교신저자：정대건, 130-709 서울 동대문구 전농 2동 620-56  가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실
              전화：(02) 958-2145 · 전송：(02) 959-5375 · E-mail：coolkim@chol.com

서     론

   후각기능 장애는 이비인후과 영역에서 흔히 접하게 되는 감각 장애의 하나로써, 최근 삶의 질에 대한 관심이 증가하고 후각 장애에 대한 다양한 연구들이 진행되면서 임상적 진단이 증가하고 있다.
   적절한 치료를 위해서는 후각 장애를 유발한 원인의 파악이 중요한데, 후각 장애를 야기하는 대표적인 원인으로는 비부비동 질환, 상기도 감염, 두부외상, 노화, 화학적 손상, 선천성 기형, 내분비 질환, 신경퇴행성 질환 등이 알려져 있다.¹⁾
   비부비동 질환에 의한 경우는 비강 용종에 의한 비폐색으로 후각 유발 물질이 후각상피에 도달하지 못하거나, 염증작용에 의해 야기된 후각상피세포의 손상으로 인하여 발생할 수 있다.²⁾ 따라서 부비동 내시경 수술이나 비중격 교정술 등의 수술적 치료를 시행하고, 가역성이 있는 후각 장애의 경우 경구 및 국소용 스테로이드를 사용하여 후각의 회복을 도모할 수 있으며, 특히 염증성의 가역성 후각 장애의 경우 스테로이드의 항염증 작용으로 인한 후각기능의 회복을 기대해 볼 수 있다.³⁾
   후각소실의 회복에 대한 스테로이드의 효과가 비교적 잘 알려져 있음에도 불구하고 아직까지 명확하게 작용기전이 규명되어 있지는 않으나, 최근의 여러 연구들에 의하면 스테로이드는 염증을 억제하는 국소 혹은 말초적 작용과 아울러 중추신경계에도 함께 작용하여 후각기능의 회복에 관여하는 것으로 보고되고 있다.⁴⁾
   본 연구에서는 후각상피세포를 인위적으로 파괴하여 유발시킨 후각 장애에서, 국소 스테로이드 중 하나인 Mometasone furoate의 후각상피세포 재생 효과를 동물실험을 통해 객관적으로 연구하고자 하였다. 즉, zinc sulfate의 주입을 통해 인위적으로 유발된 후각 장애 동물모델을 만들고, 일정 기간 동안 Mometasone furoate로 치료한 후 후각과 직접 연관이 있는 후각수용체세포의 수를 관찰함으로써, 그 효과를 검증하는 것을 목적으로 하였다.

대상 및 방법

   마우스에서 zinc sulfate의 비강 내 주입으로 후각상피세포를 파괴시켜 야기된 가역적인 후각 장애 동물모델을 만든 후, 한 군은 Mometasone furoate를 비강내로 매일 주입하고(MOM군, n=12), 다른 군은 Mometasone furoate 처치를 시행하지 않은 대조군(non-MOM군, n=12)으로 나누어 서로 비교하였다. MOM군과 non-MOM군 모두 후각 장애를 유발한 후 2, 3, 4주에 4마리씩 희생하여 후각표지 단백질(olfactory marker protein：OMP)을 이용한 면역조직화학적 방법으로 후각상피에서의 후각수용체 세포수를 400배 시야에서 관찰하였다. 15×15 μm² 크기의 격자를 후각상피 고유판에 맞추고 격자 안의 면역 반응된 후각수용체 세포수를 세어 비교 관찰하였다.

실험 동물
   BCF1계의 20~25 g 사이의 건강한 수컷 마우스를 냄새를 통한 음식물 찾기 검사로 후각 기능의 장애가 없는 것을 확인한 다음 실험에 사용하였다. 음식물 찾기 검사는 동물들의 후각 상태를 검사하기 위한 방법으로, 동물을 하룻밤동안 먹이를 주지 않은 상태에서, 깨끗한 동물 사육조 안에 먹이를 깨끗한 대팻밥 안에 묻어 두어 먹이가 보이지 않는 상태에서 동물들이 냄새로 이를 찾을 수 있는 가를 보고 후각상태를 결정하였고,⁵⁾ 5분 이내 음식을 찾을 수 있는 30마리의 마우스를 실험 대상으로 하였다.

실험군

정상 대조군(normal 군, n=6)
   6마리의 마우스에 1 ml 주사기로 생리식염수 0.1 ml를 비강내로 주입하였다.

Mometasone furoate 주입군(non-MOM군, n=12)
   Zinc sulfate(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 비강에 주입하여 후각상피세포를 파괴시킨 후, 추가적인 처치를 하지 않고 관찰하였다.

Mometasone furoate 주입군(MOM군, n=12)
   Zinc sulfate를 비강에 주입하여 후각상피세포를 파괴시킨 후, 다음날부터 양측 비강에 1 ml 주사기에 마우스 콧구멍 크기에 맞게 끝을 절단한 polyethylene catheter tube를 연결하여 Mometasone furoate를 하루 한 차례 각각 한 방울씩 점적하여, 마우스가 호흡하면서 자연스럽게 이를 흡입하도록 하였다.

무취증 유발법
   무취증 유발은 0.9% NaCl 용액에 용해한 5% zinc sulfate용액을 1 ml 주사기에 polyethylene catheter tube를 연결하여 0.1 ml를 양측 비강에 주입하였다. 흡인에 의한 질식과 중독을 방지하기 위해 이를 여러 번에 나누어 주입하면서 필요에 따라 비강과 구강을 흡입기로 흡입하면서 마우스의 전신 상태를 확인하며 실시하였다. 다음날 음식물 찾기 검사로 5분 안에 먹이를 찾지 못한 것을 무취증으로 확인하였다.

면역조직화학적 염색(비강 상피조직 염색)
   면역조직화학적 염색을 위한 1차 항체로 사용한 OMP에 대한 goat antiserum은 Margolis 교수(Department of Anatomy & Neurobiology, University of Maryland School of Medicine, Baltimore, MD, USA)로부터 제공받았다. 2차 항체로는 biotinylated anti-goat IgG(Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA)를 사용하였다.
   Non-MOM군과 MOM군에서 2, 3, 4주 째 ketamine hydrochloride(30 mg/kg/body weight)와 xylazine(6 mg/ kg/body weight)를 근육 주사하여 전신 마취시킨 후 0.1 M 인산완충식염수액(pH 7.4)으로 완충시킨 4% paraformaldehyde로 심장 관류를 통해 고정하였다.
   두부를 적출한 후 4% paraformaldehyde에 1일간 고정한 다음 Calci-clear rapid(Pational Diagnostics, Atlanta, GA, USA)에 1일간 탈회하여 Metharcan solution에 처리시킨 후 파라핀에 포매하였다. 포매된 비강의 비중격에 직각이 되게, 관상면(coronal)으로 4 μm 두께의 절편을 만들어 슬라이드(Probe On slide, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA)에 부착시켰다.
   면역조직화학적염색은 슬라이드에 부착한 조직을 건조시킨 후 xylene으로 파라핀을 제거하고, 90%, 80% 및 70% 알코올로 순서대로 탈수시킨 후, dextrose water로 세척하였다. 상온에서 0.3% 과산화수소에 20분간 처리한 후 세척하고, 희석된 정상 염소 혈청과 30분간 반응시킨 다음, 1：1000으로 희석한 1차 항체(OMP에 대한 goat antiserum)를 실온에서 1시간 반응시켰다. PBST(phosphate balanced saline Triton-X100)로 5분간 세척한 후 2차 항체(biotinylated anti-goat IgG)와 30분간 반응시키고, 다시 세척한 후 Vectastatin Elite ABC reagent(Vector Labo-ratories)로 30분간 처리한 다음 세척하였다. AEC(3-amino-9-ethyl carbazole)로 10분간 발색시킨 후 hematoxylin으로 대조염색을 한 후 crystal mount를 하였다.

OMP 양성 세포 관찰
   염색된 슬라이드를 광학 현미경하에서 각 조직 절편마다 비중격 상부를 덮고 있는 후각상피를 400배 시야에서 관찰하였다. 현미경에 격자가 그려진 대안렌즈를 이용하여 15×15 μm² 크기의 격자의 한면을 후각상피 고유판에 맞추고 그 안의 면역 반응된 후각수용체세포수를 세었다. 이때 격자 선에 세포가 걸쳐진 경우에는 상측과 좌측 선에 걸린 것은 포함하였고 하측과 우측 선에 걸린 것은 제외하였다. 각 개체의 후각수용체세포수는 서로 다른 6시야에서 측정한 수치의 평균으로 하였다.

통계 처리
   모든 자료는 평균±표준 오차로 표시하였다. 통계 검정 상 p<0.05를 유의한 것으로 간주하였고, 두 군 간의 세포수 분석은 SPSS V10.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)의 paired t-test, ANOVA를 사용하였다.

결     과

OMP 면역 조직화학적 소견
   정상대조군 후각상피에서 OMP에 대한 면역반응은 상피 가운데 넓게 퍼져 있는 후각세포의 핵 주위 세포질 및 가는 세포질 돌기에서 주로 관찰할 수 있었으며, 맨 바깥층의 지지세포나 기저층의 기저세포에서는 관찰할 수 없었다(Fig. 1).
   Zinc sulfate 주입 후 3주부터는 두 군 모두에서 후각상피의 층이 두꺼워져 핵이 여러 층으로 증가하였으며 맨 바깥 세포층이 뚜렷하게 관찰되기 시작하였다. 특히 OMP-양성세포가 3주 후부터 급격히 관찰되기 시작하였고, 4주 후에는 후각상피의 층과 OMP-양성세포의 수가 더욱 증가하였으며, 이러한 변화는 MOM군에서 보다 현저하였다(Fig. 2).

OMP-양성세포의 수(Fig. 3)
   정상 대조군의 OMP-양성세포는 단위 면적(225 μm2/격자)당 20.80±1.87개였다. 2주 째 두 군 모두 OMP-양성세포가 적은 수로 관찰되었고(MOM군：3.86±0.73개, non-MOM군：0.88±0.35개), non-MOM군에 비해 MOM군에서 좀 더 많은 수가 관찰되었으며 통계적으로 유의한 차이를 보였다(t=14.19, p<0.01).
   Zinc sulfate 주입 후 3주 째부터 두 군 모두에서 OMP-양성세포가 급격히 증가하기 시작하였으며, MOM군에서 10.88±2.36개로 non-MOM군 9.75±2.04개보다 많았으나 통계적인 의의는 없었다(t=1.49, p>0.05).
   Zinc sulfate 주입 후 4주 째는 OMP-양성세포의 수는 3주에 비해 더욱 증가하였으며, 특히 MOM군의 값이 14.98± 4.35개로 non-MOM군의 11.02±1.98개보다 훨씬 많았고 이는 통계적으로 유의하였다(t=3.17, p<0.01).
   결과적으로, zinc sulfate 주입 후 시간이 경과하면서 증가하는 OMP-양성세포 수는 MOM군이 non-MOM군보다 2, 3, 4주 모두 지속적으로 많았으며, 2주와 4주에서 통계적으로 유의하였다. 

고     찰

   후각 장애는 비부비동 질환, 상기도 감염, 두부외상, 노화, 종양, 독성 물질, 선천성 기형, 내분비 질환, 신경학적 퇴행 등의 많은 원인에 의하고, 기전에 따라 후각세포까지 후각 물질의 접근이 불가능한 전도성 장애, 후각세포 자체의 손상에 의한 감각성 장애, 후각신경 혹은 중추성 후각전달과정의 손상이나 기능 저하에 의한 중추성 장애로 분류할 수 있다.⁶⁾
   이들 중 비부비동 질환은 후각 장애의 원인 중에서 가장 큰 비중을 차지하는 것으로서, 비부비동 질환에서의 후각소실은 주로 점막 부종이나 용종에 의한 후열의 폐쇄로 후각 유발 물질들이 후각점막에 도달하지 못하거나, 후각 소실이 서서히 진행하는 특성에 비추어 볼 때 단순한 전도 장애 외에도 후각 상피의 손상 및 퇴행과 관련되어 발생하는 것으로 생각 된다.⁷⁾ 따라서 내시경하 비내술이나 비중격 교정술 등을 통해 비폐색의 원인을 제거하고, 손상된 상피 세포의 재생을 촉진시키거나 더 이상 손상의 진행을 억제하는 치료를 통해 후각 장애의 호전을 도모할 수 있다.³⁾
   작용기전이나 효과에 대해 현재까지는 명확히 알려져 있지 않지만, 후각 소실에 대한 치료 요법으로써 경구 및 국소 스테로이드를 비롯하여, Vitamin A, Aminophylline, Theophylline 등이 사용되고 있다.⁸⁾⁹⁾
   이 중에서 가장 널리 사용되고 있는 스테로이드는 항염증 효과와 면역억제 효과를 통하여 후각기능의 회복에 관여하는 것으로 생각되는데 비강 내 점막의 부종과 혈관확장으로 인해 후열 주위가 막혀있는 것을 감소시켜 후각 유발 물질이 후각신경 상피세포에 다다를 수 있게 하고, 세포막의 안정화, 매개물 분비의 변화, 세포 이주의 억제 등의 작용에 관여하여 후각 세포 기능의 정상화를 가져오는 것으로 알려져 있다.¹⁰⁾ 아울러, 상기도 감염 후에 생기는 후각소실과 같이 후각상피세포가 비가역적으로 손상 받은 경우에는 스테로이드가 별다른 효과가 없다는 보고도 있다.¹¹⁾
   최근의 연구들에 의하면 스테로이드가 후각 신경 수용체의 Na/K-ATPase 기능에 관여하여 후각세포의 기능을 항진시킴으로써 후각기능의 회복을 유도한다는 가설이 제기되고 있다.⁴⁾ 또한 스테로이드는 위와 같은 국소적인 작용 외에도 중추신경계에 작용하여 중추신경계의 흥분성을 증가시키고 다양한 자극에 대한 역치를 낮추며 기분 전환을 유도하는 효과가 있는 것으로 보고하고 있다.¹²⁾ 본 실험의 결과도 정확한 기전을 알 수 없지만 후각수용체세포의 회복에 도움을 준다고 할 수 있겠다.
   후각수용체세포는 다른 뇌신경과는 달리 사람에게서 유일하게 재생되는 신경세포로써 사람에서의 후각세포는 약 한 달 정도의 세포 주기를 가지는 것으로 알려져 있으며, 이는 후각신경이 외부환경에 노출되어 있어 쉽게 손상 받기 때문에 이에 대한 적응 기전으로 생각 된다.¹³⁾
   본 실험에서 마우스의 무취증을 만들기 위해 사용한 zinc sulfate(ZnSO4)주입은 일반적으로 1~5% 농도를 이용하여 비강 세척 또는 주입을 통해 괴사(coagulation necrosis)에 의한 후각 상피 세포의 광범위한 파괴를 일으켜 가역적인 후각 장애를 유발하는 방법으로,¹⁴⁾ zinc sulfate 처치 후 후각 인지에 대한 행동 검사의 확인 없이도 인정될 정도로 널리 사용되는 효과적인 방법이다. 그러나 zinc sulfate 투여량이 많거나 농도가 높은 경우 질식과 중독에 의한 사망이 많았다. 따라서 예비실험을 통한 적절한 농도와 투여량을 정하고, shock 발생시 처치 할 수 있는 산소마스크, 온열대, 흡입기의 구비와 올바른 투여방법에 대한 숙지가 필요하였다.
   본 실험에서 예비 실험을 통해 zinc sulfate 주입 후 수일 내 후각상피의 두께가 현저히 줄어들고, OMP 양성세포가 없는 것으로 zinc sulfate 투여로 후각세포가 파괴되었음을 확인하였다. 또한 맨 바깥층에 위치하는 원주형의 지지세포의 세포질 층이 보이지 않은 것으로 보아, zinc sulfate 주입으로 후각세포 뿐 아니라 지지세포도 함께 감소되는 것을 관찰하였다.¹⁵⁾
   Zinc sulfate 주입 후 1주 째에는 MOM군과 non-MOM군 모두에서 OMP-양성세포가 거의 발견되지 않았으나, 조직 상태가 좋지 않아 본 실험 결과에서 제외하게 되었다. 
   Zinc sulfate 주입 후 비강내로 매일 Mometasone furoate를 흡입시킨 군(MOM군)에서 2주 째 후각상피의 두께가 증가하였고 후각세포의 핵의 수가 증가하였으며, 표면의 지지세포의 원주형 세포질 층이 뚜렷이 관찰되는 것으로 보아 후각세포 뿐 아니라 지지세포도 재생되어 가는 것으로 생각되었으며, Mometasone furoate를 흡인하지 않은 군에서는 zinc sulfate 주입 후 3주부터 후각상피의 두께와 후각세포수가 현저히 증가하기 시작하였고 역시 3주부터 지지세포의 원주형 세포질 층이 뚜렷이 관찰되었다.
   이상의 결과로부터 MOM군은 non-MOM군에 비하여 1주일 빠른 2주 째부터 후각세포와 지지세포가 재생되어 가는 것으로 생각되지만, 이 때 OMP-양성세포는 별로 많이 관찰되지 않아 대부분의 후각세포는 분화과정의 어린세포일 것으로 생각된다. 
   Zinc sulfate 주입 후 3주에서부터 OMP-양성세포가 두 군 모두에서 급격히 증가하기 시작하되, non-MOM군보다 MOM군에서 많았으며, 4주 째 들어서면서 OMP-양성세포의 수는 3주에 비하여 더욱 증가하였고 역시 non-MOM군보다는 MOM군에서 통계적으로 유의하게 많았다.

결     론

   마우스에 있어 분무형 국소 스테로이드의 일종인 Mometasone furoate의 장기적인 비강 내 투여는 후각기능에 일차적으로 직접적인 관련이 있는 손상된 후각수용체세포의 정상화와 수의 증가에 도움을 주는 것으로 여겨진다. 따라서 후각 세포의 가역적 소실에 의해 야기된 후각 장애에서 비강 내 스테로이드의 투여가 후각 회복에 도움을 줄 수 있을 거라고 생각하며, 그 기전과 사람에서의 효과에 대한 보다 자세한 평가를 위해서는 앞으로도 많은 연구가 필요할 것으로 생각된다.

1. Doty RL. A review of olfactory dysfunction in man. Am J Otolaryngol 1979;1:57-79.

2. Moran DT, Jafek BW, Eller PM, Rowley JC. Ultrastructural histopathology of human olfactory dysfunction. Microsc Res Tech 1992;23:103-10.

3. Wolfensberger M, Hummel T. Anti-inflammatory and surgical therapy of olfactory disorders related to sino-nasal disease. Chem Senses 2002;27:617-22.

4. Fong KJ, Kern RC, Foster JD. Olfactory secretion and sodium, potassium-adenosine triphosphatase: Regulation by corticosteroids. Laryngoscope 1999;109:383-8.

5. Harding JW, Getchell TV, Margolis FL. Denervation of the primary olfactory pathway in mice. V. Long-term effect of intranasal ZnSO4 irrigation on behavior, biochemistry and morphology. Brain Res 1978;140:271-85.

6. Feldman JI, Wright HN, Leopold DA. The initial evaluation of dysosmia. Am J Otolaryngol 1986;4:431-44.

7. Kern RC. Chronic sinusitis and anosmia: Pathologic changes in the olfactory mucosa. Laryngoscope 2000;110:1071-7.

8. Leopold DA. Distortion of olfactory perception: Diagnosis and treatment. Chem Senses 2002;27:611-5.

9. Hirsch A, Dougherty D, Aranda J. Medications for olfactory loss: Pilot studies. J Neurol Orthop Med Surg 1996;17:109-14.

10. Ikeda K, Sakurada T, Suzaki Y, Takasaka T. Efficacy of systemic corticosteroid treatment for anosmia with nasal and paranasal sinus disease. Rhinology 1995;33:162-5.

11. Deems DA, Doty RL. Smell and taste disorders, a study of 750 patients from the University of Pennsylvania smell and taste center. Arch otolaryngol Head Neck Surg 1991;117:519-28.

12. De Kloet ER, Vreugdenhil E, Oitzl MS, Joels M. Brain corticosteroid receptor balance in health and disease. Endocr Rev 1998;19:269-301.

13. Graziadei PP, Graziadei GA. Neurogenesis and neuron regeneration in the olfactory system of mammals I. Morphological aspect of differentiation and structural organization of the olfactory sensory neuron. J Neurocytol 1979;8:1-18.

14. Crusio WE, van Abeelen JH. Zinc-induced peripheral anosmia and behavioral responses to novelty in mice: A quantitative-genetic analysis. Behav Neural Biol 1987;48:63-82.

15. Hansen LF, Hammer M, Petersen SH, Nielsen GD. Effects of intranasal ZnSO4 irrigation on olfactory and trigerminal cues. Physiol Behav 1994;55:699-704.