교신저자：정광윤, 136-705 서울 성북구 안암동 5가 126-1  고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
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서     론

   두경부를 포함하여 여러 부위에 발생한 종양에서 Prostaglandin의 발현이 증가되어 있으며 종양의 성장과 전이에 관여하리라 생각된다.¹⁾ Prostaglandin은 arachidonic acid로부터 생성되며 cyclooxygenase(COX)가 촉매제로서 작용한다. COX는 두가지 아형이 있으며 이중 COX-2가 염증성 cytokine, 성장인자, 종양유전자 등에 의해 발현이 증가되고²⁾ 갑상선암을 포함하여 대장암,³⁾ 유방암,⁴⁾ 폐암⁵⁾ 및 두경부 편평세포암종⁶⁾에서 그 발현이 증가되어 있다.⁷⁾ 이런 상피세포에서 유래한 종양의 발생에 있어서 COX-2의 역할은 논란이 되고 있으나 세포고사의 억제와 신생혈관생성의 촉진을 일으키는 것으로 생각되며 종양세포를 활성화시켜 종양의 발생에 관여한다.⁷⁾ 또한 COX-2의 발현증가가 vascular endothelial growth factor(VEGF)를 포함하여 여러 혈관신생 촉진인자들의 생성을 변화시켜 종양의 혈관생성을 조절하여 종양의 성장과 전이에 관여한다.¹⁾
   최근 갑상선암에서 VEGF의 발현이 밝혀졌고 갑상선의 악성세포에서의 VEGF의 생성이 생체내 또는 생체외 연구에서 증명되었다.⁸⁾⁹⁾ 이런 VEGF는 4가지 아형이 있으며 이중 VEGF-C는 혈관내피세포의 이동과 증식에도 관여하지만 주로 림프관 증식에 관여하는 림프관생성 촉진인자로 종양의 전이유발에 관여한다.¹⁰⁾
   갑상선암에서의 VEGF-C 발현은 다른 갑상선암에 비해 갑상선 유두상 암종에서 더 많은 발현을 보이고 림프절 전이 유무에 따라 그 발현의 차이를 보인다.¹⁰⁾¹¹⁾
   본 연구에서는 갑상선 암종에서 COX-2와 VEGF-C의 발현정도가 갑상선 유두상 암종의 여러 예후 인자들과 연관성을 보이는 지에 대해 알아보고자 하였다.

대상 및 방법

대  상
   1999년 1월부터 2002년 12월까지 고려대학교 안암병원 이비인후-두경부외과에서 갑상성 유두상 암종으로 진단된 후 수술을 시행받은 38명의 환자를 대상으로 하였다. 
   성별은 남자 6명, 여자 32명이었고, 수술당시 연령분포는 17세에서 80세로 평균 47.4세이었다. 환자의 의무기록지 및 조직병리 검사 결과지를 토대로 나이, 성별, 종양의 크기, 림프절 전이유무, 병기, 피막외 침범유무를 후향적으로 조사하였으며 원발부위와 경부 림프절의 병기는 미국 암 합동위원회(American Joint Committee on Cancer(2002))의 분류에 따라 판정하였다.

면역조직화학적 염색
   면역조직화학적 염색을 위해 통상적인 포르말린 고정과 파라핀 포매를 거친 조직을 4 μm 두께로 박절하여 양전하를 띤 슬라이드(ProbeOn Microscope Slides, Fisher Biotech, U.S.A.)에 부착시키고 60℃의 항온기에서 한시간 가온한 뒤 Xylene으로 5분간 탈 파라핀을 3회 반복 시행한 후 순차적으로 낮은 농도의 알코올로 함수시킨 후 증류수로 수세하였다. 내인성 과산화효소의 활성을 억제시키기 위해 0.3% 과산화수소수를 사용하여 10분간 처리한 후 Tris 완충 용액(Tris 3.025 g, 1 M NaCl 40 g, 1 M HCl 22 ml in H₂O 5 L, pH 7.4)에 씻었다. 항원 회복을 위해 citrate 완충 용액(sodium citrate 14.7 g, 1 M HCl 27 ml in H₂O 5 L, pH 6.0)을 압력솥에 채우고 가온하여 끓기 시작할 때 슬라이드를 넣고 압력이 최고(103 kPa)에 도달한 후 2분간 더 끓이고 찬물에 담가 압력을 낮춘 후 슬라이드를 꺼내 Tris 완충 용액에 담갔다. 일차항체는 human COX-2에 대한 rabbit polyclonal antibody(Cayman Chemical, Ann Abor, MI)와 human VEGF-C에 대한 rabbit polyclonal antibody(Zymed Lab, San Francisco, CA)를 Tris 완충 용액에 1：100으로 희석하여 실온에서 4시간 반응시켰다. 일차항체 반응후 Tris 완충 용액으로 수세하고 이차항체인 biotinylated link anti-mouse and anti-rabbit immunoglobulin과 Horseradish peroxidase(HRP)에 streptavidin을 결합한 streptavidin-HRP를 이용하여 차례로 실온에서 30분간 반응시켰다. Tris 완충 용액으로 수세하고 발색제인 H₂O₂-3, 3'-diamino-benzidine(DAB) 용액을 가하여 발색 반응을 관찰하면서 5분간 반응시켰다. 물에 수세하여 발색 반응을 끝내고 Harris hematoxylin으로 대조염색하고 탈수한 후 봉입하였다. 음성 대조군에서는 일차항체 대신 생리식염수를 이용하여 동일한 방법으로 염색하였다. 

판  독
   염색결과 판독은 병리전문의에 의하여 과거의 조직 병리학적, 임상적 정보없이 시행되었으며, 면역염색의 정도를 결정하기 위해 과거 문헌에서 보고된 측정방법을 수정하여 반정량적인 점수를 매겨 비교하였다.⁸⁾ 첫번째로 면역염색의 강도에 대한 점수는 염색이 안된 경우를 0, 각 세포의 세포질에 부분적이면서 약하게 염색된 경우(weak)를 1, 각 세포의 세포질에 좀 더 미만성이면서 강하게 염색된 경우(intermediate)를 2, 세포내의 전 세포질에 걸쳐서 강하게 염색이 된 경우(strong)를 3으로 부여했다(Fig. 1). 두번째로 염색된 갑상선 세포들의 전체적인 분포정도에 대한 점수는 염색이 안된 경우를 0, 30% 이하로 염색이 된 경우를 1, 30~60%인 경우는 2, 60% 이상은 3으로 부여했다. 최종 점수는 이들 두 점수를 곱하여 구하였다(Table 1).

통계학적 분석
   자료의 유의성 검정에서 나이, 성별, 림프절 전이유무, 병기, 피막외 침범 유무에 따른 COX-2와 VEGF-C의 발현의 차이는 비모수 Mann-Whitney U 검사법을 이용하였고 종양의 크기에 따른 발현의 차이는 비모수 Kruskal-Wallis test 검사법에 의하여 유의성을 판정하여 p<0.05인 경우를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
   또한 COX-2 발현과 VEGF-C 발현간의 연관성을 분석하기 위해 Pearson correlation 검사법을 이용하여 분석하였다.

결     과

   대상군 38예 중 31예(81.6%)에서 COX-2의 발현이 있었으며 VEGF-C는 34예(89.5%)에서 발현이 있었다. COX-2와 VEGF-C는 모두 세포질에서 염색이 되었으며 유두상 암종의 주변의 정상조직에서 COX-2의 발현은 없었으나 VEGF-C의 발현은 3예(7.9%)에서만 발현이 되고 대부분 발현이 없었다. 또한 COX-2는 세포질에 미만성의 형태로 염색이 되는 반면 VEGF-C는 과립성의 형태로 염색이 되는 경향을 관찰할 수 있었다.
   COX-2와 VEGF-C의 발현정도를 나타낸 반정량적인 점수를 바탕으로 분석한 결과 서로의 발현간의 연관성이 있었다(p=0.003)(Table 2)(Fig. 2).
   갑상선 유두상 암종의 여러가지 예후 인자들에 따른 발현의 차이를 분석한 결과 나이, 성별, 원발종양의 크기에 따라 COX-2와 VEGF-C 모두에서 발현의 차이를 보이지 않았다. 하지만 COX-2는 종양의 병기(p=0.004)와 피막외 침범 유무(p=0.017)에 따라 발현의 차이를 보였으며 VEGF-C는 종양의 병기에 있어서 발현의 증가를 보였으나 통계학적으로 유의한 차이를 보이지는 않았고(p=0.07), 림프절 전이 유무(p=0.04)와 피막외 침범 유무(p=0.027)에 대해서는 발현의 차이를 보였다(Table 3).

고     찰

   갑상선암을 포함하여 상피세포에서 유래한 다양한 종양에서 COX-2와 VEGF 발현의 증가가 관찰되고 이들이 종양의 성장과 전이에 관여하리라 보고되고 있다. 하지만 아직 이들이 종양의 성장과 전이에 있어서 어떠한 역할을 하는지에 대한 정확한 기전이 알려진 바 없으며 신생혈관생성이 그 중요한 기전 중의 하나로 생각된다.
   종양의 성장과 전이에 가장 중요한 신생혈관 생성과정에 있어서 COX-2와 VEGF는 서로 중요한 연관성이 있음이 증명되었다.¹²⁾ 두경부 편평세포암종에서 COX-2 발현, prostaglandin level, VEGF 발현, 신생혈관생성 간의 밀접한 연관이 있으며 indomethacin과 celecoxib와 같은 COX inhibitor의 투여시 상피세포 암종에서의 VEGF 발현이 감소됨을 보아 COX-2가 VEGF의 생성을 조절하여 종양의 혈관생성에 중요한 역할을 하리라 생각된다.¹⁾ 저자들의 연구에서도 COX-2와 VEGF-C의 발현간에 유의한 연관성을 보였다.
   하지만 정상 조직에서 COX-2의 발현이 되는 신장이나 중추신경계처럼 갑상선에서도 염증성 질환이나 종양에서만 발현이 되는 것이 아니라 정상 갑상선 세포에서 발현이 된다는 보고가 있다. 이들은 갑상선에서 COX-2가 염증이나 종양에 의해 유발되는 것이 아니라 갑상선의 혈류공급조절을 목적으로 생성된다고 했다.⁷⁾¹³⁾ 그러나 저자들의 결과는 이와 달리 정상 갑상선 세포에서는 COX-2의 발현이 일어나지 않았으며 갑상선 종양세포의 세포질에서만 그 발현이 관찰되었다.
   VEGF-C는 VEGF의 4가지 아형 중의 하나로 림프관생성에 관여하는 인자로 생각되며 갑상선암의 림프절 전이 유무에 따라 그 발현의 차이가 있으나 종양의 병기에 따른 발현의 차이가 없음이 보고된 바 있으며 본 연구의 결과에서도 VEGF-C의 발현이 림프절 전이를 보인 군에서 더 증가되어 있었고 병기에 따른 발현차이는 없었다.¹⁰⁾¹⁴⁾ 하지만 COX-2의 발현은 이와 달리 림프절 전이 유무에 따라 유의한 차이를 보이지 않았고 병기에 따른 발현의 차이만을 보였다.
   COX-2와 VEGF-C 모두에서 유의한 발현 차이를 유발한 피막외 침범은 갑상선 유두상 암종의 예후에 중요한 인자로 COX-2의 경우 병기의 차이에 따른 발현의 유의한 차이를 발생시킨 요인으로 생각된다. 이와 같은 피막외 침범에 따른 발현의 차이는 COX-2와 VEGF-C의 역할이 종양의 성장에 필요한 신생혈관생성과 함께 주변조직으로의 침윤에도 관여하기 때문이라고 생각된다.

결     론

   갑상선 유두상 암종의 여러 예후 인자들과 COX-2와 VEGF-C의 발현 간의 관계를 분석한 결과 종양의 성장과 전이에 밀접한 관계가 있는 종양의 병기, 림프절 전이 유무, 피막외 침범 유무에 따라 발현의 차이를 보였다. 따라서 COX-2와 VEGF-C가 다른 상피세포 종양에서와 마찬가지로 종양의 성장과 전이에 중요한 역할을 하리라 생각된다.

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