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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 47(8); 2004 > Article
Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 2004;47(8): 725-729.
Expression of Hypoxia-Inducible Factor in the Inner Ear of Noise-Exposed Mouse.
Jung Eun Shin, Hun Hee Kang, Jong Woo Chung
1Department of Otolaryngology of Pundang Jesaeng General Hospital, Bundang, Korea.
2Department of Otolaryngology, Asan Medical Center University of Ulsan College of Medicine, Seoul, Korea. jwchung@amc.seoul.kr
3Asan Institute of Life Science, Seoul, Korea.
흰쥐에서 소음자극 후 Hypoxia-Inducible Factor의 내이내의 발현
신정은1 · 강훈희2,3 · 정종우4
분당제생병원 이비인후과1;울산대학교 의과대학 이비인후과학교실2;아산생명과학연구소3;울산대학교 의과대학 서울아산병원 이비인후과학교실4;
주제어: 소음성 난청청각역치허혈.
ABSTRACT
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Investigations regarding the mechanisms of noise-induced hearing loss have suggested that noise exposure induces tissue ischemia, and damages the inner ear. The hypoxia-inducible factor (HIF), a helix-loop-helix PAS transcription factor, is known to prevent hypoxic cell damage in the brain in cases of ischemic attacks. Like the role it plays in the brain, there is a possibility that HIF could be found in the inner ear playing the similar role.
MATERIALS AND METHOD:
We used 23 (46 ears) BALB/c mice with normal Preyer's reflex to investigate the effect of the noise-induced hearing loss. Hearing threshold was measured by ABR before and after exposing mice to 120 dB SPL broad band white noise 3 hours daily for 5 consecutive days. And after 1 month, the hearing threshold was rechecked to assure the permanent threshold shift. Cochlea were collected for the histological study and the expression of HIF was observed.
RESULTS:
Control mice showed hearing level of 27.5+/-1.7 dB (mean+/-SD), which was changed to 80.5+/-2.1 dB immediately after 5-day of exposure to noise, and 79.5+/- 2.5 dB after 1 month of noise exposure. For all noise exposed mice, the damage to the outer hair cell and the Organ of Corti was noticeable. HIF was expressed in the spiral limbus, few supporting cells, stria vascularis and spiral ganglion cells of the noise exposed mouse.
CONCLUSION:
Noise, a form of acoustic trauma to the inner ear, induced damage to the outer hair cells in mice. At the same time, HIF were expressed in all of the studied animals. The possibility of HIF playing a role of protecting the inner ear from the acoustic trauma as it does in the brain should be investigated further.
Keywords: Noise-induced hearing lossAuditory thresholdIschemia

교신저자:정종우, 138-736 서울 송파구 풍납동 388-1  울산대학교 의과대학 서울아산병원 이비인후과학교실
              전화:(02) 3010-3710 · 전송:(02) 489-2773 · E-mail:jwchung@amc.seoul.kr

서     론


  
소음성난청은 사회가 점점 산업화, 고령화되면서 증가하는 질환으로 현재까지 예방이외에는 뚜렷한 대처방법이 제시되지 않은 질환이다. 이는 산업장에서의 생산성을 떨어뜨리고 경제에 영향을 미치기도 한다.
   소음이 내이를 파괴시키는 기전은 크게 2가지로 나누어 지는데, 물리적인 손상과 대사성 손상이다. 비정상적인 큰 음자극은 내이의 비정상적인 물리적인 변화를 초래하며1) 이는 세포의 괴사나 apoptosis(programmed cell death) 등의 세포구조의 파괴를 초래한다.2) 조직 소견을 보면 외유모세포의 파괴가 뚜렷하고 그 후 내유모세포의 파괴가 이어진다.3) 일정 이상의 소음에 지속적으로 노출된다면 결국에는 청신경의 변화가 일어나 회복 불가능한 청력 감퇴가 일어난다. 다른 한편으로는 대사기전의 과다한 자극으로 말미암아 세포의 생화학적인 시스템의 손상을 초래하며 이는 역시 세포의 괴사나 apoptosis를 일으킨다. 여기에 대표적으로 작용하는 것이 활성 산소유리기(reactive oxygen species, ROS)이다.4)
   소음자극에 의하여 ROS가 증가하고 이를 통한 lipid peroxidation이 촉진되며 세포내의 대사산물인 isoprostane이 축적되는 것이 보고되었고, glutathione이나 항산화제의 전처치에 의하여 소음성 난청이 완화되는 결과들이 보고되고 있다.5)6) 이러한 ROS의 downstream pathway는 여러 가지의 전사인자(transcription factor)의 활성화를 포함하는데, 여기에는 주로 stress-induced apoptotic factor들이 포함된다. 일례로 소음에 의하여 activating protein-1(AP-1)이 증가되고 이는 DNA에 결합하여 cAMP response element binding protein(CREB)의 인산화를 총하여 apoptotic pathway를 진행시키는 것으로 보고되었다.7)
   산소가 과다하게 증가하여 발생하는 이러한 기전과는 대조적으로 소음에 의하여 조직내에 저산소증, 허혈이 유발된다는 보고들이 있다.8)9) 이러한 경우에도 역시 조직의 기능이 떨어지고 심하면 구조적인 변화가 초래된다. 
   HIF는 helix-loop-helix PAS transcription factor로서 저산소 상태에서 활성화되는 heterodimeric transcription factor이다. 뇌에서는 허혈성손상때 발현되어 ROS 등에 의한 손상을 예방하는 효과가 있는 것으로 보고되고 있다.10)11) 그러므로 소음성 난청때 이 인자의 발현이 내이를 보호하는 작용을 할 가능성이 크다고 예측할 수 있으므로 이에 대한 연구를 시행하였다. 

재료 및 방법

재  료

실험 동물
  
실험 동물로는 정상적인 Preyer's reflex를 보이고, 청성뇌간반응(ABR)에서 정상 청력을 보인 4주령 BALB/c mouse와 8주령 BALB/c mouse를 바이오 제노믹스에서 구입하여 사용하였다. 

실험 용액
  
사용한 항체는 항-HIF-1α 항체(Neo Markers, Fremont, CA,USA)로 4℃에 보관 사용하였다. 면역염색은 ABC kit (Vector, Bulingame, CA,USA)를 이용하여 사용하였다. Hamatoxylin, eosin, EDTA(Sigma, St Louise, Missouri, USA)를 염색 과정에서 사용하였다. 위 시약들은 모두 실온에 보관하였다. 

실험 기기 
   소음을 주기위해 외부소음과 차단도 되고 방음이 가능한 방음실(noise booth)을 제작하여 사용하였다. 각각 8Ω의 input과 output을 가지는 speaker(290-8L, ALTEC LANSING, Oklahoma city, Oklahoma, USA)와 amplifier (R-399, INTER M, Seoul, Korea)를 직접 연결하여 사용하였다. Amplifier를 방음실의 좌측코너에 위치시킨 후 그 위에 speaker를 설치한 다음 horn이 45°로 놓이게 하였다. Speaker는 300
~10,000 Hz의 rated power bandwith를 가지며 120 watts의 continouse power capacity가 가능하다. Amplifier는 스테레오 앰프를 보다 강력한 모노 사운드로 사용하기 위하여, 후면에 부착된 mode 스위치로 선택할 수 있는 bridged mono 기능이 설계되어 있으며 과전류와 과열로부터 기기를 안전하게 보호하기 위한 회로가 내장되어 있다. 조직 탈수, 투명, 침투 과정을 처리하기 위해 사용한 자동화 침투 기기는 CITEL 2000(Thermo Shandon Co., Waltham, MA, USA)을 사용하였다

방  법

실험동물의 마취
  
실험 동물의 마취는 ketamine hydrochloride(30 mg/kg)와 xylazine(2 mg/kg)을 근육 주사하였으며, 필요시 상기 용량의 반을 추가로 주사하였다.

청력역치의 측정
   ABR은 Traveler Express(Biologic Systems Co., Mundelein, IN, USA)를 사용하여 검사하였다. 자극음은 초당 13회의 교대상 click을 90 dB HL의 강도부터 10 dB씩 낮추면서 측정하였고, 파형이 불분명하게 나오는 음의 강도에 도달하면 5 dB씩 조절하면서 청력 역치를 측정하였다. 청력역치는 wave Ⅰ를 기준으로 측정하였다. 클릭음의 frequency filter setting은 100∼3000 Hz로 하였고, 총 자극음의 횟수는 1024회로 하였다. 

소음성 난청의 유발
  
모든 흰쥐를 120dB SPL의 광대역 백색 잡음(broad band white noise)에 하루에 3시간씩 지속적으로 5일간 노출시켰다. 소음은 Cool Edit 1.52소프트웨어를 이용하여 컴퓨터를 통해 발생하였으며 방음실내에 발생되는 소음을 방음실의 중앙부와 각각의 모서리에서 sound level meter (B & K, Dæum, Denmark)로 측정하여 모두 120 dB SPL 이상임을 확인하였다. 또한 어떤 한 마리의 흰쥐에게만 집중적으로 소음에 노출되는 것을 피하기 위해 임의로 흰쥐들을 두 그룹으로 나누어 배치 시킨 후 매일 무작위로 순환시켰다.

소음에 의한 청력역치의 변화 측정
  
실험을 시작하기 전에 ABR로 청력역치를 측정하여 정상청력을 보이는 흰쥐들만을 대상으로 하였다. 120 dB SPL의 광대역 백색잡음에 하루에 3시간씩 지속적으로 5일간 노출시킨 후 청력을 바로 측정하여 청력감소를 확인하였다. 그 후 1달 후에 다시 청력을 측정하여 소음 노출 직후의 청력 감소가 영구적인 청력소실임을 확인 하였다. 대조군으로는 소음만 없는 상태에서 하루에 3시간씩 방음실안에 5일동안 두었던 흰쥐를 사용하였다.

조  직 
   청력소실이 확인된 흰쥐와 대조군에서 분리해낸 와우를 formalin과 glutaraldehyde 고정용액(4% formalin, 1% glutaraldehyde, 0.1 M sodium phosphate buffer)에 넣어 48시간 동안 보관하였다. 탈석회화를 위하여 phosphate buffer saline에 넣은 5.5% EDTA에 7일간 보관 후 자동 침투기를 이용해 탈수, 투명, 침투 과정을 거친 후 파라핀으로 포매를 시행하였다. 조직절편은 modiolus를 축으로 5μm씩 박절 하였고, hematoxyline & eosin 염색과 면역염색을 시행하였다.

통계 처리
  
결과값은 평균±표준편차로 표시하였고, 통계학적인 분석은 SAS version 6.12(SAS Institute Inc., USA)를 사용하였으며, 대조군과 실험군 사이의 청력차이가 있는지 여부를 보기 위해서 paired t-test를 시행하였다.

결     과

소음에 의한 청력 역치의 변화
  
흰쥐의 소음노출전 청력은 27.2±1.7 dB(n=46 ears)이었고, 5일간 소음 노출 직후 청력은 80.5±2.1 dB이었다. 소음에 노출 된 지 한 달 후의 청력은 79.5±2.5 dB이었고, 통계적인 의미가 있을 정도의 청력호전을 보인 경우는 없었다.

소음에 의한 조직학적 변화
  
소음에 노출된 흰쥐의 와우에서 hematoxyline과 eosin 염색결과를 보면 청력 호전을 보였던 흰쥐 3마리(6개의 와우)를 제외한 나머지 와우(n=40)에서는 외유모세포의 소실을 볼 수 있었으며 이 중 5개의 와우(12%)에서는 외유모세포와 지지세포들의 손상 및 위축으로 Space of Nuel이 넓어져 보이는 소견을 함께 관찰할 수 있었다(Fig. 1).
   소음에 노출된 모든 와우에서 공통적으로 볼 수 있었던 것은 spiral limbus 중앙부위의 무세포성(acellularity) 이였다(Fig. 2). 내림프액과 접해있는 부분의 interdental cell들을 제외하고는 모두 소음에 의해 세포의 감소를 보이고 있었다. 혈관조 부위는 정상속소견과 차이가 없었다. 와우신경절세포들의 분포에는 변화가 보이지 않았으며 세포변성(degeneration) 등의 소견은 관찰되지 않았다. 

Hypoxia-inducible factor의 발현
   Hypoxia-inducible factor의 발현은 소음에 노출되었던 모든 흰쥐의 spiral limbus와 혈관조, 와우신경절에서 강하게 발현되었다. 코티기관의 유모세포는 다른 부분에 비하여 약하게 발현되었다(Fig. 3). 소음에 노출되지 않았던 대조군의 경우에는 와우의 어느 곳에서도 발현되는 곳이 없었다.

고     찰

   경한 형태에 있어서의 소음 장해(acoustic trauma)는 외유모세포의 부동모(stereoclia)의 가는 뿌리의 손상으로 생각되어 회복이 가능하다.12) 하지만 소리의 압력이 더욱 강해졌을 때, 부동모가 부러지고 외유모세포에 있는 actin filament의 해축 현상(depolymerization)이 생긴다. 이러한 경우 tip links가 깨지고 신호전달과정(transduction)이 방해 받을 수 있다.13) 본 실험의 경우 midbasal turn의 코티기관을 관찰해 본 결과 외유모세포의 물리적인 손상을 관찰 할 수 있었고 청력소실의 원인인자로 확인되었다. 지속적인 소음 장해는 부동모들을 손상된 채로 방치하게 되고 결국 하나의 거대한 부동모로 엉겨붙어 남게 된다. 생화학적인 변화에 있어 세포체들의 변화는 결국 apoptotic death로 이어지게 되며 주변의 지지 세포들은 유모세포들이 소실된 자리에 성긴 박판(lamina)형태로 채워지게 된다.14) 외유모세포주위의 지지 세포의 손상은 일부에서 찌그러든 Claudius' cells과 Hensen's cells을 관찰함으로써 확인할 수 있었으며 5개의 와우에서는 Space of Nuel이 이에 의해 넓어져 보였다(Fig. 2). 이와 같은 소견은 소음에 의해 내이의 물리적인 손상이 발생하였다는 것을 의미한다.
   코티기관의 spiral limbus의 무세포성(acellularity)은 소음에 노출되었던 모든 와우조직에서 관찰 되었으며 이는 다른 연구자에 의한 결과와 일치한다.15) 본 연구에서는 혈관조의 변화는 관찰할 수 없었으나, 소음에 의하여 세포수의 증가가 관찰되는 경우도 있다.16)17)
   Hypoxia-inducible factor(HIF)는 helix-loop-helix PAS transcription factor로서 뇌에서는 허혈성 손상 때 발현되어 이와 같은 ROS 등에 의한 손상을 예방하는 효과가 있는 것으로 보고되고 있다.10)11) 뇌에서의 기능은 이미 밝혀져 있으나 와우내에서는 어떤 기능을 하는지는 아직 밝혀진 것이 없다. 본 연구에서는 HIF의 발현여부를 밝혀보고자 하였고 결과적으로 소음에 노출되었던 4주령과 8주령의 와우에서도 spiral limbus와 혈관조, 와우신경절세포에서 발현되는 것을 볼 수 있었다. 이는 소음에 의하여 내이내의 저산소증이 광범위하게 발생한다는 것을 의미한다.
   아직까지 HIF의 역할에 대해서는 논란이 많다. 뇌와 유사하게 소음성 난청 때 이 factor의 발현이 내이를 보호하는 작용을 할 가능성이 크다고 예측할 수는 있겠으나 그 기전에 관해서는 확실히 밝혀진 것이 없다. 본 연구의 경우에는 물리적인 손상으로 여겨지는 외유모세포의 손상은 모든 조직에서 관찰되었으나 혈관조에서는 3마리의 경우 매우 짙게 염색되었다. HIF는 같은 와우조직내의 spiral limbus에서도 내림프액과 인접하고 있는 부분에서 더 짙게 발현되는 양상을 보였다. 이와 같이 조직손상이 비교적 심한 코티기관 이외의 부분에서 과발현되는 현상으로 보아 HIF의 발현은 물리적인 손상보다는 세포의 대사와 관계가 높다고 볼 수 있다. 이와 같은 HIF의 발현이 세포의 괴사 또는 apoptosis와 연관된 것인지 아니면 허혈성 뇌질환에서와 같이 세포를 보호하는 역할을 할 수 있는지에 대해서는 앞으로의 연구를 통해 확인하여야 할 문제이다.

결     론

   소음의 노출은 흰쥐의 외유모세포의 소실을 유발함과 동시에 hypoxia-inducible factor의 발현을 증가 시켰다. 소음성 난청때 이 factor의 발현이 내이를 보호하는 작용을 할 가능성에 대하여 지속적인 연구가 필요하다고 할 수 있겠다.


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