교신저자：문성균, 442-721 경기도 수원시 팔달구 원천동 산5  아주대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   급성 중이염은 유소아의 가장 흔한 염증성 질환의 하나이며 그 후유증인 삼출성 중이염은 학동기 유소아의 가장 흔한 청력장애의 원인이다. 급성 중이염은 바이러스성 상기도 감염이나 알레르기 등으로 이관이나 중이강의 방어기능이 저하되었을 때 비인강의 점막에 부착된 병원균이 이관을 통하여 중이강으로 침입하여 숙주 면역계의 저항을 이기고 증식하여 염증반응을 일으킬 때 발생한다.¹⁾
   중이강은 T-cell 이나 B-cell과 같은 면역세포가 상대적으로 적음에도 불구하고 무균상태를 유지하고 있다. 이는 중이강이 항체와 면역 세포가 주축이 되는 소위 후천면역(adaptive immunity) 보다는 자연면역(innate immunity)에 의해 보호되고 있다는 것을 의미한다고 할 수 있다.²⁾ 후천면역계에 비하여 병원균에 대한 대응 시간이 신속하고 광범위한 항균작용을 하는 자연면역계는 중성구나 대식세포와 같이 병원균을 포식하는 세포와 직접 병원균의 세포막을 파괴하여 항균 작용을 하는 보체(complement)나 defensin과 같은 항균 단백질로 구성되어 있다.³⁾
   Defensin은 강한 양전위를 띠는 작은 peptide로서 병원균의 세포막에 작은 구멍을 만들어 항균작용을 나타내며⁴⁾ 주로 중성구나 소장의 Paneth 세포에서 분비되는 α defensin⁵⁾과 호흡점막이나 피부의 상피세포에서 분비되는 β defensin⁶⁾⁷⁾으로 구분된다. 최근에 이비인후과 영역에서는 외이도와 고막⁸⁾ 그리고 비 점막⁹⁾¹⁰⁾의 상피세포에서 인체 β defensin(hBD) 1이 발현되는 것이 보고되었지만 아직 중이점막에서의 발현 여부는 확인되지 않았다. 중이점막은 호흡 점막과 발생학적으로 기원이 같기 때문에 defensin도 유사하게 발현하며 중이강의 방어에 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.
   이에 저자들은 자연면역의 구성 요소 중 직접 항균 작용을 하는 β defensin이 중이 점막에서 발현 되는지를 확인하고 염증 상태에서 그 발현 정도가 어떤 영향을 받는지를 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

사람 중이점막의 채취와 RNA 추출
   만성 중이염환자의 염증성 중이점막과 청신경 종양환자의 정상 중이점막을 각각 수술 중에 채취하였다(Table 1). 채취된 조직을 분쇄한 후 RNA 분리 kit(RNeasy^TM, Qiagen, CA, USA)를 이용하여 RNA를 추출하였다. 과정을 간단히 요약하면, 분쇄된 조직에 β-mercaptoethanol이 함유된 lysis 완충액을 가한 후 원심분리를 하였다. 상층액에 70% ethanol을 가한 후 silica gel-based membrane에 통과시켜 RNA가 선택적으로 membrane에 결합되도록 하였다. 세척 완충액으로 오염되어 있는 단백질이나 DNA를 제거한 후 증류수로 membrane에 결합되어 있는 RNA를 추출하고 Spectrophotometry로 total RNA의 농도를 정량하였다.

실험동물의 중이점막 채취와 RNA 추출
   26 gauge 주사바늘과 1 ml 주사기를 이용하여 lipopolysaccaride(LPS)(10 ug/ml, Sigma, MO, USA)와 IL-1α(10 ng/ml, Sigma)를 고막을 통하여 Wistar-Kyoto rat의 중이강에 각각 20 ul씩 주입하였다. 8시간(IL-1α)과 48시간(LPS) 후에 실험동물을 희생시키고 중이점막과 이관을 채취하였다. 채취한 조직에서 인체 중이점막과 같은 방법으로 RNA를 추출하였고 같은 실험을 세 번 반복 하였다.

면역조직화학염색
   Celloidin에 포매된 인체 측두골 표본의 조직절편(두께 20 um) 중에 정상 중이점막과 염증성 중이점막 소견을 보이는 표본을 각각 선택하였다(Table 1). 인체 측두골 표본은 사체 부검시 채취되어 탈석회화 후에 celloidin에 포매된 것으로 절단면이 와우의 축에 평행하도록 하여 조직절편을 만들었다. Sodium hydroxide와 Methanol의 1：4 혼합액을 이용하여 조직절편에서 celloidin을 제거하고 염소 혈장으로 항체의 비특이적 부착부위를 차단하였다. 1：200으로 희석된 hBD 1과 2에 대한 토끼의 polyclonal 항체(a generous gift of Dr. Ganz in UCLA, LA, USA)를 4℃에서 12시간 방치(incubation)시키고 3회 세척하였다. 당나귀의 biotinylated anti-rabbit IgG 항체와 avidin(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)을 이용하여 peroxidase를 부착시켰다. 발색반응을 AEC(3-amino-9-ethylcarbazole)로 시행하고 hematoxylin으로 대조염색을 하였다.

RT-PCR
   Reverse transcriptase(Gibco BRL)와 random hexamer를 이용하여 표본에서 추출된 RNA 1 ug을 cDNA로 만들었다. 만들어진 cDNA에서 hBD-1, 2, 3과 흰쥐 β defensin 2(rBD-2)의 codon region을 증폭하도록 고안된 각각의 primer(Table 2)를 이용하여 연쇄중합반응(polymerase chain reaction, PCR)를 시행하였다. 대조유전자로 β-actin과 β2-microglobulin을 이용하였으며 경우에 따라 사람이나 흰쥐의 폐에서 추출한 cDNA를 positive control로 이용하였다. PCR 산물은 1.2% agarose gel에 전기영동 후 자외선 하에서 관찰하였다.

결     과

인체 중이점막에서 defensin의 mRNA와 peptide의 발현
   중이염 수술이나 청신경 종양수술 중에 채취한 정상 중이점막에서 분리한 mRNA를 reverse transcriptase를 이용하여 cDNA로 만든 후 hBD-1, 2와 3의 codon sequence를 증폭시키는 primer로 PCR을 시행하였다. hBD-1의 mRNA는 중이염 환자의 중이 점막과 정상 중이 점막 모두에서 발현하였으나 hBD-2와 3의 mRNA는 중이염 환자의 중이 점막에서만 발현되었다(Fig. 1).
   Celloidin에 포매된 사람 측두골 표본의 면역조직화학염색 결과 RT-PCR결과와 유사하게 hBD-1의 peptide는 중이염 환자의 중이 점막과 정상 중이 점막에서 염색이 되었으나 hBD-2의 peptide는 중이염 환자의 중이 점막에서 보다 강하게 염색되었다(Fig. 2). 이상의 결과로 중이 점막에서 hBD-1는 정상 상태나 염증 상태에서 모두에서 발현되지만 hBD-2는 정상 상태에서는 발현이 없거나 적지만 중이염과 같은 염증성 자극에 의하여 그 발현이 유도되거나 크게 증가하는 것으로 생각되었다.

실험동물에서 염증자극물질의 hBD-2 발현 유도 효과
   Wistar-Kyoto rat의 중이강에 그람 음성균의 endotoxin인 LPS(10 ug/ml) 와 proinflammatory cytokine인 IL-1α(10 ng/ml)를 각각 주입하고 8시간(IL-1α)이나 48시간(LPS) 후에 중이 점막을 채취하여 RT-PCR을 시행한 결과, PBS를 주입한 대조군에서는 흰쥐 β defensin 2가 거의 발현 되지 않았으나 LPS나 IL-1α로 자극한 실험군에서는 발현이 유도 되었다(Fig. 3). 이상의 결과로 염증성 인체 중이점막에서 β defensin 2의 발현이 증가되어 있는 현상을 동물에서 확인할 수 있었다.

고     찰

   자연면역계는 후천면역계에 비하여 병원균의 제거에 있어서 비특이적이지만 대응 시간이 신속하고 광범위한 항균작용을 하기 때문에 병원균이 침입한 후 후천면역이 발동하기 전인 초기단계에서 큰 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 자연면역계는 피부나 점막섬모계와 같은 물리적인 방어막과 대식세포나 중성구와 같이 직접 병원균을 제거하는 세포군 및 보체나 defensin과 같이 병원균의 세포막을 선택적으로 파괴하는 항균단백질로 구성되어 있다.
   항균단백질 중 최근 주목을 받고 있는 것이 5 KDa 이하의 작은 펩타이드인 defensin으로서 3개의 disulfide 결합을 갖고 있으며 강한 양전위를 띠는 것이 특징이다.¹¹⁾¹²⁾ Defensin은 강한 양전위를 이용하여 상대적으로 음전위를 갖고 있는 병원균의 세포벽에 결합한 후¹³⁾ 세포막의 bilipid 층에 부분적으로 구멍을 형성하여 세포막의 투과성을 증가시켜⁴⁾ 항균작용을 한다. Disulfide 결합의 형태에 따라 α와 β defensin으로 분류되는데 α defensin은 주로 호중구나 소장의 Paneth 세포에서 분비되고, β defensin은 상피세포에서 분비된다. β defensin은 이미 호흡기나 피부 및 비뇨기관의 상피세포에서 발현되는 것이 알려져 있으며 이비인후과 영역에서는 인체 비점막과 외이도 및 고막의 피부 상피세포에서 β defensin 1의 발현에 대한 보고가 있으나 중이점막에 대한 보고는 아직 없다.
   또한, β defensin은 염증반응이 없는 정상 상태에서도 발현되는 β defensin 1¹⁴⁾과 정상 상태에서는 발현량이 적지만 염증성 자극에 의하여 발현이 크게 증가하는 β defensin²⁷⁾와 최근에 확인된 β defensin 3¹⁵⁾¹⁶⁾로 구분된다. 그람 음성균에 대한 항균효과에 있어서 β defensin 2가 1에 비하여 약 10배 정도 강력하며 β defensin 3는 그람 양성균에 선택적으로 강한 것으로 알려져 있다.¹⁷⁾
   다양한 염증성 자극에 의한 사람 β defensin 2의 발현증가는 여러 가지 상피세포에서 보고되었다. 즉, 각질 상피세포에서는 TNF-α와 그람 양성이나 음성 병원균 및 Candida에 의해,⁷⁾ 대장 상피세포에서는 IL-1α나 enteroinvasive bacteria에 의해,¹⁸⁾ 구강 상피세포에서는 IL-1α나 LPS에 의해,¹⁹⁾ 호흡 상피세포에서는 mucoid Pseudomonas, LPS, TNF-α나 IL-1α 등에 의해²⁰⁾ 사람 β defensin 2의 발현이 증가하는 것으로 알려져 있다.
   이번 실험에서 사람 중이 점막에서는 처음으로 β defensin의 발현을 단백질과 mRNA 단계에서 확인할 수 있었으며 특히 β defensin 2나 3은 염증성 반응이 있는 중이 점막에서 발현이 증가되어 있는 것을 알 수 있었다. 동물실험에서도 염증성 자극인 LPS나 IL-1α에 의해 백서 β defensin 2의 유전자 발현이 증가한 것으로 미루어 볼 때 중이점막 상피세포에서도 다른 상피세포와 마찬가지로 염증성 자극에 의한 hBD-2의 발현 증가 기전이 동일하게 존재함을 알 수 있었다.

결     론

   자연면역계의 항균물질인 β defensin이 인체 중이점막에서 발현되는 것을 확인할 수 있었으며 특히, β defensin 2는 중이점막에서 정상 상태에서는 발현이 거의 되지 않지만 염증성 자극에 의하여 발현이 유도되는 것을 인체조직과 실험동물에서 확인 할 수 있었다. 향후 중이염의 병인에 있어서 defensin의 역할에 대한 연구가 필요할 것으로 사료된다.

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