교신저자：이정구, 330-714 충남 천안시 안서동 산16-5  단국대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   바이러스성 또는 세균성 감염에 의해 중이강내에 유리된 염증매개물질은 중이염의 병발에 중요한 역할을 하며 내이의 구조적 변화 뿐만 아니라 기능적 변화를 초래할 수 있는 것으로 알려져있다. 이러한 염증매개물질에는 histamine, prostaglandine(PGs), leukotriene(LTs), platelet-activating factor(PAF), kinin, lysosomal enzyme, hydrolytic enzyme, protease등이 있다. 최근 연구에서는 PGs와 LTs와 더불어 분비성 중이염의 병인에서 PAF의 역할이 강조되고 있다. PAF는 LTB4, LTC4와 더불어 중이염의 급성 염증과정에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다.
   분비성 중이염, 만성 화농성 중이염, 진주종성 중이염, 육아종성 중이염 등의 중이 질환의 일부가 감각신경성 난청을 유발하나, 이러한 감각신경성 난청이 오는 기전은 잘 알려져 있지 않으며, 세균성 감염, 내독소, 염증매개체, 면역반응 등이 원인으로 추정되고 있다. 정원창막은 중이와 내이를 경계짓는 유일한 연부조직으로서 다양한 물질들이 이를 통하여 내이로 투과되어 중이염과 관련된 감각신경성 난청 및 내이질환을 유발하는 것으로 추정되고 있다.¹⁾ 중이염이 존재할 때 중이강내로 분비되는 PAF는 중이염의 병발에 중요한 역할을 하며 내이의 구조적, 기능적 변화를 초래한다.²⁾ PAF를 정원창막을 통하여 투과시키거나 전신적으로 투여하였을 때³⁾ 청력소실이 유발된다.
   감각기관, 신경계 등 다양한 세포 및 조직들에서 PAF 수용체의 존재가 밝혀져 왔으며,⁴⁾ 최근 연구에서는 PAF가 과량 생성되었을 때는 내인성 신경독소로 작용하며,⁵⁾ 상피세포, 와우유모세포 등에 세포독성을 나타낸다는 것이 알려져 있다.⁶⁾
   최근 연구에서는 PAF가 nitric oxide synthase(NOS)를 자극하여 nitric oxide(NO)를 분비하도록 하며 이를 매개체로 하여 내독성 쇼크, 내장손상 등을 일으키고, 심혈관 및 호흡기에서 미세혈관 투과성을 증가시키는 것으로 알려져 있다.⁷⁾ L-arginine으로부터 NO를 합성하는 NOS에는 neuronal NOS(nNOS, type 1), inducible NOS(iNOS, type 2), endothelial NOS(eNOS, type 3)가 있다. 청각기관에서는 세 가지 NOS 모두가 코티씨 기관을 비롯한 여러 부분의 다양한 세포들에 존재하는 것이 guinea pigs를 이용한 실험에서 면역화학적으로 증명되었다.⁸⁾ nNOS와 eNOS는 내피세포, 신경 세포, 심근 세포와 같은 세포 내에 상존하여 외부의 자극에 의하여 활성을 갖는 것으로, Ca2+와 calmodulin(CaM)의 존재하에서 활성화되어 소량의 NO를 계속 생성할 수 있다. 반면 iNOS는 간 세포, 혈관 평활근 세포, 섬유 아세포 또는 마우스의 대식 세포 와 같은 세포들에서 면역학적 자극이나 염증성 자극에 의하여 새로이 합성되어 발현되는 것으로, 칼슘에 비의존적이고 이들 세포에서는 다량의 NO를 생성한다. NO는 그 자체가 하나의 활성기로서 superoxide와 반응하며, 지속적인 NO의 분비는 정상조직에 손상을 초래하여 병적상태를 일으킬 수 있다.⁹⁾
   본 연구에서는 중이강에 유치한 PAF가 정원창막을 통하여 와우외림프공간으로 투과되어 와우의 기능적, 형태적 변화를 유발함으로써 청력소실이 유발되는 데 이는 PAF에 의해 자극된 NOS에 의해 생성된 NO에 의해 매개되는 것으로 가정하였다. 본 연구에서는 기니픽의 정원창에 PAF를 유치시켜 와우의 형태적 변화 및 청력의 변화를 관찰하고, PAF에 의한 변화가 NO에 의해 매개되는 지를 iNOS 발현에 대한 면역조직화학검사로 관찰하고자 하였다.

재료 및 방법

대상군
   실험 동물은 체중 250~300 g의 외견상 건강하고, 수술 현미경 소견상 중이 및 외이도에 염증 소견이 없으며, 청성뇌간유발반응검사상 정상 소견을 보이는 guinea pig 36마리(72귀)를 사용하였다. 실험 동물들은 무작위로 추출하여 1) 정상대조군 6마리, 2) PAF군 30마리로 나누었고 PAF군은 PAF의 농도에 따라 10마리씩 다시 3개의 군으로 나누었다.

방  법

마  취
   수술시 마취제로 ketamine hydrochloride(30 mg/kg)과 xylazine hydrochloride(2 mg/kg)을 근육 주사하여 guinea pig의 자가호흡을 유지한 상태로 움직이지 못하도록 고정하였고, 필요에 따라 유지량으로 최초 용량의 반을 추가 근육 주사하였다.

PBS 및 PAF의 투과
   실험 전에 청력역치를 측정한 후 기니픽의 이낭의 후하방을 통하여 정원창에 접근하였다. 정상대조군에게는 Phosphate buffered saline(PBS) 5 μl를 gelfoam 조각(Upjohn, Kalamazoo, MI)에 묻힌 후 정원창에 놓았고, PAF군의 경우 PAF(Sigma, St. Louis, MO)를 10, 20, 40 μg/ml의 농도로 10 μl씩 gelfoam 조각에 묻힌 후 정원창에 놓았다. 이 과정에서 고막 및 이소골은 손상되지 않도록 유지시켰다.

청성뇌간유발반응검사
   각 군은 실험 직전 기저 청력 역치를 측정하였고, PBS와 PAF를 정원창에 유치시킨후 3, 6, 9, 12, 24시간째에 청력 역치를 측정하였다. 기니픽의 청력검사는 청성뇌간유발반응검사(Nicolet Spirit 2000, Nicolet Biomedical Inc. Madison, WI)로 실시하였다. 전위는 피하세침전극을 두정부와 유양동 부위에 삽입하여 측정하였으며, 자극음은 1,000 msec펄스의 교대 극성에 의해 생성된 광역밴드의 클릭음을 31.1/sec의 비율로 TDH 39 earphones(Nicolet Biomedical Inc. Madison, WI)을 통해 귀에 삽입하여 주었고, 청성뇌간유발반응은 증폭 및 100~3000 Hz의 Band Pass Filter로 여과되었다. 클릭 강도는 90 dB SPL에서 시작하여 청성뇌간유발반응이 나타나지 않을 때까지 10 dB씩 감소시켜 측정하고, 반응이 나타나지 않으면 다시 5dB을 높여 반응이 나타나는 지 확인하였다. 청력역치는 측정 가능한 파형의 wave Ⅴ를 보이는 최저자극역치로 결정하였다.

주사전자현미경
   실험을 시작하고 24시간 경과 후, 청성뇌간유발반응검사를 시행하고, 주사전자현미경 검사를 위해 PBS 대조군과 20 μg/ml PAF군에서 2마리씩 2.5% glutaraldehyde를 대동맥 카테터를 통해 심장내 관류를 시행하였다. 실험 동물을 단두하여 양측 측두골을 얻은 뒤 와우를 채취하였다. 섭씨 4도, 0.1 M phosphate 완충액 2.5% glutaraldehyde로 일차 고정액을 사용하여 외림프강을 관류시키고 otic capsule에 구멍을 내었다. 생체외 관류는 고실계에 낸 구멍을 통하여 난원창으로 시켰으며 관류 후, 정원창을 제거한 와우를 4℃ 냉장고에 하루 동안 액침시켰다. Glutaldehyde로 하루밤 고정시킨 후, 와우를 0.1M phosphate 완충액으로 고실계에 낸 구멍을 통하여 씻어내었다. 이 과정을 3번한 후 1.5% OsO4로 후고정 하였다. 이어서 광학현미경하에서 와우의 골피막을 제거하고, 채취된 조직을 50%, 70%, 85%, 95%, 100% 에탄올로 점차 농도를 높여가며 탈수하고 임계점 건조기(Critical point dryer, Hitachi HCP-2, Tokyo, Japan)로 건조시킨 후, 13 mm platinum으로 도포된 stub 위에 위치시킨 후, 주사전자현미경(Hitachi S-2500, Tokyo, Japan)을 이용하여 관찰하고 Polaroid type 55 land film으로 촬영하였다.

면역조직화학검사
   실험을 시작하고 24시간 경과 후, PBS 대조군과 20 μg/ml PAF군에서 2마리씩 ketamine hydrochloride(30 mg/kg)와 xylazine hydrochloride(2 mg/kg)로 깊게 마취한 후 pH 7.4 0.1 M phosphate 완충액 4% paraformaldehyde를 대동맥 카테터를 통해 심장내 관류를 시행하였다. 실험 동물을 단두하여 양측 측두골을 얻은 뒤 와우를 채취하였다. 와우는 첨부에 구멍을 내고 고정액을 잘 투과시키기 위하여 정원창막을 제거하였고 pH 7.4 0.1 M phosphate 완충액 4% paraformaldehyde로 4℃ 냉장고에 하루 동안 액침시켰다. 그 후 pH 7.0 Tris 완충액 10% EDTA 용액으로 4℃ 냉장고에 1주일 동안 액침시켜 탈석회화시켰다. 조직은 면역조직화학검사를 위하여 파라핀에 고정하였다.
   파라핀 고정 검체는 microtome(Leica, jung RM 2035, Nussloch, Germany)를 이용하여 5 μl 두께로 절단하였다. 검체는 순수 에탄올로 각 1분씩 2회, 95% 에탄올로 2회 탈파라핀화와 재수화하였다. 0.3% H₂O₂ PBS에 4℃하에서 20분간 액침시킨 후 PBS로 5분간 씻었다. 10분간 가습용기 안에서 정상 토끼 혈청으로 전처치한 후, DAKO 항체 희석액(DAKO corp. Carpinteria, CA)에 1：1500 비율로 희석한 iNOS에 대한 토끼의 다복제 항체(NOS II：rabbit polyclonal antibody, anti-macrophage NOS poptide(SA-200) Biomol, Hambur, Germany)에 4℃하에서 1시간동안 배양하였다. 검체는 PBS로 5분간 씻은 후 정상 토끼 혈청으로 5분간 다시 배양하였다. Biotin-labeled anti-rabbit IgG로 20분간 배양한 후, strepta-vidin-conjugated peroxidase로 20분간 배양하였다. DAB-substrate solution(Zymed, San Francisco, CA)에 5분간 배양한 후 흐르는 물로 씻었다. Hematoxilin 용액으로 3분간 처치한 후 다시 씻었다. 95% 에탄올, 100% 에탄올, 100% 크실렌에 각각 매우 빠르게 액침시켰다. 항체가 붙어있는 모습은 H₂O₂와 diaminobenzidine 반응으로 시각화되었다. Olympus 표준 광학현미경을 이용하여 관찰하고 촬영하였다.

분석 및 통계 처리
   각 군에서 청성뇌간유발반응검사상 기저 청력역치와 실험후 3, 6, 9, 12, 24시간에서의 청력역치의 변화값을 평균±표준편차로 표시하였고, 각 군사이의 청력 역치의 변화를 비교하기 위하여 repeaded measures ANOVA법을 이용하여 5% 유의수준에서 통계적 분석을 하였다.

결     과

청성뇌간유발반응검사
   대조군으로 설정한 PBS군은 실험전 기저 청력역치와 24시간 동안의 청력역치의 변화치는 5 dB SPL 범위안에서 변동하였다.
   10 μg/ml PAF군에서는 3시간 후 6.5 dB SPL로 역치가 상승하였으며 그 후 24시간까지 6.5~11.0 dB SPL 범위에서 변동하였다. 9시간 후 역치는 10.5 dB SPL로 PBS 대조군과 유의한 차이를 보였고, 24시간까지 유의한 청력역치의 차이를 계속하여 보였다(p<0.05).
   20 μg/ml PAF군에서는 3시간 후 19.8 dB SPL로 역치가 상승하였으며 그 후 24시간까지 19.8~21.8 dB SPL 범위에서 변동하였다. 이 군에서의 청력역치의 변화는 PBS 대조군(p<0.001) 및 40 μg/ml PAF군(p<0.05)과 24시간 동안 유의한 차이를 보였다.
   40 μg/ml PAF군에서는 3시간 후 23.3 dB SPL로 역치가 상승하였으며 그 후 24시간까지 23.3~27.8 dB SPL 범위에서 변동하였다. 이 군에서의 청력역치의 변화는 PBS 대조군(p<0.001), 10 μg/ml PAF군(p<0.001) 및 20 μg/ml PAF군(p<0.05)과 24시간 동안 유의한 차이를 보였다(Table 1, Fig. 1).

주사전자현미경 소견
   PBS 대조군에서는 정상적인 와우의 내·외유모세포들이 변형 없이 규칙적으로 배열되어 있었다(Fig. 2).
   20 μg/ml PAF군에서는 세 열의 외유모세포들이 심하게 손상되었는데, 세 번째 열의 손상이 가장 심하였고 첫 번째 열의 손상이 덜하였다. 세 열의 외유모세포들의 대부분에서 입체섬모의 파괴, 휘어짐, 융합을 보였다. 내유모세포는 경도의 융합과 중등도의 휘어짐을 보였다(Fig. 2). 와우의 기저부, 중간부, 첨단부 사이의 손상 정도의 차이는 관찰되지 않았다.

면역조직화학검사
   PBS 대조군에서는 iNOS에 대한 면역염색에서 전체 와우에 걸쳐 미미한 반응을 보였다(Figs. 3 and 4).
   20 μg/ml PAF군에서는 내·외유모세포, Deiter 세포, Hensen 세포 등을 비롯한 코티씨 기관에서 iNOS에 대한 면역반응성을 보였다(Fig. 5A). 혈관조와 나선인대에서도 iNOS에 대한 면역반응성을 보였으며(Fig. 5B), 나선신경절세포에서도 면역반응성을 보였다(Fig. 5C). 전체적으로 면역반응성은 와우의 기저부에서 첨단 회전부보다 강한 반응을 보였다(Fig. 3). 20 μg/ml PAF군에서 코티씨 기관은 내·외유모세포의 휘어짐으로 인해 전체적으로 와해되어 보였다(Fig. 3).

고     찰

   사람의 중이삼출액에서 검출되는 PAF의 양은 장액성 삼출액에서는 32 μg/ml, 점액성 삼출액에서는 8 μg/ml, 화농성 삼출액에서는 6 μg/ml수준이며,²⁾ 본 연구에서 정원창에 유치한 PAF의 농도는 10~40 μg/ml로 생리적 범위의 농도로 실험하였다. 본 연구에서는 PAF가 정원창에 24시간만 노출되었지만, 중이삼출액에 함유된 PAF는 몇 달 이상 지속적으로 노출될 수 있다.
   저자들의 본 연구에서는 정상적인 정원창에 PAF를 유치시켜 와우의 유모세포의 손상과 뇌간유발반응 청력검사상청력역치의 상승을 유발하였다. 다른 연구에서와 같이 PAF가 중이강에서 내이로 투과되어 청력역치의 변화를 가져온 것으로 생각된다. 정원창을 통하여 PAF를 투과시키는 것은 혈관내 주사를 통하여 넣는 것에 비하여 전신적인 독성효과를 피할 수 있고, 와우에 직접 전달되며, 전신작용에 의해 나타나는 결과와 혼동을 피할 수 있고, 정상적인 와우에 비침습적이고 자연스럽게 실험을 할 수 있다는 장점을 가지고 있다
   본 연구는 정원창에 유치한 다양한 농도의 PAF가 농도에 비례한 청력역치의 상승과 다양한 정도의 와우유모세포의 손상을 유발하는 것을 확인하였다. 주사전자현미경 소견에서 PAF군에서는 다양한 정도의 와우유모세포의 손상을 확인하였다. 20 μg/ml PAF군에서 코티씨 기관은 PBS 대조군과 비교해서 전체적으로 와해된 모양을 보였고(Fig. 3), 이러한 소견은 유모세포의 휘어짐과 파괴를 보인 주사전자현미경사진 소견과 일치하였다. 코티씨 기관은 중간부나 첨단부에 비해 기저부에서 더욱 와해되는 소견을 보였다. 이것은 코티씨 기관의 손상이 첨단부쪽보다 기저부쪽이 심하다는 것을 의미하며, PAF를 정원창막쪽에 유치하였기 때문에 예상되었던 결과이다. 그러나 주사전자현미경상에서는 이러한 소견이 명확하지 않았는데 이는 유모세포의 휘어짐의 미세한 차이를 주사전자현미경으로는 인식하기 어렵기 때문으로 생각된다.
   면역조직화학검사에서 PAF군에서는 코티씨 기관, 혈관조, 나선신경절세포에서 PBS 대조군에 비하여 높은 iNOS의 발현을 확인하였다(Fig. 5). 이것은 PAF가 와우에서 NO를 분비하도록 iNOS를 자극한다는 증거가 된다. 최근 많은 면역조직화학연구에서 지방다당질, 내독소, 종양괴사물질로 기니픽에서 유발되는 염증과⁸⁾¹⁰⁾ 인간 와우에서의¹¹⁾ 내·외유모세포, Deiter세포와 Hansen세포같은 지지세포들, 혈관조, 나선신경절세포에서 iNOS에대한 면역반응성에 대해 규명하였다. 와우와 유리된 내·외유모세포에서의 NO의 생성은 새로운 형광지시자인 4,5-diaminofluorescein diacetate로 확인되었다.⁸⁾ 본 연구의 결과를 통해 다른 연구들의 결과를 재확인할 수 있었다.
   이전의 연구들은 과도하게 집적된 PAF가 신장,¹²⁾ 심장,¹³⁾ 간,¹⁴⁾ 신경세포⁵⁾ 등과 같은 다양한 기관들에 조직손상을 일으키는 것을 확인하였다. 최근 연구들은 표피세포, 섬모세포같은 다양한 세포들에 대한 PAF의 세포독성을 확인하였다. PAF는 유리된 와우유모세포를 부풀리고 터져서 죽게하였다.⁶⁾ PAF를 정맥주사하였을 때는 외유모세포가 액포화되고 세포질이 부풀어 오르는 것으로 관찰되었다.³⁾ PAF가 청력소실을 일으키는 것은 여러 연구들에서 확인되었다.³⁾ 본 연구에서는 정원창에 유치한 PAF가 정원창막을 통해 와우로 투과되어 청력소실과 와우유모세포의 손상을 일으키는 것을 확인하였다. 이러한 사실들로 미루어 볼 때 중이에서 증가된 PAF가 와우에 직접적으로 작용하여 내이손상을 일으키는 것으로 생각할 수도 있다. 그러나 본 연구의 결과로 미루어 볼 때 PAF의 역할은 NO에 의해 매개되는 것으로 생각할 수 있다.
PAF는 혈관수축과 혈장삼출을 동반하는 모세혈관손상을 일으키는 것으로 알려져 있으며, PAF에 의해 유발되는 혈장삼출은 NO에의해 매개되는 것으로 보고되었다.⁷⁾ iNOS에 의해 생성된 다량의 NO가 와우혈류량과 혈관투과성에 손상을 가져올 수 있다.¹⁵⁾ NO는 정상 와우의 항상성을 조절하는 데 기여하고 이독성 기전에 관여한다. 와우혈류의 변화는 궁극적으로 청력소실을 유발한다. 본 연구에서 확인한 PAF로 유발된 청력소실은 부분적으로는 NO의 분비로 유발된 와우혈류의 변화에 기인되었다고 생각할 수 있다.
   많은 최근 연구들에서 NO가 내이에 이중적인 역할을 하는 것을 확인하였다. 한 가지는 허혈성 또는 저산소 상황에서 내이 생리를 유지하거나 호전시키는 역할이며,¹⁵⁾ 다른 한 가지는 지방다당질 또는 내독소에 의해 유발된 염증 상황에서 분비된 과량의 NO가 이독성을 나타내는 것이다.¹⁰⁾ NO는 포유동물의 와우에서 신경전달,¹⁶⁾ 혈류조절,¹⁵⁾ 병적 상황에서 세포독성의 유발¹⁰⁾ 등에 관여한다. 유리된 외유모세포에 NO 생성 화합물을 노출시키면 가역적인 팽창과 단축을 보인다.¹⁷⁾ 내이에서의 과다한 NO의 생성은 복합활동전위의 현저한 저하를 일으키고, 코티씨 기관에서 유모세포와 지지세포들의 광범위하고 심한 형태적 변화를 초래한다.¹¹⁾ 폐고혈압을 가진 신생아에서 NO 흡입 치료 후 청력소실이 관찰되었다.¹⁸⁾ 쥐의 간을 이용한 실험에서 지방다당질 주사 4시간 후 NO가 최고치를 보였고,¹⁹⁾ 4시간에서 10시간까지 비슷한 수치를 보였다.²⁰⁾ PAF 군에서는 실험 3시간 후에 청력역치의 최고치를 보이고 12시간에서 24시간까지 비슷한 수치를 보였다. 본 연구에서 청성뇌간유발반응검사상의 청력역치의 변화는 쥐의 간을 이용한 실험에서 NO수치의 변화와 일치하는 결과를 보였다. 이러한 사실들에 기초하여 볼 때 PAF의 와우에 대한 자극으로 인해 과다하게 분비된 NO는 이독성을 나타내고, 본 연구에서처럼 PAF로 유발된 염증상황에서 청력소실과 와우손상을 나타내는 것으로 생각할 수 있다.

결     론

   PAF를 기니픽의 정원창에 유치시킨 결과, 농도에 비례하여 청성뇌간유발반응검사상 청력역치가 경도에서 중등도 상승하였으며, 와우 유모세포에 다양한 정도의 손상을 보였다. 면역조직화학검사상 PBS 대조군에 비교하여 유의한 차이의 iNOS에 대한 면역반응성을 보였다. 이 결과로 미루어 볼 때 PAF에 의해 유발되는 와우의 기능적·형태적 변화는 PAF의 자극에 의해 분비된 NO에 의해 매개되는 가능성이 있다고 생각된다. 추후 PAF에 의해 유발되는 와우의 기능적·형태적 변화가 PAF 길항제나 iNOS 길항제로 억제되는 지에 대한 연구 등이 광범위하게 있어야 할 것으로 생각되며, 이러한 결과들은 임상적으로도 많은 의의가 있을 것으로 생각된다.

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