교신저자：이병주, 602-739 부산광역시 서구 아미동 1가  부산대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   진핵 세포의 염색체 말단은 telomere라고 하는 특수한 구조에 의하여 말단의 염색체가 분해 되는 것을 막아 염색체의 안정성을 좋게 하고 염색체의 복제 및 재결함을 방지하는 중요한 역할을 한다. Telomerase는 유척추 동물에서 TTAGGG의 반복되는 염기서열을 추가함으로서 염색체 말단을 안정화 시키고 유지하는데 중요한 역할을 한다고 믿어지고 있다.¹⁾ telomere의 길이는 세포가 분열될 때마다 길이가 약 50~20 뉴클레오티드씩 소실되어 짧아지며 세포 분열 횟수가 거듭될수록 길이가 짧아지고 점차 염색체가 불안정하게 되며 노화하여 죽게 된다. 이것은 일정한 횟수의 세포분열 후에 성장을 멈추게 하는 세포분열을 조절하는 시계(mitotic clock)와 연관성이 있다고 알려져 있다.²⁾³⁾ 따라서 체세포분열 위기(mitotic crisis)를 탈출한 변형된 세포들은 telomere를 복제할 수 있는 핵단백복합체인 telomerase의 활성화가 필요하다고 생각된다. 이러한 telomerase 활성은 불멸화된 세포와 암세포와 관련된다고 알려져 있다.⁴⁾ 이러한 발견을 바탕으로 하여 telomerase 활성은 암의 진단하는 표식자 및 악성의 진행정도를 알 수 있는 예후 인자로 연구되고 있다. 또한 telomerase를 억제하는 것은 암 치료에 있어서 새로운 접근방법일 수 있다고 기대 된다.⁵⁾
   하인두암을 비롯한 두경부암에서 주로 사용되는 항암제는 cisplatin과 5-FU이다. 저자들은 하인두암에서 유래한 하인두암세포주(PNUH-12)에서 cisplatin과 5-FU를 처리하여 cisplatin은 P53 의존적 경로에 의한 세포고사를 유발시키고, 5-FU는 P53 의존성과 P21 의존성에 의해 세포정지 시키는 것을 보고하였다.⁶⁾ 이에 저자들은 두경부암세포주에서 telomerase 활성이 검출되는지를 조사하고, cisplatin과 5-FU가 암세포의 발생과 성장과정에 중요한 telomerase 활성에 어떠한 영향을 주는지 조사하였다.

대상 및 방법

대  상

두경부편평상피세포암 세포주의 배양 
   부산대학교 병원에서 확립한 하인두암세포주 PNUH-12와⁷⁾ 한국세포주은행에서 구입한 후두암세포주 SNU-899,⁸⁾ 인두암 세포주인 HEp-2⁹⁾를 사용하였다. 

약  물
   두경부악성종양에서 항암치료로 널리 사용되고 있는 cisplatin(Dong-A, Pharmaceutical Co., Seoul)와 5-FU(Choongwae Pharmaceutical Co., Seoul)를 사용하였다. 

연구방법

세포독성검사(MTT assay)
   배양된 암세포들을 96 well plate에 well당 2×10⁴개 세포를 심고 하루 동안 배양 후 cisplatin과 5-FU를 농도별로 첨가하고 37℃, 5% CO₂ 대기에서 48시간 배양 후 MTT측정법을 시행하였다.
   10 mg의 MTT 시약(3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]- 2, 5-diphenyltetrazolium bromide；Sigma, St.Louis, MO)을 PBS 1 ml에 녹인 후 0.2 μm의 syringer filter로 걸러 DMEM 배지로 10배 희석하여 사용하였다. 상층의 배지를 제거한 다음 MTT 용액을 100 μl씩 첨가하여 37℃에서 4시간 반응시킨 다음 상층을 제거한 후 DMSO(dimethyl sulfoxide；Sigma, St.Louis, MO)를 100 μl넣어 실온에서 10분간 흔들어 ELISA 분석기로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. MTT측정법을 3회 시행하여 평균값을 구하였으며 항암제를 처리한 후 48시간 후 50%의 성장억제를 보이는 농도를 IC50로 하였다. 

TRAP assay
   Telomerase의 활성은 Kim 등에 의한 TRAP assay를 이용한 TRAP_EZE® Telomerase Detection Kit(Intergen Co. USA)를 사용하여 측정과 분석을 시행하였다.¹⁰⁾

세포 처치
   항암제를 처치하기 전·후 세포를 microcentrifuge tube 에 넣고 100 μl의 1X CHAPS lysis buffer(10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 0.1 mM benzamidine, 5 mM β-mercaptoethanol, 0.5% CHAPS, 10% Glycerol)를 첨가한 후, pipetting하여 균질액을 만들었다. 균질액을 30분간 얼음에 둔 후, 5417R microcentrifuge (Eppedorf Co., Hamburg, German)로 4℃를 유지하면서 12,000 rpm에서 20분간 원침하였다. 상측액 약 160 μl를 새 tube에 옮겨 모아서 단백질 농도 측정 kit(Biorad Co., Hercules, CA, U.S.A.)로 정량 측정 한 뒤 1X CHAPS lysis buffer로 희석하여 1 μg/μl가 되도록 하였다. 

Primer의 처치
   TRAP 반응에 사용될 TS primer(5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3')의 5'-말단 labeling은 다음과 같이 실시하였다. 20 μl의 반응액은 γ-32P-ATP(3000 Ci/ mmol, 10 mCi/ml) 2.5 μl, TS primer 10.0 μl, 10X kinase buffer 2.0 μl, T4 polynucleotide kinase (10 units/μl) 0.5 μl 및 증류수 5.0 μl로 구성되게 하였다. 이 반응액을 37℃에서 20분간 반응시킨 후 85℃에서 5분간 가열하여 효소를 불활성시켜 반응을 중지시킨 후 4℃에 보관하였다.

TRAP 반응
   TRAP 반응은 2 ug의 단백질이 25 μl의 반응액에서 반응하도록 조성을 맞추되 시료를 제외한 모든 반응액의 성분들은 함께 섞어서 분주함으로써 각 반응 검체간에 반응액 조성의 차이가 없도록 하였다. 각 반응액은 10X TRAP 반응 buffer(200 mM Tris-HCL, pH 9.3, 5 mM MgCl₂, 630 Mm KCl, 0.5% Tween 20, 10 mM EGTA, 0.1% BSA) 2.5 μl, 50X dNTP Mix(25 mM each dATP, dTTP, dGTP and dCTP) 0.5 μl, 32P-TS primer 1μl, TRAP primer mix (RP primer, K primer, TSK1 template) 1.0 μl, Taq polymerase(5 unit/μl, Takara Co., Japan) 0.2 μl 및 증류수 17.8 μl와 검체(1 ug/ug) 2 μl로 구성되어 총 25.0 μl가 되게 한다. 고온에서 반응 도중에 증발을 방지하기 위하여 반응액에 mineral oil 20 μl을 중층한다. 반응액은 PCR heating block(Mastercycler5330, Eppendorf Co., Germany)에서 30℃에 30분간 반응시켜 검체 속에 포함되어 있다고 생각되는 telomerase가 반응하도록 한 후 94℃에서 30초, 60℃에서 30초를 한 단위로 하는 증폭 반응을 30회 반복한다. 그리고 증폭된 산물은 전기영동시까지 4℃에 보관하였다.

Polyacrylamide gel 전기영동
   각 반응액의 10분의 1에 해당하는 loading dye(0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol, 50% glycerol, 50mM EDTA, pH8.0)를 섞어서 12.5% polyacrylamide gel과 0.5% TBE buffer에서 300 V의 일정전압으로 25 시간동안 분리한다. dye가 gel 70~50% 정도 내려왔을 때 반응을 멈추게 하였다. 전기영동이 끝난 후 gel은 autoradiography를 시행하여 반응산물의 밴드를 확인하였다.

결     과

세포독성검사
   세 가지 두경부암세포주에서 Cisplatin과 5-FU 처리 후 노출 시간이 증가할수록 농도와 비례하여 세포 생존율이 감소하였다. PNUH-12, SNU-899, HEp-2에서 cisplatin 처리시 IC₅₀는 2, 3, 3(μg/ml) 이었고, 5-FU 처리시 IC₅₀는 16, 45, 40(μg/ml) 이었으며, cisplatin과 5-FU의 IC₅₀는 8, 15, 13배의 차이를 보였다(Fig. 1). 

Telomerase 활성의 측정
   약물처리 전 세가지 세포주에서 모두 telomerase의 활성이 검출되었다(Fig. 2). Cisplatin 처리 후 세 가지 두경부암세포주 모두에서 telomerase 활성은 농도가 증가함에 따라 감소하였다. 5-FU 처리 후에는 telomerase 활성은 PNUH-12에서 약간 감소하였으나, SNU-899와 HEp-2에서는 변화를 보이지 않았다.

고     찰

   두경부암에서의 항암약물 요법은 과거 고식적인 치료를 위하여 주로 사용되었으나, 최근 장기 보존을 위한 선행항암요법으로 사용되면서 그 효용성이 증가되고 있다. 이러한 두경부 암에서 흔히 사용되는 항암제는 cisplatin과 5-FU이다. Cisplatin(cis-diamminedichloroplatinum(Ⅱ)=CDDP)은 DNA 염기내의 구아닌과 결합하여 알킬화 항암제와 유사한 DNA 사슬의 교차결합(cross linking)을 초래하여 결과적으로 세포 독작용을 일으킨다. 5-FU는 pyrimidine 유도체로서 세포내에서 활성화되어 thymidylate synthetase(TS)의 활성을 억제하여 작용을 나타낸다.¹¹⁾
   본 연구에서는 cisplatin을 처리 하였을 때 두경부암 세포주에서 telomerase 활성이 감소하였다. 고환암세포에서의 연구에서 cisplatin 처리 후 telomerase 활성이 감소된다고 하였으며,¹²⁾ 구강암 세포주의 연구에서 cisplatin을 처리한 후 telomerase 활성이 감소한다고 하여, 본 연구와 유사한 결과를 보였다.¹³⁾ 그러나, Wang 등은 비인두암종에서의 연구에서는 cisplatin의 처치 후 telomerase의 활성에 변화가 없었고 하였다.¹⁴⁾ 또한 본연구에서는 5-FU 처리시 telomerase의 활성의 변화가 없거나 미미한 감소를 보였다. Mese 등은 구강암세포주에서 5-FU의 처치 후 telomerase의 발현이 감소한다고 하였다.¹³⁾ 이러한 여러 가지 세포주에서 상충되는 결과는 원발암의 위치, 암세포의 분화정도, P53의 돌연변이 유레 등의 각 세포주들 간의 특성의 차이로 생각된다. 
   본 연구에서 cisplatin의 처리에 의해 telomerase가 감소하였으나 5-FU의 처리 후에는 미미하게 감소하거나, 변화가 없었다. 이러한 기전으로 생각되는 것은 저자들의 과거의 연구에서 PNUH-12에서 cisplatin 처리 시 p53의 단백의 증가와 세포고사가 유도되나 5-FU에 의해 P53과 P21 단백의 증가가 관찰되며 세포정지가 유발되는 소견과 연관성이 있는 것으로 생각된다.⁶⁾ PNUH-12에서 관찰된 cisplatin과 5-FU 처리 시 세포고사와 세포정지의 차이가 PNUH-12 뿐만 아니라 SNU-899, HEp-2 등 다른 두경부암세포주에서도 같이 적용될 수 있는지는 추가적 연구가 필요하다. 암의 성장과 분화에 중요한 telomerase의 활성이 cisplatin 처리 후 감소하나 5-FU 처리 후에는 변화가 없었다는 것은 cisplatin이 PNUH-12를 비롯한 다른 두경부 세포주에서 5-FU에 비해 세포의 성장에 많은 손상을 주는 것을 의미한다. 이러한 결과는 실제로 임상에서 cisplatin이 5-FU에 비해 하인두암을 비롯한 두경부암에 더 효과적인 것을 설명할 수 있는 것으로 생각된다. 
   Telomerase는 RNA 소단위와 단백질 소단위로 구성된 핵단백복합체이다. RNA 구성성분은 TTAGGG에 대한 상보성의 human telomerase RNA(hTR)이며, 단백질 부분은 human telomerase reverse transcriptase(hTERT)로 이루어져 있다. 특히 hTERT의 발현은 telomerase의 활성과 밀접한 관련성이 있다고 알려져 있다.¹⁵⁾ 앞으로 cisplatin 및 5-FU의 항암기전을 좀더 이해하기 위하여 cisplatin에 의한 telomerase 활성의 억제가 hTR 및 hTERT 의 발현과 어떻게 관련되는지 telomere length의 감소와 상응하는지에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다. 

결     론

   두경부암세포주들에서 telomerase의 활성이 모두 검출되었다. telomerase 활성은 cisplatin의 처치에 의하여 저하되었으나 5-FU의 처치 후의 활성 변화는 미미하였다. 이러한 결과는 두경부암에서 cisplatin이 5-FU에 비해 더 효과적인 이유의 하나로 생각된다.

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