교신저자：박병림, 570-749 전북 익산시 신용동 344-2  원광대학교 의과대학 생리학교실
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서     론

   중추신경계 뉴론에서 cFos 단백은 myc, jun, krox 등과 함께 일명 immediate early gene 단백이라 하며 세포내 대사활동성의 변화를 측정하는 표지자로 널리 이용되고 있다.¹⁾ Sodium nitroprusside(SNP)에 의한 급성 저혈압 유발시 뇌실주위핵(paraventricular nucleus, PVN), 시삭상핵(supraoptic nucleus, SON), 문측 복외측연수(rostroentrolateral medulla, RVLM), 고속핵(nucleus tractus solitarius, NTS)등에서 cFos 양성 뉴론이 관찰되었으며 전정기관에서도 이석기관의 선자극, 전정기관의 전기자극 및 일측 전정기관 손상에 의하여 전정신경핵과 뇌간신경핵들에서 cFos 단백이 발현되었다.²⁾³⁾
   한편 사지근육의 구심성 신경을 전기자극하여 혈압이 상승될 때와 심장을 직접 약물자극하여 혈압이 상승되었을 때도 전정신경핵에서 cFos 단백 발현이 관찰되었다.⁴⁾⁵⁾⁶⁾
   본 실험에서는 전정신경핵에서 혈압변화에 의한 cFos 단백 발현에 대한 생리적 의의를 추구하기 위하여 흰쥐를 대상으로 다음과 실험을 수행하였다. 첫째, SNP 투여에 의한 급성 저혈압시 전정자율반사에 중추적 역할을 하는 내측 전정신경핵에서 cFos, FosB, JunB, Krox 단백들의 발현을 확인하고 혈압 감소 정도 및 감소 속도의 변화에 따른 cFos 단백의 발현량에 차이가 있는지 확인하였다. 둘째, 말초혈관 수축제인 phenylephrine 투여에 의한 급성 혈압상승이 내측 전정신경핵에서 cFos 단백 발현을 유발하는 지 확인하였다. 셋째, 전정신경핵과 말초 전정기관의 혈액 공급 차단이 내측 전정신경핵에서 cFos 단백 발현에 어떤 영향을 미치는 지를 확인하고 이때 말초 전정기관의 역할을 확인하기 위하여 양측 말초 전정기관을 손상 후 cFos 단백 발현을 관찰하였다.

재료 및 방법

실험동물
   전정기능 검사를 마친 체중 200~300 g의 건강하고 성숙한 Sprague-Dawley계 흰쥐 90두를 암수의 구별 없이 사용하였다.

혈압측정
   Chloral hydrate 300 mg/kg를 복강내에 주사하여 마취하였으며 필요에 따라 소량을 추가 투여하였다. 혈압측정을 위하여 마취된 실험동물을 앙와위로 실험대에 고정 후 수술현미경하에서 일측 대퇴동맥을 박리, 분리한 후 polyethylene tube를 대퇴동맥에 삽입하였다. 삽입된 polyethylene tube는 혈압변환기(Gould Inc., Cleveland, OH USA)에 연결하여 physiograph(Grass Inc., Quincy, MA, USA)에서 증폭한 후 개인용 컴퓨터(Spike 2, Cambridge Electronic Design Ltd., Cambridge, UK)에 저장하였다. 이때 각 실험동물에서 정확한 혈압측정을 위하여 매 혈압 측정 때마다 혈압표준화 (BP calibration)를 실시하였다. 평균혈압은 "(systolic pressure+2 diastolic pressure)/3"에 의하여 산출하였다.

내이의 혈류측정
   혈압변동에 따른 내이혈류 변동을 측정하기 위하여 미세조작기에 고정된 레이저 탐침봉(laser probe, MP3 50 mm, Moor Instruments, Devon, UK)을 원형창 상방에 위치한 후반규관의 팽대부에 접근시켜 고정하였으며, 레이저 탐침봉의 끝부위와 팽대부 사이에서 수분이나 혈액이고이는 것을 예방하기 위하여 와셀린(petroleum jelly)을 사용하였다. 레이저 탐침봉은 Laser Doppler Perfusion Monitor (Moor Instruments, Devon, UK)에 연결하였으며, 시정수는 0.1 sec, 고주파수 차단영역은 15 kHz로 설정하였다. 한편 내이 혈류량의 변화는 혈압 변화 전 즉 안정시 Laser Doppler Perfusion Monitor의 전압수치에 대하여 혈압변화 후 Laser Doppler Perfusion Monitor의 전압수치에 대한 백분율로 환산하였다.

혈압 변동
   급성 저혈압을 유발할 목적으로 일측 대퇴정맥에 polyethlyene tube를 삽입하고 이곳을 통하여 sodium nitroprusside(SNP)을 투여하였다. 저혈압 유발정도를 변화시키기 위하여 SNP를 5, 10, 15 μg/kg의 약물농도로 사용하였다. 또한 출혈에 의한 저혈압을 유발하기 위하여 대퇴동맥으로부터 4 ml의 혈액을 2, 4, 5분 동안 서서히 채혈하여 약 50%의 혈압 감소를 유도하였으며, 이후 혈압을 원상으로 회복시키기 위해서는 채혈한 혈액을 다시 대퇴동맥을 통하여 주입하였다. 실험적으로 혈압을 상승시키기 위해서는 phenylephrine을 5, 15, 30 μg/kg를 대퇴정맥에 각각 투여하여 약물량의 변화에 따른 혈압변화를 기록하였다. 대조실험군생리식염수 0.5 ml를 대퇴정맥에 투여하였다.

양측 전정기관의 손상
   경부의 전측부를 절개한 후 측두골의 수포(temporal bulla)를 통하여 중이를 노출시키고 수술현미경하에서 원형창을 중심으로 파괴한 후 흡인펌프로 전정신경의 말단부위를 흡인하여 전정기관을 파괴하였으며, 양측 전정기관의 손상여부는 마취 회복 후 회전자극에 의해 전정안구반사의 출현 유무로 확인하였다.

Anterior inferior cerebellar artery(AICA) 폐쇄
   마취 후 실험동물을 앙와위로 고정하고 경부를 절개하고 기관 삽관술을 시행하였다. 수술현미경하에서 일측 외경동맥(external carotid artery)을 박리하고 수술용 실로 결찰한 다음 절단하였다. 이후 경부 근육들을 절단, 박리하여 두개골 기저부를 노출시켰다. 미세전동드릴을 이용하여 두개골 기저부를 절단한 다음 뇌간 기전부를 노출시키고 경막(dura mater)을 절개하였다. 미세조작기(micromanipulator)를 이용하여 microforcep을 AICA에 접근시킨 다음 microforcep으로 AICA를 폐쇄하였다. AICA의 폐쇄 여부는 수술현미경하에서 AICA혈류의 변화를 직접 확인하고 Laser Doppler Perfusion Monitor를 이용하여 내이에서 혈류량의 감소 유무로 확인하였다. 또한 AICA 폐쇄를 위한 모든 실험과정동안 대퇴동맥에서 혈압을 같이 기록하였다. 한편 sham 실험군은 모든 실험과정은 동일하게 실시하였으나 AICA 폐쇄는 실시하지 않았다.

면역조직화학검사
   혈압변동 2, 6, 12시간 후 동물을 희생하여 urethane(1 g/kg)으로 마취 후 pH 7.4의 phosphate buffered saline(PBS) 용액으로 심장을 관류하여 혈액을 제거하였으며, 다시 4% paraformaldehyde로 관류시킨 후 뇌를 분리하였다. 분리된 뇌는 4% paraformaldehyde에서 3시간 동안 실온에서 고정한 후 30% sucrose에서 2일 이상 방치하였다. Cryostat(Leica Instruments, Nussloch, Germany)를 이용하여 40 μm의 두께로 조직절편을 만들어서 세포내 peroxidase의 활성을 억제하기 위하여 6% H2O2용액에서 30분 동안 진탕하고, 그 후 pH 7.4의 PBS 용액으로 3회 이상 세척하고 0.3% Triton-X 100으로 30분간 진탕한 후 PBS로 3회 이상 세척하였다. 그 후 blocking agent(normal goat serum)를 실온에서 30분간 처리한 일차항체(cFos, AB-4, Oncogene, Darmstudt, Germany. 1：1000；FosB, sc-7203, JunB sc-73, Krox-24, sc-110, Santa Cruz Biotechology Inc., SantaCruz, CA USA)를 4℃에서 하룻밤 동안 반응시킨 후 2시간 동안 실온에서 진탕시키고 PBS로 세척하였다. 그 후 이차항체인 biotinylated anti-rabbit & anti-mouse immunoglobulin을 실온에서 40분간 처리하여 PBS로 세척하고, streptavidin peroxidase(Vector Lab, Burlingume, CA, USA)를 20분간 처리하여 PBS로 세척한 뒤 chromogen인 0.05% diaminobenzidine으로 발색하였다. PBS로 1시간 동안 세척한 후 조직을 slide glass에 부착하여 건조하고 탈수과정을 거쳐 cover slide을 덮어 광학현미경하에서 진갈색의 cFos 양성 뉴론를 관찰하였고 화상자동분석시스템(Image-Pro Plus, MediaCybernetics Inc., Silver Spring, MD, USA)을 이용하여 cFos 양성 뉴론 수를 측정하였다.

통계의 분석
   각 실험군 간의 통계처리는 Kruskall-Wallis test와 Mann-Whitney U test를 이용하여 p값이 0.05 이하인 경우에 유의성이 있는 것으로 간주하였다. 

결     과

저혈압에 의한 내이 혈류량의 변화와 내측 전정신경핵에서 Immediate early gene 단백의 발현
   전정기관이 정상인 동물의 평균 동맥혈압은 97.3±12.6 (mean±S.D.) mmHg이였으며, SNP을 정맥 투여하면 약물투여 60초 이내에 혈압이 최저로 감소하였으며 이후 빠르게 정상으로 회복되었다. SNP의 투여 량이 증가하면 혈압의 저하도 증가하였는데 5 μg/kg 투여했을 때 87.2±3.8 mmHg로 약 10%의 혈압 감소, 10 μg/kg 투여하면 68.4±4.2 mmHg로 약 30%의 혈압 감소, 15μg/kg 투여하면 49.2±3.1 mmHg로 약 50% 이상의 혈압 감소가 관찰되었다.
   SNP 투여량이 증가함에 따라서 내측 전정신경핵에서 cFos 양성 뉴론의 발현양이 유의하게 증가되었으며 10 μg/kg 투여하였을 때 95.6±24.9 개의 뉴론이 cFos 단백 양성으로 유의하게 증가되었다(p<0.01).
   또한 내측 전정신경핵에서 동맥압 감소가 심할수록 cFos 양성 뉴론의 분포가 내측 전정신경핵의 중심부와 하부 전정신경핵과 인접한 부위로 확대되었다(Fig. 1).
   혈압의 감소속도 차이에 따른 내측 전정신경핵에서 cFos 단백 발현을 관찰하기 위하여 SNP 투여에 의하여 60초 이내에 약 50%의 빠른 혈압강하와 출혈에 의하여 2, 4, 5분 동안 약 50%의 느린 혈압 감소를 유도하였다. 이때 내측 전정신경핵에서 혈압의 감소속도가 빠르면 빠를수록 내측 전정신경핵에서 cFos 단백의 발현이 유의하게 증가하였다(p<0.05)(Fig. 2).
   SNP 투여 후 시간의 경과에 따른 내측 전정신경핵에서 cFos 단백 발현량을 관찰하였을 때 SNP 투여 2시간째에 최대로 발현되었고 시간이 경과되면서 급격히 감소되어 SNP 투여 12시간 후에 거의 정상으로 회복되었다(Fig. 3). 
   다른 immediate early gene 단백들의 발현을 확인할 목적으로 SNP 정맥 투여 2시간 후 내측 전정신경핵과 ADH를 분비하는 시삭상핵에서 cFos, FosB, JunB, Krox 단백에 대한 면역조직화학 검사를 실시하였다. SNP 투여에 의한 저혈압시 내측 전정신경핵에서는 cFos 단백만 선택적으로 발현되었으나 시삭상핵에서는 이들 immediate early gene 단백들의 발현이 모두 이루어짐으로써 cFos 단백만이 내측 전정신경핵에서 혈압감소에 의하여 선택적으로 발생되는 immediate early gene 단백이였다(Fig. 4).

급성 고혈압에 의한 내이 혈류량의 변화와 내측 전정신경핵에서 cFos 단백의 발현
   Phenylephrine 투여에 의하여 혈압은 약물 투여 10~20초 이내에 증가되었으며 1~2분 이내에 정상으로 회복되었다. 체중 kg당 5, 15, 30 μg을 정맥 투여하였을 때 최고 혈압은 각각 114.1±4.2, 134.9±2.6, 145.9±3.1 mmHg이였다. 내이 혈류량은 약물 투여 전 값을 100으로 기준 하였을 때 phenylephrine를 5, 15, 30 μg/kg을 정맥투여해서 각각 117.2±1.2, 137.5±2.2, 150±2.5%의 증가를 보여 용량 의존성이 관찰되었다. Phenylephrine 투여 2시간 후에 내측 전정신경핵에서 cFos 단백의 발현은 5 μg/kg 투여하였을 때 거의 발현되지 않았으며 15 μg/kg 투여하였을 때 12.3±3.5개(p<0.05), 30 μg/kg 투여하였을 때 45.2±12.9개(p<0.01)를 보여 생리식염수를 투여한 대조군과 유의한 차이가 있었다(Fig. 5).

Anterior inferior cerebellar artery(AICA) 폐쇄에 의한 내이 혈류량의 변화와 내측 전정신경핵에서 cFos 단백의 발현
   AICA 폐쇄 직후 혈압은 변화하지 않았으나 내이 혈류량은 폐쇄전과 비교하여 68.5±6.2% 감소를 보였다. 전정기관이 정상인 실험동물의 AICA를 폐쇄하면 AICA 폐쇄 반대측과 동측의 내측 전정신경핵에서 cFos 양성 뉴론의 수는 각각 87.2±30.83, 116.3±31.3개로 반대측에서 많이 발현되었으나 유의한 차이는 없었다, 그러나 대조실험군에 비교하여 양측 모두 유의한 증가를 보였다(p<0.01). 양측 말초전정기관이 손상된 실험군에서 AICA 폐쇄에 의하여 AICA 폐쇄 반대측과 동측의 내측 전정신경핵에서 cFos 양성 뉴론의 수는 각각 26.5±2.1, 67.5±17.7개로 반대측에서 많이 발현되었으나 유의한 차이는 없었다, 그러나 대조실험군에 비교하여 양측 모두 유의한 증가를 보였다(p<0.01). 한편 말초전정기관이 정상인 실험군과 비교하였을 때 양측 내측 전정신경핵에서 유의하게 감소되었다(p<0.05)(Fig. 6).

고     찰

   급성 저혈압에 의한 뇌혈류량의 변화에 대한 연구들에서 동맥압이 50% 이상 감소하는 경우에 뇌혈류량이 유의하게 감소되나 50% 미만 감소할 경우 뇌혈류량의 유의한 감소가 관찰되지 않았다.^7)8)9)10) 이러한 현상은 뇌혈류량의 변동을 자동적으로 조절하는 자동조절 시스템에 기인한다. 동맥압 감소시 내이에 위치하는 와우의 혈류량은 동맥압의 감소와 비례적으로 감소한다고 알려져 있다.^7)8)9)10) 본 실험에서 전정기관이 정상인 실험동물에서 SNP의 투여량과 비례하여 혈압 및 내이 혈류량이 저하하여 혈압과 내이 혈류량 사이에 상관성이 있다는 상기 실험결과와 일치하였다. 이를 근거로 SNP에 의하여 동맥압이 10~30% 감소한 경우 뇌간의 혈류량은 감소하지 않고 말초 전정기관의 혈류량이 감소되었을 것으로 추측할 수 있다.
   내측 전정신경핵에서 cFos 양성 뉴론이 혈압이 감소하면 유의하게 증가될 뿐 만 아니라 cFos 양성 뉴론의 발현분포가 내측 전정신경핵 중심부에서 주변으로 확대되는 양상을 보였다. 그리고 혈압의 감소속도가 빠를수록 내측 전정신경핵에서 cFos 단백의 발현이 유의하게 증가하였다. 따라서 상기 실험결과와 cFos 단백이 뉴론활동성의 표지자라는 점을 고려할 때 SNP 투여에 의한 내측 전정신경핵에서 cFos 단백의 발현은 전정신경핵 뉴론들의 자발활동성의 증가, 즉 흥분성의 증가를 반영하는 것으로 사료된다.
   Chan와 Sawchenko는 흰쥐에서 뇌간신경의 카테콜아민성 신경세포군과 뇌실주위핵, 시삭상핵 등에서 cFos 단백이 SNP 투여 및 출혈에 의한 혈압감소 2~2.5시간 후에 최대로 발현되었으며 그 이후 현저히 감소됨을 보고하였다.¹¹⁾ 본 실험에서도 내측 전정신경핵에서 SNP 투여 2시간째에 cFos 단백이 최대로 발현되었으며 시간이 경과되면서 급격히 감소되어 SNP 투여 12시간 후에는 거의 발현되지 않아 상기 연구와 유사한 결과를 보였다. 본 실험결과 중 cFos, FosB, JunB, Krox 단백에 대한 면역조직화학 검사에서 SNP에 의한 저혈압시 내측 전정신경핵에서 cFos 단백만 발현되었으나 시삭상핵에서는 이들 immediate early gene 단백들의 발현이 모두 이루어졌다. 이상의 결과로 보아 내측 전정신경핵에서 cFos 단백의 시공간적 발현변화는 혈압감소 및 자율신경계 반사의 변화를 측정할 수 있는 분자생물학적 표식자로 사용될 수 있을 것으로 사료된다.
   Phenylephrine 투여에 의하여 혈압 및 내이 혈류량의 증가와 함께 내측 전정신경핵에서 cFos 단백의 발현이 유발되었다. 그러나 혈압이 10% 상승되었을 때 cFos 단백의 발현이 미약하였고 50% 이상 혈압 상승이 진행되었을 때 50개 미만의 cFos 양성 뉴론이 관찰되었다. 이러한 고혈압과 저혈압에 의한 내측 전정신경핵에서 cFos 단백 발현량의 차이는 흰쥐에서 phenylephrine 정맥투여에 의하여 40 mmHg 이상 증가되었을 때 고속핵에서 cFos 단백 발현이 미약하였으나 hydralazine에 의한 저혈압 시 고속핵, 측뇌실핵에서 cFos 단백 발현량이 phenylephrine 투여에 의한 고혈압때와 비교하여 유의하게 증가했다는 연구자들의 실험결과와 유사하였다.¹¹⁾¹²⁾
   쥐에서 AICA 폐쇄에 의한 동측 전정신경핵 혈류량은 32% 감소하였으며 와우신경핵의 혈류량은 47% 이상 감소하였다.¹³⁾ AICA를 30분간 폐쇄 후 뇌간에서 microtubule-associated protein에 대한 면역조직화학 염색법을 이용하여 허혈 정도를 평가하였을 때 전정신경핵에서 약한 허혈 반응이 관찰되었으며 와우신경핵에서는 전정신경핵보다 심한 허혈 반응을 보였다.¹⁴⁾
   한편 Park 등은 SNP 유도성 저혈압에 의한 내측 전정신경핵의 cFos 단백 발현에 대한 말초 전정기관의 역할에 대한 연구에서 일측 말초 전정기관이 손상된 실험동물에서 손상측의 동측 전정신경핵에서 cFos 단백의 발현이 현저히 감소하였으며 양측 전정기관이 손상된 실험군의 양측 전정신경핵에서 cFos 단백의 발현이 거의 관찰되지 않았다고 보고하였다.¹⁵⁾ 따라서 AICA 페쇄에 의한 내측 전정신경핵에서 cFos 단백 발현에 대한 본 실험결과는 내측 전정신경핵에서 cFos 단백의 발현에서 말초 전정기관의 흥분이 중추 전정기관의 흥분보다 중요하다는 Park 등의 실험결과를 뒷받침해주는 것으로 사료된다.¹⁵⁾
   이상의 실험결과로 보면 중추 전정신경핵이 두부 및 사지의 위치변화에 의한 말초 전정기관의 내임파액(endolymph)의 움직임에 의한 유모세포(hair cell)의 흥분과 혈압변화에 의한 혈류량의 변화에 흥분할 수 있다는 생리학적 의의를 부여할 수 있을 것이다. 또한 임상적으로 혈관성 어지러움증에서 혈압의 급격한 변화, 혈류량의 변화에 의한 말초 전정기관의 기능변화가 중요한 원인중의 하나임을 제시하는 실험적 근거가 될 것으로 사료된다.

결     론

   저혈압 및 고혈압에 의하여 내측 전정신경핵에서 cFos 단백이 선택적으로 발현되며 중추 전정기관의 허혈성 반응보다는 말초 전정기관의 허혈성 반응이 cFos 단백의 발현에 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다.

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