교신저자：이상학, 136-705, 서울 성북구 안암동 5가 126-1  고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
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서     론

   코점막의 상피는 점액으로 덮혀있으며, 상피세포로부터 돌출된 섬모의 끝이 점액층과 접촉되어 있다. 따라서 외부대기로부터 유입된 이물질이 코점막에 부착되면 점액층, 수액층 그리고 섬모가 조화를 이루어 점액을 비인강으로 운반함으로써 코점막을 방어하는 기능을 하고있다. 비루의 양과 구성성분에 따라 점액섬모수송기능이 변화하며, 코점막 상피를 통한 전해질의 이동이 비루의 양과 구성성분을 조절하고있다.¹⁾²⁾ 또한 코점막의 상피보다 비용조직의 상피에서 이온의 수송이 더 빠른 속도로 일어나기 때문에 상피를 통한 수분흡수가 증가되어 비용이 발생할 수 있다고 제시되고 있다.³⁾⁴⁾⁵⁾
   세포막을 통한 Na⁺와 Cl^-의 이동에 관여하는 여러 기전들이 밝혀지고 있으며, 이 기전에는 Na⁺과 Cl^- channel과 같은 electrogenic process와 Na⁺/H⁺ exchanger(NHE)와 Cl^-/HCO₃^- exchanger(AE)와 같은 electroneutral processes가 있다. 세포내에서 NHE와 AE는 세포내 pH의 유지, 세포 부피조절 그리고 세포증식등 다양한 기능을 하고 있으며, 위장관, 췌장 그리고 신장과 같은 장기에서 Na⁺의 세포간 이동과 관련된 분비기능에 관여한다.^6)7)8)9)10) 최근에 NHE와 AE의 유전자군이 알려져 있는데, NHE mRNA는 5가지 다른 아형들(NHE1~NHE5)이 있다, 그중 NHE1, NHE2, NHE3 아형들의 기능이 가장 특징적으로 밝혀졌으며, AE mRNA는 3가지(AE1, AE2, AE3)의 아형들이 알려져있다.^11)12)13) 
   NHE와 AE의 생리적인 기능을 고려하여 볼 때 코점막의 상피세포를 통한 전해질의 이동에도 관련될 수 있다고 생각되나 현재까지 인체 코점막에 있어서 NHE와 AE 아형들의 발현여부와 그들의 생리 및 병리학적 역할은 알려져 있지 않다. 따라서 본 연구에서는 인체 비점막과 비용조직을 이용하여 NHE와 AE mRNA의 아형들에 대한 발현을 RT-PCR과 In situ hybridization을 이용하여 분석하고자 하였다.

재료 및 방법

연구재료 및 채취
   외비성형술을 시행받은 10명의 환자(남자 3명, 여자 7명, 연령 22~43세)로부터 하비갑개 조직을 채취하였다. 전례에서 수술 당시 특이한 염증증상은 없었으며, 알러지, 천식, 아스피린에 대한 과민성, 흡연, 약물복용의 병력이 없었다. 내시경 검사상 코안의 해부학적 구조 이상이나 점막손상은 관찰되지 않았다. 
   만성 부비동염으로 내시경 부비동 수술을 시행한 10명의 환자(남자 8명, 여자 2명, 연령 20~50세)로부터 비용 조직을 채취하였다. 모두 알러지, 천식, 아스피린에 대한 과민성등이 없었다. 내시경하 사골동 개방술을 시행하면서 중비도에 존재하는 비용을 제거하였다.
   수술시 채취한 하비갑개와 비용조직을 두 부분으로 나누어 일부는 총 RNA 분리를 위하여 액화질소로 급속냉각시킨 후 -70℃에서 보관하였고, 나머지는 in situ hybridization을 위하여 0.1M 인산완충생리식염수(pH 7.2, 4℃)로 용해한 4% 파라포름알데히드에서 24시간 고정한 후 30% 수크로스에서 수세한 다음 OCT compund(embedding medium for frozen tissue specimens, Sakura Finetek, USA Inc, Torrance, USA)에 포매하였다.

Total RNA isolation and RT-PCR
   냉동된 조직(50~100 mg)을 1 ml의 TRIzol^® Reagent(GIBCOBRL, Grand island, NY, USA)에 넣어 균질화 시킨 후 RNA를 분리해 내었다. 각각의 조직에서 추출한 총 RNA를 2.5U의 M-MLV reverse transcriptase-(GIBCOBRL, Grand Island, NY, USA)와 random hexanucleotide 50 pmol을 포함한 반응 혼합물 20 μl를 42℃에서 60분간 반응시키면서 역전사시켰다. 각각의 반응산물인 cDNA 1 μl를 0.125U의 Taq DNA polymerase와 각각 12.5 pmol의 primer를 함유한 25 μl의 혼합물과 중합효소연쇄반응을 시켰다. mRNA상태와 RT-PCR의 적절성 여부 및 반응산물의 양적변화를 표준화하기 위하여 동일한 검체에 대하여 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)에 대한 mRNA 발현을 함께 확인하였다. 양성대조군으로 Clontech laboratories에서 구입한 폐, 장, 뇌, 심장의 total RNA를 사용하였다. 음성대조군으로 각 검체에 대한 cDNA합성시 역전사 효소를 생략한 경우로 하였다. 각 NHE와 AE, GAPDH primer염기서열은 Table 1과 같다. 연쇄반응의 산물은 ethidium bromide로 염색한 후 2% agarose gel에서 전기영동하였으며 자외선 하에서 사진촬영 하였다. 각 산물에 대한 최종적인 확인은 예상되는 DNA 분절의 크기와 DNA 염기배열순서(sequencing)를 시행하여 확인하였다.

In situ hybridization
   In situ hybridization에 사용할 probe를 만들기 위하여 cDNA 분절을 pCR ^®II-TOPO Cloning vector(Invitrogen Corp., Carlsbad, LA)에 subclonig하였다. 정제된 plasmid를 HindIII와 T7 polymerase promoter를 이용하여 in vitro transcription하여 antisense probe를 합성하였고, 같은 plasmid를 Not I과 SP6 promoter로부터 전사하여 sense probe를 합성하였다. Probe는 DIG RNA labeling kit(Roche diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)을 이용하여 표식하였다.
   Poly-L-lycine으로 피복한 유리슬라이드에 조직절편을 부착시킨 후 1 μl/ml proteinase 로 37℃에서 30분, 0.25% acetic anhydride로 실온에서 10분간 처리하고, prehybridization buffer에 30분간 처리하였다. 정제된 probe를 1×Denhart's 용액, 50% deionized formamide, 0.3 M NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0, 5 mM EDTA, 0.5 mg/ml yeast tRNA, 80 μg/ml denatured salmon sperm DNA, 10 mM sodium phosphate, 10% dextran sulphate, 0.1 M dithiothreitol이 포함된 혼합용액에 1：100의 농도로 희석 시키고 가습장치안에 넣은 후 42℃에서 18시간동안 hybridization하였다. 일부 조직절편을 hybridization하기 전에 RNAse A 200 μg/ml로 1시간동안 처리함으로써 음성대조군으로 하였다. Hybridization후 조직절편을 37℃에서 2×SSC과 1×SSC로 세척하고 NTE buffer [0.5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl(pH 8.0), 5 mM EDTA]로 다시 세척한 다음 37℃에서 20분간 NTE buffer에서 20 μg/ml RNAse A에 반응시켰다. NTE buffer에 다시 세척한 다음 다시 0.1×SSC에 세척하였다. 반응이 끝난 조직슬라이드는 DIG nucleic acid detection kit를 이용하여 발색한 후 광학현미경으로 관찰하였다. 

결     과

NHE mRNA 아형
   하비갑개 점막과 비용에 NHE1, NHE2, NHE3 mRNA가 존재하는지 확인하기위해 RT-PCR을 시행한 결과 NHE1에 해당하는 245 bp 크기의 PCR 산물이 하비갑개 점막과 비용조직에서 확인되었다(Fig. 1). cDNA합성에서 역전사효소를 포함하지 않았던 음성 대조군에서는 band를 확인할 수 없었고 이것은 RNA sample에서 genomic DNA가 혼합되지 않았음을 의미한다. 
   NHE2와 3의 mRNA는 이 실험에서 사용한 하비갑개 점막과 비용조직에서는 관찰되지 않았다. 그러나 양성대조군으로 사용한 대장에서 추출한 RNA에서는 NHE2와 NHE3 mRNA가 관찰되었다(not shown). In situ hybridization결과 하비갑개 점막과 비용조직에서 NHE1 mRNA는 상피세포층과 점막하분비선에 국한되어 발현되었다. Sense probe로 반응시킨 인접 조직에서는 특별한 hybridization signal 이 관찰되지 않았다(Fig. 2).

AE mRNA 아형
   하비갑개점막과 비용조직에서 AE1과 AE2, bAE3, cAE3 mRNA의 발현을 확인 한 결과 181 bp인 AE2는 비갑개점막에서 발현되었으나 비용조직에서는 관찰되지 않았다(Fig. 1). AE1, bAE3, cAE3의 mRNA는 어떤 조직에서도 발현되지 않았다(not shown). AE2 mRNA의 hybridization signal은 하비갑개의 상피세포층과 점막하분비선에서 관찰되었으나 비용조직에서는 발현되지 않았다(Fig. 3).

고     찰

   코점막의 상피세포에서 Na⁺ 수송체가 존재함이 많은 연구에서 밝혀져 있고 기능도 알려져 있다.^{1)2)3)4)5)7)8)} 따라서 비점막에 NHE와 AE 아형들의 mRNA 전사체가 존재할 수 있다고 예상되었으며, 이번 연구에서 비점막과 비용조직을 이용하여 이들 전해질 수송체에 대한 mRNA 아형들의 발현 및 분포를 관찰하였다. NHE1 mRNA는 정상비점막과 비용종에서 모두 존재하였고 NHE2와 NHE3 mRNA는 어느 조직에서도 발현되지 않았다. AE2 mRNA는 정상 비점막에는 존재하나 비용에서는 발현되지 않았고 AE1, bAE3, cAE3는 어느 조직에서도 관찰되지 않았다.
   Na⁺/H⁺ exchanger 아형들중 처음으로 밝혀진 NHE1은 거의 모든 세포와 조직에서 발현되나 NHE2와 NHE3의 분포는 NHE1보다 국한되어 있다.^6)10)11) 폐조직에서 NHE1 mRNA는 크고 작은 기관지 및 기관내의 상피세포에서 모두 발현된다. 그러나 NHE2와 NHE3는 모든 기관지의 상피세포에서 발견되지 않는다.¹⁴⁾ 위장관에서 NHE1 mRNA는 위장관 전장에 걸쳐 균일하게 존재하지만 NHE2와 NHE3 mRNA는 부위마다 다른 분포양상을 보인다.¹⁵⁾ 본 연구에서도 비갑개와 비용에서 NHE1 mRNA만이 상피세포층과 점막하분비선에 국한되어 발현되었으나 NHE2와 NHE3는 어느 조직에서도 발현되지 않았다. 코점막을 이용한 약리학 및 전기생리학적 실험에서 NHE의 존재가능성이 시사된 바 있는데, Paradiso 등¹⁶⁾¹⁷⁾은 선택적인 NHE blocker의 유무에 따른 pH변화를 통해 비점막 Na⁺/H⁺ exchanger의 존재를 제시하였다. Ikeda 등¹⁸⁾은 기니픽 코점막의 점막하분비선에서 세포내 Na⁺농도를 측정함으로서 NHE의 존재를 제시하였다. 이와 같은 결과들을 종합하면, 코점막에서 NHE의 아형들중 NHE1이 기존에 알려진 NHE의 기능 즉, 세포내 수소이온농도 조절, 세포 부피 및 세포 증식등의 다양한 세포기능을 할 수 있을 것으로 생각된다.
   많은 연구에서 여러 장기의 다양한 상피조직에서 AE2 아형이 발현된다는 것이 보고되었다.^12)13)19)20) 따라서 비점막에서도 음이온 교환체인 AE가 발현될 수 있다고 생각되었다. 본 연구결과 상피조직에서 발현되는 AE2 mRNA가 정상 하비갑개 점막에서 발현되었다. In situ hybridization으로 AE2 mRNA는 상피세포층과 점막하 분비선에서 발현되는 것을 확인 하였다. AE1은 적혈구의 세포막과 신피질 세뇨관의 type A intercalated cell의 주요한 단백질이고 AE3는 심근세포와 신경세포에서 주로 발현되는 단백질이다.¹³⁾ AE1과 AE3 mRNA는 역시 하비갑개 점막에서 발현되지 않았다. 한편 Smith 등⁹⁾은 short-circuit current를 측정하여 비점막에 AE가 존재함을 제시하였는데 본 연구 결과와 함께 종합하면 하비갑개 점막에서 AE2 아형이 AE의 기능을 할 수 있다고 제시된다.
   호흡기 상피세포의 세포내 pH 및 호흡기액의 pH의 조절기전은 코점막의 상피세포를 이용한 직접적인 실험보다는 기관지점막의 상피세포를 이용한 실험방법을 근거로 하여 간접적으로 유추 해석되어왔다.^6)8)10)11) 그러나 코점막의 상피세포나 비즙의 pH를 일정하게 유지하는데도 양이온과 음이온 교환체가 역할을 할 수 있다고 생각된다. Washington 등²¹⁾은 인체의 코점막에서 생리적인 pH는 혈장에 비하여 산성이고(전비공에서 pH 6.4, 후비공에서 pH 6.27) 비내로 유입되는 완충용액내 수소이온농도가 변하여도 일정하게 유지되며, Saccharin-taste time도 완충용액의 조성이 변하여도 크게 다르지 않다고 하였다. Fabricant 등²²⁾은 급성 감염성 비염과 알레르기성 비염에서 비점막 pH는 증가한다고 하였다. 이러한 관점에서 보면 콧물의 수소이온농도의 항상성을 유지시키는 것이 점액섬모수송기능을 포함한 코점막의 방어기전을 유지하는데 중요하다고 생각된다. 더나가서 코점막질환에 있어서 NHE1의 병태생리에 대한 직접적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
   호흡기의 점막에서 능동적인 sodium 흡수와 chloride 분비가 이루어지고 이들의 균형으로 세포를 통한 삼투압 현상에 의하여 수분 이동이 이루어진다는 것이 일반적인 정설로 받아 들여지고 있다. 낭성섬유증에서는 비정상적인 Na⁺의 이동이 하나의 발생기전으로 여겨지는데, 낭성섬유증에서는 CFTR과 Na channel 단백질의 상호작용이 이루어지지 않아 Na⁺의 이동이 증가하고 호흡기 점액의 점도가 증가한다고 알려지고있다.⁷⁾ 또한 Na⁺의 이동이 이루어지지 않을 경우 폐 삼출액의 배출이 원활히 이루어지지 않아 폐부종이 생긴다.²³⁾ 비용의 조직을 이용한 전기생리학적 실험에 근거하여 Bernstein 등³⁾⁴⁾은 비용의 상피세포에서 Na⁺의 이동이 증가함이 비용형성의 한 원인이라고 하였다. 면역조직화학염색방법으로 관찰한 결과 정상 비갑개점막에서 CFTR은 전형적으로 apical distribution을 보이는 반면 비용 및 술후 polypoid mucosa에서는 CFTR이 비균질적인 분포를 보인다고 보고되었다.²⁵⁾ 또한 본 연구에서는 정상 하비갑개 점막과 달리 AE2 mRNA가 비용조직에서 발견되지 않았다. 이러한 것을 종합하여 보면, 비용조직에서는 이온의 수송체가 변형되어 정상기능을 하지 못하고 이로 인하여 상피세포내로 전해질 및 수분이동에 장애가 발생할 수 있다고 생각된다.

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