교신저자：박성국, 614-735 부산광역시 부산진구 개금동 633-165  인제대학교 의과대학 부산백병원 이비인후-두경부외과학교실
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서     론

   비용은 성장하는 양성 종양으로 비과학 영역의 흔한 질환이나 그 원인과 병인은 아직 많은 부분이 밝혀져 있지 않다. 혈관의 증식은 조직의 정상적인 성장과 발달에 필수적인 과정이다.¹⁾ 정상적인 맥관형성(angiogenesis)은 신체의 복구 기전의 한 부분으로 나타나지만 조절되지 않는 맥관형성은 병적인 과정의 일부분이 될 수 있다.²⁾ 종양의 급속한 성장은 혈관이 공급할 수 있는 산소와 영양소의 양에 따라 제한 받는다. 그러므로 저산소증 상태가 병적 맥관형성에 의해 감소되거나 사라질 때까지 종양의 크기는 직경당 몇 밀리미터 이상을 초과 할 수 없다.³⁾
   저산소증은 혈류의 중단과 허혈증을 유발하는 미세혈관의 파괴를 초래하여 조직 손상을 일으키는 중요한 특징을 가지고 있으나 또한 맥관형성과 같은 조직 재생에 관여하는 과정을 유발한다.³⁾ Hypoxia-inducible factors(HIFs)는 저산소증에 의해 유발되는데 저산소성 환경에서 HIFs의 기능은 vascular endothelial growth facter(VEGF)을 포함한 수십 개의 표적 유전자의 활성을 통해 혈관 항상성의 적절한 적응을 조율한다.⁴⁾ HIF-1은 heterodimeric basic helix-loop-helix-PAS(bHLH-PAS) domain 전사인자로 저산소증에 의해 유발되는 유전자들의 전사 활성에 중요한 역할을 한다.⁵⁾⁶⁾ HIF-1는 HIF-1α와 HIF-1β(aryl hydrocarbone nuclear translocator)로 구성되며⁶⁾ HIF-1α와 HIF-1β 모두 세포 내에서 본질적으로 발현되나 정상 산소 아래에서 HIF-1α은 산재되고 분해된다.⁷⁾ 저산소증에서 HIF-1α의 분해 경로는 차단되어 HIF-1α는 안정화되고 핵내에 전위된다. 그러므로 HIF-1α은 HIF-1의 발현에 중요하며 대부분의 세포에서 측정 할 수 없는 수준의 HIF-1 단백질을 유지 시킨다.⁸⁾
   VEGF은 생리적, 병리적 맥관형성에서 중요한 역할을 한다.⁹⁾¹⁰⁾ 저산소성 환경에서 VEGF는 직접적으로 유도되는 것이 아니라 HIF-1에 의해 상향 조절된다고 알려져 있으나¹¹⁾ HIF-1에 의한 VEGF의 유도는 조직과 임상적 환경에 따라 다르다.⁴⁾ VEGF는 비점막보다 비용에서 많이 발현되며 비용의 성장에 관여한다.¹²⁾¹³⁾
   양성 종양인 비용의 성장에 맥관형성은 중요한 역할을 할 것으로 생각된다. 이에 저자들은 비용을 동반한 만성 부비동염 환자의 비용 조직에서 HIF-1α의 발현과 HIF-1α와 VEGF의 상관관계를 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

재  료
   비용을 동반한 만성 부비동염 환자 중 비알레르기 증상이 없고 Multiple allergen stimulation test(MAST)상 음성, 천식 및 아스피린 과민증의 과거력이 없는 환자 25명을 대상으로 하였다. 이들 모두는 수술 전 최소 1개월간 국소적 또는 전신적 스테로이드, 비스테로이드성 항염증성 약물, 항히스타민제 및 마크로라이드계 항생제를 사용하지 않았다. 연령 분포는 16~60세로 평균 47세였고 남자 14명, 여자 11명이었다. 비용은 부비동 내시경 수술 전에 채취하여 반으로 나눈 후 일부는 eppendorf tube에 넣은 후 액화질소 용기를 이용하여 실험실로 보내져 실험실에서 즉시 RNA를 분리하였으며, 일부는 면역조직화학적 검사를 위해 10% 포르말린에 저장하였다.

방  법

RNA 분리
   채취된 비용 조직 50~100 μg에 TRI reagent(Molecular Research Center, Cincinnati, OH, USA) 1 ml을 가하고 homogenizer(Biospec products, Racine, WI, USA)를 이용하여 미세하게 분쇄한 후, 시약제조회사에서 제공하는 방법에 따라 total RNA를 분리하였다. 분리된 RNA는 80 units/ml의 RNasin(Promega, San Luis Obispo, CA, USA)이 들어있는 핵산분해효소 불포함 정제수에 녹였다. RNA의 농도는 spectrophotometer를 이용하여 260 nm에서 흡광도를 측정함으로써 결정하였고 1% agarose gel에서 전기영동하여 RNA의 손상여부를 확인하였다.

준정량적 역전사-중합효소연쇄반응(Semiquantitative Reverse Transcription(RT)-PCR) 
   Total RNA 1 μg를 역전사(reverse transcription) 반응에 사용하였다. 먼저, RNA에 random hexamer 100 pmoles(Amersham pharmacia biotech, Uppsala, Sweden)를 가하여 70℃에서 3분간 가열한 후, ice로 옮겨 급속히 냉각함으로써 annealing시켰다. 그리고 AMV reverse transcriptase(Promega, San Luis Obispo, CA, USA) 2 units, RNasin(Promega, San Luis Obispo, CA, USA) 4units, 5X 반응버퍼(250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 250 mM KCl, 50 mM MgCl₂, 2.5 mM spermidine, 50 mM DTT) 4μl, 최종 0.2 mM 농도의 dNTP를 가하여 최종부피 20 μl를 맞춘 후 42℃에서 90분간 반응시켰다. 역전사 반응 산물(cDNA)은 사용될 때까지 -20℃에서 보관하였다. 역전사 반응 산물은 HIF-1α 및 VEGF 유전자의 발현을 조사하기 위한 PCR 실험에 사용되었다. 이때, 유전자 발현을 준정량적으로 비교, 분석하기 위해 Ambion사의 QuantumRNA 18S internal standard kit(Classic II)(Ambion Inc., Austin, TX, USA)을 사용하여 duplex PCR을 수행하였다. HIF-1α 유전자를 증폭하기 위해 사용한 primer 쌍은 5'-TGGAC TCTGA TCATC TGACC-3'과 5'-CTCAA GTTGC TGGTC ATCAG-3'이었으며 증폭되는 DNA의 길이는 434 bp이었다(60℃ annealing). VEGF 유전자를 증폭하기 위해 사용한 primer 쌍은 5'-CCTTG CTGCT CTACC TCCAC-3'과 5'-CACCA GGCCC TCGTC ATTGC-3'이었으며 증폭되는 DNA의 길이는 242 bp이었다(60℃ annealing). 이를 근거로 하여, HIF-1α, VEGF 유전자에 대한 PCR을 각각 20, 24 cycles로 수행하였다. 또한, 각 유전자와 18S rRNA의 duplex PCR(co-amplification)에 최적인 18S rRNA primers 대 competimers의 비율을 결정하였고, 이에 따라 HIF-1α의 PCR에는 2대 8, VEGF의 PCR에는 1.5대 8.5의 비율을 적용하였다. PCR은 역전사반응 산물 2 μl를 template로 사용하여 총 부피 20 μl로 수행하였다. Primer는 각 10 pmoles, Taq DNA polymerase(Promega, San Luis Obispo, CA, USA) 1 unit, dNTP는 최종 200 nM 농도로 사용하였다. 반응액을 94℃에서 5분간 pre-denaturation한 후, 94℃에서 30초, 각각의 annealing 온도에서 30초, 72℃에서 30초의 반응을 유전자 별로 정해진 횟수만큼 반복하였다. 최종적으로 72℃에서 5분간 post-extension하였다. 모든 PCR은 PTC-200 Peltier Thermal Cycler(MJ Research, Watertown, MS, USA)를 이용하여 수행하였다. PCR 산물 5 μl를 8% polyacrylamide gel에서 전기영동한 후 ethidium bromide로 염색하였다. 염색된 DNA band의 양은 Gel-Doc 2000 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)과 Quantity One software, version 4.3.1(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 정량하였다. 각각의 시료에서 target 유전자의 발현정도는 target 유전자로부터 증폭된 band의 양을 18S rRNA band의 양으로 나눈 수치로 나타내어 시료 간에 비교하였다.

Tissue microarray 제조 및 면역조직화학염색(Immunohistochemistry)
   생검된 조직을 PBS(43 mM Na₂HPO₄·7H₂O, 1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 14 mM KH₂PO₄)로 10배 희석한 formalin에 담가 24시간 동안 고정한 후 통상적인 과정을 통하여 파라핀 블록을 제조하였다. Manual Tissue Arrayer MTA-1(Beecher Instruments, Sun Prairie, WI, USA)를 이용하여 tissue microarray를 제조하였다. 제조 과정은 각 파라핀 블록으로부터 지름 0.6 mm, 길이 약 3 mm의 원통 모양으로 조직절편을 찍어낸 후 비어있는 새로운 파라핀 블록에 사방 2 mm 간격으로 조직절편을 심었다. 탈파라핀 과정과 재세척 후 10 mM citrate buffer(pH 6.0)에 슬라이드를 넣고 전자레인지에서 10분간 가열하고 PBS에 3% 과산화수소수가 섞인 용액에 10분간 처리하였다. DAKO LSAB^® System Blocking Solution(DAKO Corp., Caripinteria, CA, USA)을 가하여 실온에서 30분간 반응시킨 후 조직 절편들은 Antibody Diluent(DAKO Corp., Caripinteria, CA, USA)에 1：200 희석된 mouse anti-HIF-1α monoclonal antibody(Novus-Biologicals, Gilbert, AZ, USA) 또는 1：500 희석된 rabbit anti-VEGF polyclonal antibody(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)에 14℃에서 overnight 반응시켰다. 조직들은 hematoxylin(Muto Pure Chemicals, Tokyo, Japan)으로 counterstaining하였다. 각 단백질의 발현은, 발현의 분포(전체 세포 중 특정 단백질을 발현하는 세포의 비율)를 0, 1(<25%), 2(25~50%), 3(>50%)으로 판정하고, 발현의 강도를 1(정상상피세포와 비교하여 발현 강도가 유사하거나 낮은 경우), 2(약간 높은 경우), 3(매우 높은 경우)으로 판정한 후, 분포와 강도를 곱한 값(9점 만점)으로 평가하였다.

통계학적 처리
   통계학적 검증은 SAS(release 8.1) 통계 패키지를 이용하여 Wilcoxon rank sum test를 시행하였으며 상관관계를 알아보기 위해 피어슨 상관계수를 구하여 상관관계를 알아보는 상관분석을 시행하였다. 결과는 평균±표준편차로 표시하였고 통계학적인 유의성은 p값이 0.05미만인 경우로 하였다.

결     과

HIF-1α와 VEGF mRNA의 발현
   18S rRNA에 대한 RT-PCR product의 예상 크기는 324 bp, HIF-1α는 434 bp, VEGF는 242 bp이며 RT-PCR 결과 예상하였던 PCR product의 크기를 확인 할 수 있었다. 모든 조직에서 18S rRNA은 PCR에 양성이었고 HIF-1α와 VEGF도 모두 비용 조직에서 발현되었다(Fig. 1). RT-PCR에서 HIF-1α 발현의 평균은 1.12±0.33이고, VEGF 발현의 평균은 1.11±0.41이었다. HIF-1α와 VEGF mRNA 발현의 상관관계는 HIF-1α mRNA가 증가함에 따라 VEGF mRNA가 증가하는 유의한 상관관계를 보였다(correlation coefficient [r]=0.49, p<0.05, Fig. 2).

HIF-1α와 VEGF의 면역 조직화학 검사
   모든 비용 조직에서 HIF-1α은 대부분 혈관 내피세포, 염증세포, 점막하 선세포 및 표면 상피세포의 핵에서 발현 되었으나 가끔씩 세포질에서 발현되었고(Fig. 3), VEGF는 표면 상피세포 보다 혈관 내피세포, 염증세포, 선 상피세포에서 강하게 발현되었으며 핵과 세포질 모두에서 발현되었다(Fig. 4). HIF-1α의 단백질의 발현은 3.24±1.80이고, VEGF의 단백질 발현은 3.52±1.89이었다. HIF-1α와 VEGF 단백질 발현의 상관관계는 HIF-1α 단백질이 증가함에 따라 VEGF 단백질이 증가하는 유의한 상관관계를 보였다(r=0.76, p<0.05, Fig. 2).

고     찰

   미생물에서 인간까지 모든 유기체는 생존을 위해 필수적인 산소 항상성을 유지하는 기전을 가지고 있다.⁸⁾ 고농도 산소증은 반응적 산소 유리물 생성을 초래하고 세포막과 DNA에 치명적인 손상을 일으킬 수 있는 반면¹⁴⁾ 저산소증은 근본적인 세포 기능을 유지하기 위한 충분한 ATP 생성 실패를 가져 올 수 있다.⁸⁾ 저산소증은 내피세포 성장 조절의 발현을 조절함으로 내피세포의 분열유발 능력을 바꿀 수 있으며⁴⁾ 혈관생성 자극 외에 세포 성장과 혈관 재형성을 바꿀 수 있는 항분열유발 요인들(nitirc oxide, prostacyclin)의 방출을 억제한다.¹⁵⁾ 감염, 화상 또는 화학적 독소에 노출 후 세포 손상은 성공적인 복구를 위한 잘 발달된 염증 반응을 필요로 한다. 즉, 저산소증 또는 허혈증 후에 내피세포에 의한 염증은 적응을 위한 생리적인 기전으로 제공될 수 있다. 그러나 저산소성 또는 허혈성 노출이 너무 심하고 오랜 기간 지속된다면 염증 단계의 이상 조절과 증폭을 야기할 뿐만 아니라 내피세포 자체에 직접적으로 비가역적인 변화를 일으킨다.¹⁶⁾ 저산소증은 항응고 능력을 감소시키고 투과성과 백혈구 침착을 증가시키고 혈관내피에 전염증기적 특징을 나타내게 하는 환경으로 내피세포의 표현형을 이동시킨다.⁴⁾ 일반적으로 세포는 유전자 발현을 변화시킴으로써 저산소증에 반응한다. Activation protein-1, early growth response protein 1, nuclear factor kappa B 및 HIFs 같은 전사인자들은 저산소증에 의해 유발된 유전자 발현을 조율한다.⁴⁾ HIF-1은 초기 저산소증시 과발현되는 초기 유전자 산물 중의 하나로 저산소증 반응에서 중요한 역할을 한다.⁸⁾ 최근 들어 HIF-1의 비저산소성 안정은 성장 인자와 사이토카인들의 반응에서 관찰되고 또한 종양에서도 관찰되어 종양형성과 염증에서 HIF-1의 더 많은 역할이 제안 되고 있다.¹⁷⁾¹⁸⁾
   혈관 재형성에 많은 인자들이 관여할지라도 그 중에서 내피세포의 전부종성 혈관형성 능력을 나타내는 VEGF는 중요한 역할을 한다.¹³⁾ VEGF는 내피 세포 증식을 유도하고 혈관 투과성을 증가시킴으로 상처 회복, 종양 성장 및 만성 염증에 관련된다.¹⁹⁾ VEGF는 독립적으로 내피세포의 증식과 이동을 자극하고, 고사에 대해 내피세포를 방어 할 수 있으며, 순환하는 내피 전구세포의 혈관 집합 장소로의 이동을 증진시킬 수 있다.²⁰⁾ VEGF는 비용에서 비점막 보다 더 강하게 발현되고 국소적 맥관형성과 혈장 유출을 동반한 혈관 재형성은 비용종의 성장 과정에 중요한 역할을 한다.¹²⁾¹³⁾ 또한 VEGF는 미세혈관 투과성을 증가시킬 수 있어 비용에서 자주 관찰되는 부종에 기여하며 더욱이 증가된 미세혈관 투과성은 세포 외 기질의 축적에 참여하는 혈장 단백질의 혈관 외 유출을 유도하여 비용의 성장에 기여한다.¹²⁾
   저자들의 연구에서 HIF-1α와 VEGF의 mRNA와 단백질은 비용조직들에서 발현되었다. HIF-1α 단백질은 대부분 혈관 내피세포, 염증세포, 점막하 선세포 및 표면 상피세포의 핵에서 발현 되었으나 가끔씩 세포질에서 발현되었고, VEGF 단백질은 표면 상피세포 보다 혈관 내피세포, 염증세포, 선 상피세포에서 강하게 발현되었으며 핵과 세포질 모두에서 발현되었다. HIF-1α와 VEGF mRNA 발현의 상관관계는 r=0.49였고, HIF-1α와 VEGF 단백질 발현의 상관관계는 r=0.76으로 HIF-1α의 mRNA와 단백질이 증가함에 따라 VEGF의 mRNA와 단백질도 증가하는 유의한 상관관계를 보였다.

결     론

   비용의 성장에 중요한 역할을 하는 VEGF를 전사인자인 HIF-1α가 유도하며 저산소증은 비용의 성장에 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.

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