교신저자：이철희, 110-744 서울 종로구 연건동 28  서울대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   알레르기 비염의 임상적, 사회경제학적 중요성에도 불구하고 근본적 치료법의 개발은 진전을 보지 못하고 있다. 약물 요법은 알레르기 비염의 기본적인 치료법이지만 근본적인 치료법은 아니며 유일한 근본치료법인 면역요법은 초치료시의 아나필락시스의 위험성, 치료기간의 장기화, 고비용의 단점을 갖고 있다.^1)2)3)4)
   알레르기 질환의 예방 및 치료로서 경구 면역관용(immune tolerance), 즉 항원을 경구 투여하면 말초 면역 관용이 유발된다는 사실은 오래 전부터 알려졌고 알레르기 반응의 예방 및 치료의 한 방법으로 제시되었다.⁵⁾⁶⁾ 그러나 항원의 경구투여가 전신 관용을 유발시키는 편리한 방법이기는 하지만 치료적인 면에서 이용 가능성은 많은 한계가 있다. 특히 항원을 반복적으로 많은 양을 투여하여야 하고, 면역관용이 지속되는 기간이 일시적이며 치료제로는 효과가 없는 점 등의 한계가 있었다.⁷⁾
   최근에 이런 한계를 극복하고자 자가면역질환을 대상으로 항원의 경구투여의 효과를 입증하는 보고들이 발표되고 있다. 특히 콜레라 독소 B 아단위(choleratoxin-B subunit, CTB)를 이용한 항원의 효과적인 전달방법이 발표되었고,⁵⁾ 적은 양의 항원을 CTB와 결합시켜 효과적으로 경구관용을 유도할 수 있는 방법이 개발되어⁶⁾ 알레르기 비염에도 이를 적용할 가능성이 있다. 
   우리나라의 경우 집먼지진드기(house dust mite, HDM)가 원인 항원인 통년성 알레르기 비염이 흔하기 때문에 집먼지진드기에 대한 면역치료법의 필요성이 크다.
   본 연구는 집먼지진드기항원와 CTB의 공유결합물(HDM-CTB conjugate)을 제작하여 집먼지진드기에 감작시킨 알레르기 비염 마우스에서 HDM-CTB conjugate에 의한 점막면역관용의 유도 여부를 확인하고 알레르기 비염의 예방효과와 장기적 치료효과를 관찰하기 위하여 시행하였다.

재료 및 방법

실험동물과 항원
   생후 4주령의 C57BL/6 마우스((주)대한실험동물) 수컷(체중 20~30 g) 20마리를 specific pathogen free 상태에서 사육하였다. 항원으로 집먼지진드기인 Dermatophagoides farinae의 lyophilized crude body extract(이하 Der f：연세대학교 내과학 교실 홍천수 제공)를 사용했다. 항원은 4℃에서 냉장 보관하고 phosphate-buffered saline(PBS)에 녹여 사용했다.

HDM-CTB의 제작
   10 mg의 HDM-Ag, 2 mg의 CTB(List Biological Lab. Inc., CA), 1.1 mg의 Sulfo-NHS(N-hydroxysulfo succinimide) 및 19.2 mg의 EDC(1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl) Carbodiimide Hydrochloride：PIERCE. Inc., IL)를 3차 증류수 1 ml에 용해시킨 후 실온에서 3시간 반응시켜 공유결합물(HDM-CTB conjugate)을 제작하였다. 대조군으로는 동량의 우혈청알부민(Bovine serum al-bumin, BSA)을 같은 방법으로 공유결합시켰다. 
   공유결합체를 겔투석크로마토그라피(gel filtration chromatography)로 분리하고 공유결합체 용출분획을 PBS로 18시간 투석한 후 GM1-ganglioside(Sigma, MO)와의 친화력 및 항체(anti-CTB antibody；List Biological Lab. Inc., CA)와의 반응성을 평가하였다. GM1-ganglioside(1.5 M), anti-CTB antibody(1：10) 및 BSA(control)이 흡착된 96 well ELISA plate에 공유결합산물을 반응시킨 후, 반응 상층액 중의 단백 농도를 측정하였고, 단백농도는 BCA protein assay kit(PIERCE, IL)를 사용하여 측정하였다.

알레르기 비염 모델의 제작과 HDM-CTB conjugate의 투여
   C57BL/6 마우스를 대조군과 실험군으로 나누어 이전에 본 교실에서 발표한 방법에 따라 알레르기 비염을 유도하였다.⁸⁾ 대조군은 Der f에 감작시키지 않은 음성대조군과 감작시킨 양성대조군으로 나누었다. 실험군은 알레르기 비염 유도 전에 HDM-CTB conjugate를 투여한 예방투여군과 알레르기비염을 유도한 후에 HDM-CTB conjugate를 투여한 치료투여군으로 나누었다.
   실험군과 양성대조군의 마우스에 Der f 100 μl(1 μg/μl)와 Complete Freunds Adjuvant(CFA, PIERCE. Inc., IL) 100 μl를 섞은 혼합액 200 μl를 마우스 꼬리 부근에 피하주사하여 항원에 전신감작시켰다. 실험시작 24시간 후와 72시간 후에 pertussis toxin 300 ng을 복강 내에 주사했다. 실험시작 7일 후에 동량의 Der f와 Incomplete Freunds Adjuvant(IFA, PIERCE. Inc., IL) 혼합액 200 μl를 피하주사하였다.
   위와 같이 전신감작을 시킨 후 6주일간 1주일마다 한번씩 마이크로피펫을 이용하여 20 μg의 Der f를 20 μl의 PBS에 녹인 용액을 마우스의 양측 비강에 10 μl씩 비내 점적하여 비내 국소감작을 유도했다. 음성 대조군의 마우스에게는 항원이 섞이지 않은 CFA를 주사하고 이후 1주일마다 6주간 동량의 PBS 만을 비내 점적했다. 
   예방투여군에서는 알레르기 비염을 유도하기 3주전부터 1주에 1회씩 3회에 걸쳐 20 μg의 HDM-CTB conjugate 20 μl를 마우스의 양측 비강에 10 μl씩 비내 점적하였다. 알레르기 비염의 유도가 끝난 후 1주에 20 μg의 Der f 용액 20 μl를 마이크로피펫을 이용하여 비내 점적하여 각 군에서 비강내 유발을 시행한 후 알레르기증상, 비점막의 호산구 침윤, 혈청 내 Der f-specific IgE 항체 농도, 비장에서 T 세포 증식을 관찰하였다.
   치료투여군에서는 알레르기비염의 유도가 끝난 후 4일간 매일 1회씩 총 4회에 걸쳐 20 μg의 HDM-CTB conjugate 20 μl를 마우스의 양측 비강에 10 μl씩 비내 점적하였다. HDM-CTB conjugate 투여 후 1, 2, 4, 8주에 20 μg의 Der f 용액 20 μl를 마이크로피펫을 이용하여 비내 점적하여 각 군에서 비강내 유발을 시행한 후 알레르기증상, 비점막의 호산구 침윤, 혈청 내 Der f-specific IgE 항체 농도, 비장에서 T 세포 증식을 관찰하였다.

항원 투여 후 유발된 알레르기 증상의 비교
   20 μg의 Der f 용액 20 μl를 마이크로피펫을 이용하여 비내 점적하여 각 군에서 비강내 유발을 시행한 후 일정한 시간에 15분간 각각의 마우스에서 재채기 횟수와 코를 긁는 동작의 횟수를 측정하여 이들의 합을 증상점수로 기록하였다. 2명의 관찰자가 측정한 점수의 평균을 증상점수로 기록하였고 관찰자간의 차이가 30% 이상인 경우는 제외하였다.

비점막 조직 소견의 비교
   마우스를 희생시켜 비중격 점막을 채취하고 Hematoxyline-Eosin 염색을 시행하여 400배 광학 현미경(Laborlux K, Leica, Stgallen, Switzerian) 하에서 관찰하여 조직내 호산구 침윤정도를 측정하였다(단위；개/400배 시야).

Der f-specific IgE 항체 농도 측정
   각 실험군의 마우스에서 비중격 점막 채취 시에 심장천자를 통하여 혈액을 채취하여 원심분리를 통해 혈청을 얻어서, Der f-specific IgE 항체 농도를 ELISA 방법을 사용하여 측정했다.

T-cell proliferation assay
   실험동물에서 비장을 채취하여 필터를 여과시켜 단일세포현탁액으로 만들었다. 피콜을 넣고 원심분리하여 주사기로 림프세포층만 분리하였다. 무혈청배양액에 담긴 1×10⁵개의 비장세포가 들어있는 96-well plate에서 Der f-specific T 세포를 배양했다. 한 샘플 당 Der f 항원을 첨가한 well과 항원이 없는 well을 각각 3개씩 만들었다. 60시간동안 배양한 뒤에 1 μCi tritiated methyl thymine를 넣고 12시간 동안 배양했다. Methyl thymine incorporation을 liquid scintillation counting으로 측정하였는데, 항원이 있을 때 섭취되는 양을 없을 때 섭취되는 양으로 나눈 자극지수(stimulation index)를 구하였다.

통계처리방법
   본 연구에서 얻은 측정치는 Mann-Whitney U-test를 이용하여 통계분석을 실시하였고 SPSS for windows version 10.0(SPSS Inc., Chicago, IL)을 이용하였고 p<0.05를 통계적으로 의미 있다고 하였다.

결     과

항원 투여 후 유발된 알레르기 증상
   치료투여군에서는 증상점수가 16.6±5.8로서 양성대조군(27.0±8.9)에 비해 유의하게 감소하였다(p<0.05). 예방투여군(18.5±5.0)은 양성대조군과 통계적으로 의미있는 차이는 없었다(p=0.058)(Fig. 1).
   치료투여군에서 HDM-CTB conjugate를 투여한 후 2주에 측정한 증상점수는 15.9±3.2로서 양성대조군(21.6±5.5)에 비해 유의하게 감소하였다(p<0.05). 그러나 4주, 8주에 측정한 증상점수는 각각 14.3±2.9, 16.7±3.3으로 양성대조군(18.7±3.1, 15.3±6.1)과 차이가 없었다(Fig. 2).

비점막 내 호산구의 침윤
   항원 투여 후 24시간에 채취한 마우스 비점막 내에서 관찰되는 호산구의 수는 치료투여군에서 8.6±3.4개로서 양성대조군(15.5±7.5개)에 비해 유의하게 감소하였다(p<0.05). 예방투여군(10.9±3.4개)은 양성대조군과 통계적으로 의미 있는 차이는 없었다(p>0.05)(Fig. 3).
   치료투여군에서 HDM-CTB conjugate를 투여 2주 후에 항원을 투여한 후 24시간에 채취한 마우스 비점막에서 관찰한 호산구의 수는 9.0±3.5개로 양성대조군(12.0±2.5개)과 유의한 차이가 없었으며, 또한 4주, 8주 후에 항원 투여 후 24시간에 채취한 마우스 비점막에서 관찰한 호산구의 수도 각각 10.0±3.3개, 9.4±1.7개로 양성대조군(13.0±4.6개, 12.0±3.0개)과 차이가 없었다(Fig. 4).

혈청 Der-f 특이 IgE 항체 농도
   치료투여군의 혈청내 Der-f 특이 IgE는 162±43 EU로 양성대조군의 225±87 EU에 비해 유의하게 낮았다(p<0.05). 예방투여군(169±38 EU)은 양성대조군과 통계적으로 의미있는 차이는 없었다(p>0.05)(Fig. 5).
   치료투여군에서 HDM-CTB conjugate를 투여한 후 2주에 채취한 혈청내의 Der-f 특이 IgE는 159±62 EU로 양성대조군(294±111 EU)에 비해 유의하게 낮았다(p<0.05). 그러나 4주, 8주에 채취한 혈청에서는 각각 159±79 EU, 196±89 EU로 측정되어 양성대조군(265±93 EU, 240±105 EU)과 차이가 없었다(Fig. 6).

비장 T 림프구 증식 검사
   치료투여군과 예방치료군의 자극지수는 각각 0.7±0.4, 0.5±0.4로 양성대조군의 1.9±1.5에 비해 유의하게 낮았다(p<0.05)(Fig. 7).
   치료투여군에서 HDM-CTB conjugate를 투여한 후 2주에 채취한 비장의 T 림프구 증식 검사에서 자극지수는 1.2±0.3으로 양성대조군(2.2±0.4)에 비해 유의하게 낮았다(p<0.05). 그러나 4주, 8주에 채취한 비장에서 시행한 검사에서의 자극지수는 각각 1.4±0.4, 2.4±0.5로 양성대조군(2.0±0.7, 2.5±0.1)과 차이가 없었다(Fig. 8).

고     찰

   Cholera toxin은 Vibrio cholera 균의 내장독소(enterotoxin)로서 강력한 면역원이면서 강한 점막면역 보조제이며,⁹⁾ 1970년대 초 독소에 의한 콜레라의 병원성 기전이 발견된 이후로 백신 대상 물질로 연구되어 왔다. CTB는 경구 투여했을 때 자체에 대한 면역 반응을 유도할 뿐만 아니라 공유 결합되어 투여된 항원에 대하여 면역 억제 또는 증가를 유발하는 것으로 보고되고 있다.^6)10)11) CTB와 같이 투여한 항원에 대하여 면역관용을 유발한다는 사실이 발표되면서 이를 이용하여 알레르기 및 자가면역 질환의 면역요법을 하려는 연구가 시도되었다.^{10)11)12)13)14)15)16)17)}
   CTB의 점막면역력은 T림프구와 관련되어 있고 이에 관련된 T세포의 epitope도 발견되었다.⁹⁾ CTB를 이용한 항원의 효과적인 전달방법이 개발되었고,⁵⁾ 최근에는 적은 양의 항원을 CTB와 결합시켜 효과적으로 경구면역관용을 유발시킬 수 있는 방법이 발표되었다.⁶⁾ 이 같은 연구를 바탕으로 myelin basic protein을 CTB에 결합시켜 면역 관용을 유발함으로써 실험적 알레르기 뇌수막염(allergic encephalomyelitis)을 예방하는데 성공하였으며,¹¹⁾ 인슐린을 CTB와 결합시켜 경구 투여함으로써 당뇨 유발 마우스에서 베타 세포 내에 diabetogenic T 세포 침윤을 예방하는데 성공하였다.¹⁰⁾
   알레르기 질환에 있어서도 난알부민과 관련된 연구가 있었다.^5)15)16) 난알부민은 소아에서 알레르기 질환을 유발시키는 중요한 항원이지만 상기도 알레르기 질환, 특히 알레르기 비염의 경우에는 드문 항원이다. 우리나라 알레르기 비염 환자의 대부분은 집먼지진드기가 원인 항원이기 때문에 이같은 연구들은 임상적 적용에 있어서 한계가 있다. 본 연구에서 채택한 마우스 모델은 집먼지진드기에 감작된 알레르기 모델이므로 이러한 한계를 극복할 수 있을 것으로 생각한다.
   본 연구에서 알레르기 비염이 확립된 후 HDM-CTB를 투여한 치료투여군에서 투여 1주에 알레르기증상, 비점막 내의 호산구 침윤, T 세포 증식, 혈청 내 Der-f 특이 IgE 농도가 양성대조군에 비해 의미 있게 낮음을 관찰할 수 있었다. 이는 기존의 알레르기 비염 환자군에서 집먼지진드기와 CTB의 공유결합물질을 이용하여 알레르기 비염을 치료할 가능성이 있음을 보여주는 것이다.
   투여 후 2주에는 비슷한 결과를 보였다. 그러나 투여 후 4주, 8주에 측정한 알레르기증상, 비점막 내의 호산구 침윤, T 세포 증식, 혈청 내 Der-f 특이 IgE 농도는 양성대조군에 비해 평균값은 감소하였으나 통계적으로 차이는 없었다. 이와 같은 결과는 HDM-CTB conjugate의 치료 효과가 장기적으로 지속됨을 보여 주지 못한 것으로서 집먼지진드기와 CTB의 공유결합물질의 실제 임상 적용에 한계로 작용할 수 있다. 그러나 이같은 결과는 HDM-CTB conjugate의 치료효과가 지속되지 않음에 기인할 수도 있지만 다른 요인도 생각할 수 있다. 양성대조군에서 알레르기 증상, 비점막 내의 호산구 침윤, 혈청 내 Der-f 특이 IgE 농도가 시간이 지남에 따라 낮아지는 것으로 보아, 시간이 지남에 따라 알레르기비염 모델에서 알레르기 현상 자체가 약화되고 양성대조군과 음성대조군의 차이가 줄어들기 때문에 실험군의 결과가 통계적으로 차이를 보이지 못하였을 가능성이 있다. 또 본 실험에 사용된 알레르기비염 마우스 모델은 알레르기 유발에 비교적 긴 시간이 걸리는 모델이고 마우스의 노화에 따르는 시간적 요인이 또한 장기효과에도 영향을 미쳤을 수 있다.
   알레르기 비염이 확립되기 전에 HDM-CTB conjugate를 투여한 예방투여군에서는 T 세포 증식을 제외하고는 의미 있는 알레르기 반응의 억제가 이루어지지 않았다. 이 점 또한 본 실험의 동물모델의 알레르기 유발에 소요되는 시간이 길기 때문일 것으로 생각된다.
   본 연구는 우리나라 알레르기 비염에서 가장 흔한 원인 항원인 집먼지진드기에 감작된 동물 모델에서 항원과 CTB의 공유결합물질에 의한 알레르기의 억제를 관찰함으로써 알레르기 백신 개발의 기초자료를 얻고자 시행하였다. 또한 이미 알레르기가 확립된 마우스에서 효과가 있음을 관찰할 수 있었으므로 임상적인 적용의 가능성이 더욱 높다고 생각하였다. 다만, 이 효과가 장기간 지속됨을 증명하지 못하였고, 세균내장독소인 CTB의 잠재적 독성 발현 여부에 대하여 추가적인 연구가 필요하다고 판단된다.

결     론

   집먼지진드기에 감작된 마우스모델에서 HDM-CTB conjugate 투여 후 알레르기 반응이 감소함을 관찰하였으나 투여 후 4주 이후에는 알레르기 반응의 유의한 감소는 관찰할 수 없었다. 집먼지진드기항원과 CTB의 공유결합물질이 집먼지진드기 알레르기 비염의 새로운 치료법으로서의 가능성을 갖고 있다고 생각한다.

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