교신저자：이상학, 136-705 서울 성북구 안암동 5가 126-1  고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
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서     론

   코점막의 상피는 점액으로 덮혀있으며, 상피세포로부터 돌출된 섬모의 끝이 점액층과 접촉되어 있다. 따라서 외부대기로부터 유입된 이물질이 코점막에 부착되면 점액층, 수액층 그리고 섬모가 조화를 이루어 점액을 비인강으로 운반함으로써 코점막을 방어하는 기능을 하고 있다. 비루의 양과 구성성분에 따라 점액섬모수송기능이 변화하며, 코점막 상피를 통한 전해질의 이동이 비루의 양과 구성성분을 조절하고 있다.¹⁾²⁾ 정상 코점막의 상피보다 비용조직의 상피에서 이온의 수송이 더 빠른 속도로 일어나기 때문에 상피를 통한 수분흡수가 증가되어 비용이 발생할 수 있다고 제시되고 있다.³⁾⁴⁾
   Na+：HCO3-cotransporter(이하 NBC)는 세포내 pH 유지와 Na+ , H+ , Cl-, 그리고 HCO3- 농도 유지에 중요한 역할을 하는 수송단백질로 두 가지(kNBC, pNBC)아형이 밝혀져 있으며, K+：Cl- cotransporter(이하 KCC)는 cation-chloride cotransporter 일종으로 K+과 Cl-을 세포 외로 배출하여 세포부피와 염분재흡수에 관여하며 네 가지 아형이 밝혀져 있다.⁵⁾⁶⁾⁷⁾
   이와같은 cotransporter의 생리적인 기능을 고려하여 볼 때 코점막의 상피세포를 통한 전해질의 이동에도 관련될 수 있다고 생각되나 현재까지 인체 코점막에 있어서 다양한 아형들의 발현여부와 그들의 생리 및 병리학적 역할은 알려져 있지 않다. 또한 비용에서 일부 이온수송인자들의 발현 및 작용에서 일부 장애가 있다고 보고되어 있어⁸⁾ NBC와 KCC 이온수송인자의 발현 및 그 분포에도 차이가 있을 것으로 생각된다. 따라서 이 연구에서는 인체 비점막과 비용조직을 이용하여 NBC와 KCC mRNA의 아형들에 대한 발현과 분포를 RT-PCR과 in situ hybridization을 이용하여 분석하고자 하였다.

재료 및 방법

조직 채취
   융비성형술을 시행받은 환자(10명)에서 수술 시 정상 하비갑개 조직을 채취하였으며, 조직채취 당시에 환자는 비점막감염이나 알레르기 및 흡연의 과거력, 기타 다른 질환에 대한 약물치료의 병력은 없었다. 또한 비경 및 내시경검사 상 비강내에 해부학적 이상소견이나 점막손상 등의 증후가 없었다. 비용은 만성 비용성 부비동염으로 내시경하 부비동 수술을 시행받은 환자(10명)에게서 수술 중에 채취하였으며, 비알레르기나 천식, 아스피린 과민성 등의 병력이 없는 환자로부터 내시경하 사골동 절제술을 시행하기 전에 중비도에 위치한 비용을 채취하였다. 채취한 모든 조직 표본은 두 부분으로 나누어 한 부분은 액체질소로 냉동시킨 후 총 RNA추출을 위해 -70℃에 보관하고, 다른 한 부분은 in situ hybridization을 시행하기 위하여 4% 파라포름 알데히드에 고정시킨 후 30% 수크로오스로 수세하고 0.1M phosphate buffered saline(pH7.2)에 포매하였다.

RNA분리와 역전사 중합효소 연쇄반응
   냉동된 조직(50~100 mg) 1 ml의 Trizol 시약(GIBCOBRL, Grand Island, NY)에서 균질화시킨 후, 총 RNA를 추출하였다. 그리고 각각의 표본으로부터 얻어진 총 RNA를 1^st strand synthesis buffer 4 μl, 0.1M DTT 2 μl, 10 nM dNTP 1 μl씩 넣은 master mix 7 μl에 넣고 혼합한 후 각각 1 μl의 M-MLV 역전사 효소(GIBCOBRL, Grand Island, NY)에 넣고 42℃에서 50분 간 역전사시켰다. 1 μl의 cDNA를 39.6 μl의 증류수에 넣은 후 Taq DNA polymerase 0.5 μl와 각각의 시발체(primer) 1 μl 씩을 넣고 중합효소연쇄반응 혼합물에서 증폭시켰다. RNA 통합성과 역전사반응의 적합성 여부를 확인하기위해 glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) 전사물의 중합효소연쇄반응 발현을 관찰하였다. 음성대조군으로는 각 표본에서 cDNA 합성시 역전사효소를 뺀 것을 이용하였고 양성대조군으로는 인체의 뇌조직과 췌장으로부터 추출한 cDNA(Clontech Lab, California)를 사용하였다. 이 실험에서 사용된 각 NBC와 KCC 유전자군과 GADPH 시발체의 염기서열은 Table 1과 같다. 증폭된 중합효소연쇄반응 산물을 2% agarose gel에서 분리시킨 다음 ethidium bromide로 염색하여 관찰하였으며, 각 중합효소연쇄반응 산물의 특이성은 예견된 크기와 DNA염기서열에 따라 확인하였다.

In situ hybridization
   Riboprobe 제작을 위해 NBC1과 KCC1 그리고, KCC4의 증폭된 PCR 생성물을 pCR II-TOPO Cloning vector(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)에 subclone 시킨 후 정제된 플라스미드를 HindIII(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)와 T7 polymerase promoter를 이용하여 in vitro transcription하여 antisense probe를 제작하였고 동일한 플라스미드를 Not I와 SP6 promoter를 이용하여 sense probe를 제작하였다. 전사반응은 DIG RNA labeling kit(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)를 이용하여 시행하였다.
   DEPC로 처리된 poly-L-lysine용액으로 유리 슬라이드에 코팅시켜 3시간 동안 건조 후 14 μm의 냉동조직절편을 부착시키고, DEPC-treated PBS로 세척 후 1 μl/ml RNase-free proteinase K로 37℃에서 30분간 처리한 후 4% 파라포름 알데히드로 4℃에서 15분간 고정하고 PBS로 세척한 뒤 0.2N HCl로 10분간 처리하였다. 0.1M TEA buffer(pH 8.0)가 들어있는 0.25% acetic anhydride로 실온에서 5분간 2회에 걸쳐서 배양하고 prehybridization buffer로 30분간 처리하였다. 정제된 probe들은 1×Denhart’s solution, 40% deionized formamide, 0.5 M NaCl, 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA, 1 mg/ml yeast tRNA, 100 μg/ml denatured salmon sperm DNA, 10 mM sodium phosphate, 10% dextran sulphate, and 0.1 M dithiothreitol이 포함된 hybridization 용액에 1：100의 비율로 희석하고 조직슬라이드들을 가습장치에서 16시간 동안 37℃에서 hybridization하였다. RNase control section들은 hybridization 단계 전에 37℃에서 1시간 동안 ml 당 20 μg RNase A로 처리하고, hybridization 이후 조직절편들은 42℃에서 2×SSC와 1×SSC로 세척하고 buffer 1으로 세척 후 non-fat, non-sugar purified dry milk가 포함된 buffer 1을 blocking solution으로 사용하여 60분동안 실온에서 처리하였다. 다시 buffer 1으로 세척 후 1.5μl/ml를 섞은 anti-Dig solution을 1：100으로 희석하여 30분 동안 배양한 후 buffer 1과 2 용액으로 다시 세척하였다. 45 μl NBT, 35 μl BCIP, 1 mM levamisole이 포함된 color solution을 이용하여 hybridization된 세포들의 염색을 시행한 후 암실에서 반응시켰다.

실험결과

NBC mRNA
   NBC의 두 가지 아형 중 하비갑개점막과 비용 모두에서 인체 kNBC mRNA가 존재하였으며, kNBC mRNA에 해당하는 180 bp 크기의 중합효소연쇄반응 산물을 관찰할 수 있었다(Fig. 1). cDNA합성 과정에서 역전사 효소 없이 시행한 음성대조반응에서는 band가 나타나지 않았으며, 이는 RNA표본에서 유전자 DNA에 의한 오염이 없었다는 것을 의미한다. 그러나 pNBC mRNA는 모든 조직 표본에서 나타나지 않았다. kNBC mRNA는 하비갑개점막에서는 상피세포 및 점막하분비선에서 발현되었고, 비용에서도 역시 상피층과 점막하분비선에서 발현되었다(Fig. 2).

KCC mRNA
   KCC는 네 가지 아형 중 KCC1 및 KCC4 mRNA가 존재하였다. Fig. 1에서 나타나 듯이 KCC1은 421 bp에서, KCC4는 783 bp에서 하비갑개점막과 비용 모두에서 발현되었다. 하비갑개 점막에서 KCC1과 4 mRNA는 점막하분비선 및 상피세포에서 발현되었으나, 비용에서는 상피세포에서만 발현되었다(Figs. 3 and 4).

고     찰

   현재까지 코점막에는 다양한 수분 및 이온수송체가 존재한다는 것이 알려져 왔다. 따라서 인체 코점막에서 NBC와 KCC mRNA가 발현될 수 있다고 생각되었다. 이 연구는 처음으로 이들 수송체의 유전자들이 인체의 코점막과 비용조직에서 발현된다는 것을 제시하였는데, NBC 유전자군 중 kNBC mRNA가 정상 코점막뿐 아니라 비용에도 존재하는 반면에, pNBC 유전자는 어떤 표본에서도 검출되지 않았다. 그리고 KCC 유전자군 중 KCC1과 4 mRNA는 정상 코점막과 비용점막에서 발현된 반면 KCC2와 3 mRNA는 어떤 표본에서도 검출되지 않았다.
   일반적으로 코점막에서는 Na+ 흡수와 Cl- 분비가 상피세포를 통한 중요한 이온수송이라고 제시되어 왔지만, 여러가지 상피세포, 즉, 코점막의 분비선, 기관지 점막, 그리고 clara cell에서 HCO3- 이온을 역시 분비한다고 알려져 있다.^9)10)11) 또한 CFTR과 같은 Cl- channel을 통하여 HCO3-이온이 분비되며, cystic fibrosis에서는 수분과 Cl-, HCO3- 이온이동 등에 장애가 발생한다.¹²⁾¹³⁾ HCO3- 이온의 이동을 조절하는 수송체에는 NBC와 AE(anion exchanger) 가 현재까지 알려져 있다. NBC는 신장의 proximal tubule에서 처음 발현된다고 보고된 이래 뇌, 간, 각막, 심장 그리고 폐에서도 발현되는 것이 알려져 있으며, 상피세포가 없는 장기에서도 Na+와 HCO3- 이온의 이동에 중요한 역할을 한다는 것이 제시되고 있다. 이중 NBC는 췌장의 도관이나 신장의 세뇨관에서 HCO3- 이온의 흡수를 조절하는 역할을 하는데 전자는 pNBC라 하고 후자는 kNBC라 한다.⁶⁾¹⁴⁾ 이 연구에서는 이 두 가지 아형의 NBC mRNA의 발현 양상을 관찰한 결과, kNBC mRNA가 정상 코점막 및 비용조직에서 발현되었으며 특히 상피세포층과 점막하 분비선에서 발현되었다. 따라서 인체의 비점막에서 HCO3- 이온의 이동에 관여하는 것이 kNBC이라고 생각된다.
   상피세포를 통한 Cl- 이온의 능동적인 이동 후에 Na+와 수분의 이동이 발생하면서 폐에서 점조도가 낮은 점액의 형성을 이루며 폐에서 무균적이고 생리적인 환경을 유지한다고 알려져 있다. Cl- 이온의 이동능력이 감소하면 점액의 점조도가 증가하며 따라서 호흡기 질환이 발생한다고 알려져 있다. 그러나 현재까지 코점막에서 수분과 이온수송을 조절하는 transporter에 대한 연구는 Na+와 Cl- 이온에 대한 것만 이루어져있다. KCC는 세포막을 통하여 K+와 Cl- 이온의 이동을 조절하는 세포막 단백이며 세포부피를 조절하는 기능을 가지고 있다. 현재까지 네 가지 아형의 mRNA가 여러가지 조직에서 존재하는 것이 밝혀져 있는데 KCC1 아형은 house-keeping의 형태로 존재하며 세포부피를 조절하는 기능을 한다고 제시되고 있다. KCC2 아형은 신경세포에서 발현되며, KCC3 아형은 신장, 근육세포, 심장 그리고 뇌세포에서 발현된다. KCC4 아형은 근육, 심장 그리고 신장에서 발현된다.^15)16)17)18) 이 연구 결과 KCC1과 4 아형이 인체의 코점막과 비용조직에서 발현되었으며 발현양상의 차이는 두 조직 사이에서 관찰되지 않았다. 따라서 KCC1과 4 아형이 인체의 코점막에서 Cl- 이온의 이동을 조절하는 하나의 transporter로서의 기능을 할 수 있다고 생각된다. 그러나 실제적으로 이러한 transporter가 인체의 코점막에서 어떠한 생리적인 역할을 하는지는 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각되나 실제적으로 호흡기의 상피세포는 삼투압을 증가시키면 상피세포부피가 감소하며 삼투압을 감소시키면 상피세포부피가 증가한다고 보고하고 있다.¹⁹⁾ 또한 증류수를 흡입하면 호흡기액의 삼투압이 갑자기 감소하며 상피세포 내로 수분의 이동이 일어나고 부피가 증가한 상피세포 내의 수분은 이러한 세포막에 존재하는 transporter 단백에 의하여 이온의 세포 내 이동이 일어나 삼투압이 조절된다고 보고하고 있어²⁰⁾ 코점막에서도 같은 역할을 할 수 있다고 생각된다.
   위의 실험 결과들을 종합하여 볼 때 인체의 코점막에서 상피세포나 점막하분비선에서 KCC, NBC 수송체가 발현되었으며, 비용조직에서 발현 양상의 차이가 없어 실제적으로 비용조직의 형성이나 점막하분비선의 분비기능에 영향을 줄 수 있는지를 관찰할 수 가 없었다.

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