또는 일차치료 이후의 국소재발, 전신전이 등에 기원하며, 대부분의 국소재발이나 전신전이는 현재의 기술로서는 발견하기 어려운 미세잔존암 때문으로 해석할 수 있다. 기존 치료의 한계를 극복하기 위한 여러 새로운 시도 중 하나인 항암면역치료는 정상조직에는 해를 미치지 않고 선택적으로 암세포만을 공격할 수 있다. 또한 마지막 남은 하나의 암세포까지도 제거할 수 있으며 면역기억반응에 의하여 암의 재발을 방지할 수 있다는 이론적인 장점을 기대할 수 있다. 여러 문헌을 통하여 보고되는 면역치료의 시도를 검토하면서 저자들이 기대하는 면역치료의 실질적인 임상적용은 진행된 암의 주된 치료로 활용되기 보다는 기존치료에 보조적으로 활용됨이 적절하리라 판단되었다. 즉, 수술 절제연에 남을 수 있는 현미경적 차원의 잔여암 치료, 수술과정 중 발생할 수 있는 암세포의 혈행 내로의 유리 및 이주에 의한 전신전이의 예방, 치료 시작 시점에서 발견할 수 없었던 미세전이암의 치료, 암의 재발을 방지하는 백신으로서의 활용 등을 생각할 수 있다. 실제로 저자들은 면역기능이 유지된 DBA2 마우스에 KLN205 편평세포암종 세포를 이용하여 진행된 고형암을 만들고 수지상세포를 이용한 면역치료의 효과를 검토하여 본 결과 의미 있는 종양성장억제의 효과를 거두기 위하여는 수지상세포 단독으로는 불충분함을 확인한 바 있었다.⁵⁾
   이에 본 연구에서는 예방백신으로서의 수지상세포의 항암효과를 확인하고자 하였으며, 그 결과 의미 있는 항암 예방효과를 관찰할 수 있었다. 수지상세포 단독 또는 세포고사에 빠진 편평세포암종 세포만으로 치료한 대조군의 경우 지속적인 종양의 성장이 관찰된 반면 UVB로 처리하여 세포고사의 상태인 편평세포암종 세포로 교육을 거친 수지상세포로 치료한 경우 81%에 해당하는 실험동물에서 초기에 촉지가 가능한 정도의 작은 종양이 성립된 후 2주 이내 소멸되거나 종양의 성립을 초기부터 전혀 관찰할 수가 없었다. 또한 나머지 19%의 동물에서도 종양의 성립이 지연되고 대조군에 비교하여 의미있게 성장이 지연되는 결과를 보여 실험에 이용되었던 편평세포암종에 대한 예방백신으로서의 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 하지만 편평세포암종 중에서도 부위별 또는 환자별 암세포의 특성이 다르거나 서로 종양항원이 다를 수 있으므로 보편적인 예방백신의 개발을 위하여는 여러 종류의 편평세포암종 세포주 또는 직접 환자의 편평세포암종으로 부터 분리된 암세포를 혼합하여 수지상세포를 교육하는데 사용하는 등의 추후 연구 및 개발이 필요하다고 하겠다.
   수지상세포는 1973년 Steinman과 Cohn에 의해 T 세포의 강력한 자극능력을 갖는 체내에서 가장 전문적인 항원제공세포로 밝혀지게 되었다.¹³⁾ 수지상세포가 강력한 면역 기능 활성의 중심 역할을 할 수 있는 것은, 세포 표면에 MHC molecules(class Ⅰ, Ⅱ)뿐 아니라, co-stimulatory molecules(CD80, CD86)과 adhesion molecules 들을 고농도로 발현하고 있고 여러 종류의 Th1 cytokine, 즉 IFN-alpha, IL-12, IL-18등을 분비하기 때문인 것으로 알려져 있다.¹⁴⁾ 수지상세포를 이용한 암 환자의 치료 시도는 대부분 종양관련 항원이 알려진 악성흑색종이나 전립선암, 악성혈액암 등에서 진행되었으며, 항원의 종류로서는 종양특이peptide를 사용하거나,¹⁵⁾ immunoglobulin protein, 또는 fusion heteroconjugates의 사용¹⁶⁾ 등을 들 수 있으며, 크게는 30% 정도의 반응율을 보고하고 있다. 한편 편평세포암종은 상대적으로 암세포 자체의 항원성 또는 면역 자극성이 부족하며, 종양 특이 항원이 밝혀지지 않은 이유 등으로 수지상세포를 이용한 두경부영역의 편평세포암종에 대한 항암치료 연구는 아직은 세계적으로도 매우 적은 수에 불과한 실정이다.
   수지상세포를 이용한 백신의 개발을 위하여는 종양항원을 수지상세포에 전달시키는 과정이 필수적인데, 현재까지의 대부분의 임상 시도는 종양특이 peptide를 이용하는 방법에 국한되어 있다. 특이 peptide를 이용하는 경우는 수지상세포에서의 항원 처리과정 없이 직접 T 세포로의 전달이 가능하여 그 효과가 직접적이고도 큰 반면, tumor escape 현상의 우려가 있으며 또 모든 환자에서 특이 peptide를 확인하기가 현실적으로 불가능하고, 어떠한 peptide가 가장 면역반응 유도 능력이 강한 지 결정하기가 어렵다는 점 등 많은 문제점이 있다.¹⁷⁾ 따라서 편평세포암종의 경우처럼 종양특이항원의 sequence를 모르거나 정제가 곤란한 경우에는 whole tumor cell을 항원의 source로 이용하는 것이 쉽고도 실질적인 방법일 수 있다. 본 연구에서는 apoptotic cell이 종양특이항원의 source로 작용할 수 있으며 이를 섭취한 수지상세포는 특이적 T 세포 반응을 유도할 수 있다는 Albert 등의 보고에 근거하여¹⁸⁾ apoptotic tumor cell 전체를 이용하는 방법으로 수지상세포를 교육하였다. 효과적인 apoptosis의 유도를 위하여 activated natural killer cell, γ-ray irradiation, serum deprivation, TRAIL 처리 등 여러 방법을 비교한 결과 UVB irradiation으로 간편하면서도 일관된 apoptosis의 정도를 얻을 수 있음을 확인한 바 있었다(data not shown). 한편 종양세포 전체를 이용하는 다른 방법으로 freezing-thawing 반복 과정을 통한 tumor lysate을 이용하여 동물실험을 시도하였으나 apoptotic tumor를 이용한 경우에 비하여 그 예방 또는 치료효과가 일관되지 않거나 의미 있는 효과의 관찰이 어려워 이후 실험은 UVB 조사를 이용한 apoptotic SCCVII 세포 전체를 종양항원의 source로 활용하게 되었다.
   본 연구 및 기존 연구를⁵⁾ 통하여 수지상세포에 의한 효과적인 apoptotic tumor body의 섭취를 확인한 바 있었으며, apoptotic tumor 처리 이전과 비교하여 T세포를 자극하는 능력(mixed leukocyte reaction) 또한 항진됨을 확인¹⁹⁾ 할 수 있었다. 한편 수지상세포의 성숙도(maturation) 및 극성화는(polarization) 실질적으로 수지상세포를 질병 치료에 이용하려 할 때 반드시 고려하여야 할 사항으로 받아들여 지고 있는데,²⁰⁾ 본 연구에서 이용된 수지상세포의 경우 apoptotic tumor 처리 후 IL-12 분비능력의 향상이 확인되어 항암치료에 적합한 Th1 polarization의 효과가 있음을 알 수 있었다. 하지만 추가적인 수지상세포 표현형의 성숙은 유세포분석을 통하여 관찰할 수 없었는데 이는 bulk-culture 배양법으로 이미 수지상세포가 충분히 성숙된 때문으로 해석되었다. Bulk-culture는 골수에서 수거된 세포 중 RBC를 제거한 후 기존과 동일한 농도의 GM-CSF와 IL-4를 사용하여 5~7일간 2×10⁵/ml의 농도로 특별한 처치 없이 배양한 이후 수지상세포를 최종 분리하기 위하여 14.5%의(w/v) metrizamide를 이용하여 gradient separation을 시행하고 중간 층에 분리된 세포를 수거하여 세척과정을 거치는 간단하고 쉬운 방법이다. 보편적으로 사용되고 있는 기존의 방법¹¹⁾과 비교하여 성숙한 표현형을 가지며 기능적으로 뛰어난 수지상세포를 mouse 골수로부터 조기에 쉽고 편리하게 대량 생산하는 새로운 배양 기법이라 할 수 있다.¹⁰⁾ 
   예방백신 치료로 종양의 성립을 극복한 A-DC군의 일부 동물을 이용하여 10배 많은 수의 편평세포암종을 최종치료 10주 후 재주입한 결과 50%의 동물에서 종양이 발생되지 않는 예방효과를 재확인할 수 있었다. 이는 사용된 편평세포암종에 대한 면역 기억반응이 형성되었음을 의미하지만, 나머지 50%의 동물에서는 절대적으로 많은 수의 tumor burden을 완벽하게 극복하기에는 다소 불충분한 면역기억이 형성되었음을 의미하기도 한다. 즉, 예방백신의 효과를 극대화하기 위한 방법상의 개선이 필요함을 의미한다고도 해석할 수 있다.
   A-DC군의 비장세포에서 분리된 세포를 SCCVII 세포로 다시 자극한 경우에 한하여 IFN-γ의 분비가 증가되며 실험과 무관한 B16F10(H-2b) 악성흑색종 세포로 자극한 경우 IFN-γ의 분비가 거의 없음은 사용된 SCCVII 세포에 특이적인 전신면역반응이 형성되었음을 의미한다. A-DC군의 경우 종양이 성립되지 않은 경우나 작은 크기의 종양이 성립된 경우 모두 비슷한 양상의 IFN-γ 분비가 관찰된 반면 NS, AT, N-DC군 등에서는 SCCVII 세포로 자극하거나 B16F10 세포로 자극한 경우 모두 유의한 IFN-γ의 분비가 관찰되지 않아 A-DC군의 경우에만 전신적, 특이적 면역반응이 형성되었음을 확인할 수 있었다.
   수지상세포는 약 30년 전 그 존재가 알려진 이후 암과 관계된 세포성면역의 조절뿐 아니라 천식, 비염 등의 알레르기질환의 체액성면역 조절, 그리고 당뇨, 갑상선염, 관절염 등의 자가면역질환과 간, 신장, 심장 등의 이식수술 이후 발생되는 거부반응의 조절 즉 면역관용에도 핵심적인 세포로 밝혀져 그 중요성이 날로 강조되고 있다. 이후 2004년 5월까지 약 17,000여편 이상의 관련 SCI 논문이 발표된 바 있으며, 약 350여건 이상의 임상시험이 미국 및 유럽, 일본을 중심으로 진행 중인 것으로 파악된다. 하지만 수지상세포의 다양한 면역조절 기능을 비롯하여 항원제공방법, 투여경로, T 세포와의 관계 등 아직 이해가 부족한 부분이 더 많아 앞으로도 수지상세포에 집중된 연구와 투자가 계속될 전망이며 이를 바탕으로 효과적인 항암백신의 개발이 멀지 않아 가능하리라 기대해 본다.

결     론

   진행된 암의 치료나 재발을 방지하기 위하여 새로운 치료법이 요구되고 있으며, 암 환자의 면역기능이 저하되거나, 면역세포의 종양내 침윤정도와 예후가 관계 있는 점, 일부 종양에서 면역치료의 성과는 두경부영역의 가장 흔한 악성종양인 편평세포암종에서도 면역치료의 충분한 가능성 및 타당성을 시사한다. 본 연구에서는 apoptotic SCCVII 세포로 교육된 수지상세포를 이용하여 동물모델에서 예방백신의 효과가 있음을 확인하였으며, 이는 항원성이 높지 않거나 종양특이항원의 확인이 어려운 두경부 편평세포암종 환자에서도 향후 수지상세포를 이용한 면역치료의 가능성이 높음을 의미한다고 생각된다. 

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