교신저자：박찬일, 301-721 대전광역시 중구 대사동 640  충남대학교 의과대학 이비인후과학교실 암연구소
              전화：(042) 220-7696 · 전송：(042) 253-4059 · E-mail：cpark@cnu.ac.kr

서     론

   두경부종양을 비롯한 다수의 고형암(solid cancer)에서 cyclooxgenase-2(COX-2)의 발현이 증가되어 있고 이 단백질의 증가가 종양의 성장, 신생혈관생성, 악성화, 전이 등과 관계가 있다고 알려져 있다.^1)2)3)4) 지난 10년간 COX-2는 여러 암의 생성과 성장을 연구하는데 중요한 분자생물학적 지표로 사용되어 왔고 이 단백질의 생성이나 작용을 억제하여 종양성장을 억제하고자 하는 새로운 항암치료법들이 제시되어 왔다.⁵⁾ 그러나, aspirin과 같은 비스테로이드성 항염증제들(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)은 정상세포의 세포 기능 유지에 기여하는 cyclooxygenase-1(COX-1) 단백질 생성에도 영향을 줄 수 있어 장기 복용할 때 위장관염 등과 같은 부작용을 가져올 수 있었다. 최근에 이러한 한계를 극복하기 위해서 종양이나 염증 등 필요한 상황에서만 만들어지는 COX-2 단백질만 특이하게 선택적으로 억제할 수 있는 약물(COX-2 선택적 억제제, COX-2 selective inhibitors)이 개발되었다. 실제로 임상에서 이들 약물을 인체에 투여하여 암의 생성과 성장을 억제하였다는 좋은 결과들이 보고되고 있다.⁵⁾
   최근 생쥐를 이용한 한 동물실험에서 창상모델(wound models)을 만들어 창상부에 종양을 이식하였을 때 종양의 성장이 촉진된다는 사실을 발견하였고 celecoxib과 같은 COX-2 억제제를 사용하여 이러한 종양성장 촉진 효과를 효과적으로 억제할 수 있다고 보고하였다.⁶⁾ 이러한 실험 결과를 통해 Roh 등⁶⁾ 은 암수술 중에 종양세포가 퍼져 수술부가 오염되거나 수술 후 현미경적 미세잔여암(microscopic residual tumors)이 남게 되는 등의 임상 상황에서도 celecoxib 투여를 통해 종양성장을 억제할 수 있다는 새로운 개념의 항암치료법을 제시하였다. 그러나 celecoxib이 창상부 종양성장 억제에 효과가 있다고 알려져 있으나 창상치유(wound healing) 자체에 미치는 영향에 대해서는 자세한 보고가 드물었다.⁷⁾ 일부 보고에서 celecoxib이 콜라겐 형성을 방해하지 않아 피부 장력(tensile strength)에 영향을 주지 않고 창상치유의 지연 없이 반흔(scar) 형성은 억제할 수 있다고 하였다.⁸⁾⁹⁾ Celecoxib을 비롯한 COX-2 선택적 억제제를 수술 후 종양억제 등의 목적으로 사용해야 할 상황에서 수술부 창상치유에 심각한 영향을 준다면 이들 약제의 사용에 어려움이 있을 것이다. 따라서 저자들은 생쥐에 창상모델(wound model)을 만들고 celecoxib을 투여하였을 때 창상치유에 미치는 영향과 위장관을 비롯한 전신에 부작용 등에 대하여 살펴보고자 하였다.

재료 및 방법

생쥐 창상모델의 개발
   C3H 생쥐(7주, 수컷；Korea Biolink Co., Eumsung, Korea)를 이용하여 좌우측 하지 상부 피부에 각각 절개창상(incisional wound)과 절제창상(excisional wound)을 만들었다(Fig. 1). 생쥐를 enflurane으로 전신마취 시킨 후 양측 하지 상부 피부에 덮인 털을 자르고 먼저 좌측 하지 상부 피부를 약 2 cm 정도 절개하였다. 절개부 피하지방과 근육에 수술용 가위를 이용해 여러 번 상처를 내어 출혈이 나게 하고 5-0 나일론으로 절개한 피부를 단속봉합(interrupt suture) 하였다. 상처부 반대측인 우측 하지 상부 피부 상피와 상피하근육을 약 5 mm 정도 크기의 원형 모양으로 절제하고 봉합 없이 피하지방이 노출된 상태로 있도록 절제창상(excisional wound)을 만들었다. 절개창상부의 봉합사는 창상 후 3일째 추가적인 창상을 만들지 않고 완전히 제거하였다.
   실험에 사용한 생쥐는 semi-specific pathogen free(SPF) 상태에서 원하는 양만큼의 물과 음식을 섭취할 수 있게 하였다. 또한 본 실험의 모든 절차는 충남대학교병원 동물실험위원회의 동의를 거쳐 시행하였고 가능한 인도적인 방법으로 모든 동물실험을 진행하였다.

창상 동물에 Celecoxib의 투여
   절개와 절제창상을 만든 C3H 생쥐에 창상을 만들기 하루 전날부터 celecoxib을 매일 20 mg/kg의 용량으로 2회 분할하여 위장관 튜브를 생쥐의 입을 통해 주입하고 약물을 삽입한 튜브로 통해 직접 투여하였다. Celecoxib은 한국파마시아로부터 받아 25 mg을 옥수수 기름(corn oil；Sigma, St. Louis, MO) 10 mL에 녹여 생쥐 마리당 약 100 μL을 사용하였고 대조군은 celecoxib을 섞지않고 옥수수 기름만 동량 투여하였다. 생쥐 몸무게 변화를 상처를 만들기 전과 후 일주일에 두 번씩 측정하고 상처부가 회복되는 정도를 사진으로 기록하였다.
   창상을 만들고 celecoxib을 투여한 군과 그렇지 않은 대조군을 다섯 마리씩 창상을 만든 후 제 3, 7, 14, 28일에 각각 희생하였다. 희생한 생쥐의 상처부를 수거하여 10% 포르말린에 고정하고 hematoxylin과 eosin(H & E)으로 염색하여 절개상처부에서 모세혈관의 수를 400배율 현미경에서 관찰하여 그 숫자를 기록하였다. 절제상처부에서 상피가 회복되어 덮이는 정도(재상피화, re-epithelialization) 를 측정자가 달린 현미경을 이용하여 다음과 같은 공식으로 측정하였다.
   재상피화 정도(%)=(1-상피가 덮이지 않은 부분 사이의 길이/상처를 만들 때 잘려나간 피하근육이 결손된 부분 사이의 길이)×100.¹⁰⁾
   또한 희생한 생쥐의 위장관을 모두 수거하여 생리식염수에 깨끗이 세척하고 현미경으로 관찰하였고 이상을 보이는 부분들은 모두 조직생검하여 H & E 염색으로 염증, 궤양, 세포 괴사 등과 같은 이상 여부를 살펴보았다.

통계 분석
   Celecoxib을 투여한 군과 대조군 생쥐들의 체중 변화, 재상피화 정도와 상처부 모세혈관 숫자를 평균과 표준오차로 표시하고 Mann-Whitney 검사를 이용해 두 군사이의 통계적 차이를 분석하였다. 통계적 의미를 p<0.05로 하였고 SPSS 10.0(SPSS Inc., Chicago, IL)을 사용하여 통계 분석을 하였다.

결     과

Celecoxib이 체중변화와 위장관에 미치는 효과
   생쥐에 절개와 절제창상을 만들고 매일 celecoxib을 투여한 군과 그렇지 않은 대조군으로 나누어 체중 변화를 관찰하였다. 실험에 사용한 생쥐는 7주령으로 창상을 만들 때 24.5±0.9 g이였고 창상을 만든 후 매주 약 1.5 g 정도 체중이 증가됨을 관찰할 수 있었다. 약물을 투여한 군과 대조군에서 모두 체중 증가가 관찰되었고 창상을 만든 후 4주까지 관찰한 생쥐의 체중 증가 정도는 양 군에서 차이를 보이지 않았다(Fig. 2). 
   생쥐를 희생하여 위장관을 모두 수거하고 육안적, 현미경적 관찰에서 특이한 소견이 관찰되지 않았다. 또한 약간의 변성이 의심된 부위에서 조직생검하여 H & E 염색 후 관찰한 조직학적 소견에서도 위장관의 궤양, 염증, 세포벽의 궤사 등을 관찰할 수 없었다.

Celecoxib이 창상치유에 미치는 효과
   창상을 당한 생쥐에 매일 celecoxib을 투여한 군과 그렇지 않은 대조군에서 창상치유 정도를 비교하였다. 절개 및 절제창상을 만들고 창상부를 매주 촬영하여 양군을 비교하였을 때 육안적인 창상치유가 약 2주 이내 완전히 이루어짐을 관찰할 수 있었다(Fig. 3). 절개창상부에 창상의 모양이 초기에는 뚜렷하였으나 약 2주가 지나면서 완전히 회복되었다. 또한 창상부의 반흔이 점차로 약화되었고 창상 후 4주에는 창상부에 다시 털이 덮여 원래 창상의 모양이 희미해졌다. 절제창상을 만들고 나면 노출된 창상부가 응고된 혈액으로 덮여 있다가 창상부 변연으로부터 상피가 재생되기 시작하였다. 절제창상부의 재상피화는 창상을 만든 후 약 10일에서 2주 사이에 완전히 이루어져 결손부를 덮었다. 양 군에서 재상피화가 이루어지는 정도를 비교하였을 때 육안적인 관찰에서 celecoxib을 투여한 받은 생쥐의 절제창상이 대조군의 창상보다 초기에 재상피화가 약간 지연됨을 알 수 있었다. 창상 후 2주가 지나면서 양 군 모두 창상의 재상피화가 완전히 이루어져 창상부의 반흔도 4주까지 점차 감소하였고 약간의 흔적만 확인할 수 있었다. 또한 절제창상부를 포함한 인접부위에 털이 나기 시작해 창상이 없는 부위보다 더 빨리 자란다는 흥미로운 사실도 발견할 수 있었다.
   재상피화를 정확하게 측정하기 위해 생쥐에 절제창상을 만들고 제 3, 7, 14, 28에 생쥐를 각각 다섯 마리씩 희생하여 창상부를 H & E 염색하여 관찰하였다. 재료 및 방법에서 설명한 것과 같이 재상피화 정도를 측정자가 달린 현미경을 이용해 측정하였을 때 창상부를 육안적으로 관찰한 것과 비슷한 결과가 관찰되었다(Fig. 4). 창상을 만들고 celecoxib을 매일 투여 받은 생쥐의 절제창상부에서 재상피화가 이루어지는 정도가 창상 후 약 7일까지 celecoxib을 투여 받지 않은 대조군과 비교하였을 때 지연된다는 사실을 발견할 수 있었다. 그러나 절제창상을 만든 후 약 2주가 지나면서 양군에서 완전한 재상피화가 이루어져 차이를 보이지 않아 celecoxib이 창상 후 2주 이내 초기 창상치유에만 영향을 준다는 사실을 관찰할 수 있었다. 또한 절개창상을 만든 생쥐의 창상부 피하에 모세혈관수를 celecoxib을 투여한 군과 대조군에서 비교하였다(Fig. 5). 절개창상 후 초기에 모세혈관수가 증가되다 창상 후 2주부터는 감소되었고 양 군에서 혈관수를 비교하였을 때 창상 후 초기뿐만 아니라 4주까지 차이를 보이지 않았다.

고     찰

   Celecoxib을 비롯한 COX-2 선택적 억제제는 종양의 성장, 신생혈관생성과 전이를 효과적으로 억제할 수 있다고 알려져 있다.¹¹⁾¹²⁾ 이러한 celecoxib의 종양성장과 전이 억제효과가 외과적 창상모델을 이용한 실험에서 흥미 있게 적용되었다.⁶⁾ Roh 등은 먼저 생쥐에 외과적 창상을 만들고 생쥐종양세포를 이식하였을 때 창상부에서 종양이 빠르게 성장한다는 사실을 발견하였다. 또한 외과적 창상부에 이식된 종양의 성장이 celecoxib 투여에 의해 의미있게 억제되고 종양의 폐전이도 현저히 감소된다는 사실도 관찰하였다. 이상에서 Roh 등⁶⁾이 발견한 것은 celecoxib의 종양억제 효과를 새로운 측면에서 발견한 것이다. 본 실험에서는 Roh 등이 celecoxib의 수술부 종양억제 효과를 관찰했던 실험을 연장하여 수술 후 상황 등에서 이 약제를 부작용 없이 안전하게 사용할 수 있겠는가 대해 C3H 생쥐를 이용한 절제창상과 절개창상 두 가지 창상모델을 만들어 관찰한 것이다.
   절제창상을 만들고 그 회복 정도에 대하여 재상피화를 중심으로 관찰하였을 때 창상을 만든 후 약 7일까지 창상의 초기 재상피화가 celecoxib을 투여한 생쥐에서 대조군보다 지연되었다. 그러나 창상을 만들고 난 2주 후에는 celecoxib을 투여한 생쥐나 대조군 모두에서 재상피화가 완전히 이루어져 수술전과 같은 상태로 회복되었다. 이것은 창상과 같은 염증상황에서 COX-1보다는 COX-2가 초기에 증가된다고 알려져 있는데¹⁰⁾ celecoxib과 같이 COX-2 선택적 억제제 투여에 의해 COX-2 생성에 영향을 주어 초기 창상치유가 지연되어 나타나는 현상으로 이해될 수 있다. Futagmi 등¹⁰⁾은 절제창상을 만들고 NS-398과 같은 COX-2 선택적 억제제를 투여하였을 때 창상 초기에 재상피화가 지연되는데 이것은 초기 창상에서 증가되는 COX-2를 억제하기 때문이라 하였고 본 실험에도 이와 같은 결과가 기대되나 창상에서 COX-2 단백질의 양을 정량적으로 분석한 것은 아니어서 이에 대해서는 추가적인 실험이 필요할 것으로 생각된다.
   이상의 결과로 미루어 볼 때 celecoxib 투여는 수술과 같은 창상의 초기 치유과정을 약간 지연시킬 수 있으나 수술 후 2주 이상부터 창상의 회복에 심각한 영향을 주지 않아 결과적인 창상치유에는 지장을 주지 않을 것으로 생각할 수 있다. 또한 피하층과 근육에 심한 창상을 만들고 단순봉합하여 절개창상을 만든 생쥐에서 창상부에 모세혈관수를 창상을 만든 후 시간 간격을 두고 관찰하였을 때 7일까지 꾸준히 증가하다 2주부터 다시 감소하게 되는데 celecoxib을 투여한 군과 대조군에서 차이를 보이지 않았다. 이와 같은 사실은 절개창상을 만든 생쥐에게 valdecoxib을 투여하였을 때 창상의 신생혈관생성에는 영향을 주지 않았다고 보고한 기존의 실험결과와 합치되는 것이다.⁷⁾ 이상의 사실들은 celecoxib과 같은 COX-2 선택적 억제제가 종양에서는 신생혈관생성을 억제한다고 알려져 있으나¹³⁾ 본 실험 결과로 볼 때 정상적인 조직이나 창상의 혈관생성에는 영향이 없어 수술과 같은 창상부의 혈관생성에 지장을 초래하지 않을 것으로 생각할 수 있다.
   본 실험에서 celecoxib이 창상치유 자체에 미치는 영향뿐만 아니라 체중감소나 위장관을 비롯한 전신에 부작용이 없는지에 대해 조사하였을 때 대조군에 비해 특이한 차이를 보이지 않았다. NSAIDs를 장기간 사용하면 위장관의 부작용과 이에 따른 체중감소가 나타날 수 있다. 이것은 이 약물들이 COX-1과 COX-2 모두를 비특이적으로 억제하는데 주로 위장관 부작용은 COX-2보다는 COX-1 억제에 영향을 받기 때문이다.¹⁴⁾ 또한 이것은 celecoxib이 COX-2만 선택적으로 억제하여 위장관의 부작용이 없어 궤양(창상치유에 영향을 주지 않는다는 기존 보고를 통해 유추할 수 있다.¹⁴⁾ 본 실험의 결과들은 기존에 celecoxib을 비롯한 COX-2 선택적 억제제가 위장관과 체중에 아무 이상을 주지 않는 안전한 약제임을 재확인한 것으로 볼 수 있다.^11)13)14)
   본 실험 조건에서는 celecoxib이 창상치유에 미치는 영향에 초점을 맞추어 진행한 실험으로 이 약제를 장기간 사용할 때 나타나는 부작용에 대해서는 살펴보지 않았으나 이것은 이미 celecoxib을 인체에 장기간 사용하였을 때 위장관 등에 부작용이 없었다는 기존의 보고를 통해 알 수 있겠다.¹⁵⁾

결     론

   생쥐 창상모델에서 celecoxib은 창상 후 초기에는 약간의 창상치유 지연을 초래하였으나 2주 이후에는 모두 회복되어 결과적인 창상치유에 영향을 주지 않았다. 또한 위장관을 비롯한 신체에는 심각한 영향을 주지 않아 창상치유뿐만 아니라 전신에 부작용이 없는 안전한 약제임을 확인하였다.

1. Tsujii M, DuBois RN. Alterations in cellular adhesion and apoptosis in epithelial cells overexpressing prostaglandin endoperoxide synthase 2. Cell 1995;83:493-501.

2. Tsujii M, Kawano S, Tsuji S, Sawaoka H, Hori M, DuBois RN. Cyclooxygenase regulates angiogenesis induced by colon cancer cells. Cell 1998;93:705-16.

3. Chan G, Boyle JO, Yang EK, Zhang F, Sacks PG, Shah JP, et al. Cyclooxygenase-2 expression is up-regulated in squamous cell carcinoma of the head and neck. Cancer Res 1999;59:991-4.

4. Uefuji K, Ichikura T, Mochizuki H. Cyclooxygenase-2 expression is related to prostaglandin biosynthesis and angiogenesis in human gastric cancer. Clin Cancer Res 2000;6:135-8.

5. Steinbach G, Lynch PM, Phillips RK, Wallace MH, Hawk E, Gordon GB, et al. The effect of celecoxib, a cyclooxygenase-2 inhibitor, in familial adenomatous polyposis. N Engl J Med 2000;342:1946-52.

6. Roh JL, Sung MW, Park SW, Heo DS, Lee DW, Kim KH. Celecoxib can prevent tumor growth and distant metastasis in postoperative setting. Cancer Res 2004;64:3230-5.

7. Muller-Decker K, Hirschner W, Marks F, Furstenberger G. The effects of cyclooxygenase isozyme inhibition on incisional wound healing in mouse skin. J Invest Dermatol 2002;119:1189-95.

8. Blomme EA, Chinn KS, Hardy MM, Casler JJ, Kim SH, Opsahl AC, et al. Selective cyclooxygenase-2 inhibition does not affect the healing of cutaneous full-thickness incisional wounds in SKH-1 mice. Br J Dermatol 2003;148:211-23.

9. Wilgus TA, Vodovotz Y, Vittadini E, Clubbs EA, Oberyszyn TM. Reduction of scar formation in full-thickness wounds with topical celecoxib treatment. Wound Repair Regen 2003;11:25-34.

10. Futagami A, Ishizaki M, Fukuda Y, Kawana S, Yamanaka N. Wound healing involves induction of cyclooxygenase-2 expression in rat skin. Lab Invest 2002;82:1503-13.

11. Williams CS, Watson AJ, Sheng H, Helou R, Shao J, DuBois RN. Celecoxib prevents tumor growth in vivo without toxicity to normal gut: Lack of correlation between in vitro and in vivo models. Cancer Res 2000;60:6045-51.

12. Wei D, Wang L, He Y, Xiong HQ, Abbruzzese JL, Xie K. Celecoxib inhibits vascular endothelial growth factor expression in and reduces angiogenesis and metastasis of human pancreatic cancer via suppression of Sp1 transcription factor activity. Cancer Res 2004;64:2030-8.

13. Wang Z, Fuentes CF, Shapshay SM. Antiangiogenic and chemopreventive activities of celecoxib in oral carcinoma cell. Laryngoscope 2002;112:839-43.

14. Jones MK, Wang H, Peskar BM, Levin E, Itani RM, Sarfeh IJ, et al. Inhibition of angiogenesis by nonsteroidal anti-inflammatory drugs: Insight into mechanisms and implications for cancer growth and ulcer healing. Nat Med 1999;5:1418-23.

15. Simon LS. COX-2 inhibitors. Are they nonsteroidal anti-inflammatory drugs with a better safety profile? Gastroenterol Clin North Am 2001;30:1011-25.