교신저자：박선호, 700-712 대구광역시 중구 동산동 194  계명대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   활성산소는 생체 내의 에너지 생성 과정, 정상적인 신진대사 과정 및 면역 체계를 통해 생성되는 쌍을 이루지 않는 전자를 가진 분자로서, 이들 없이는 에너지를 생성하지도 감염원과 싸우지도 못할 뿐만 아니라 신체에 필요한 화학 물질도 생성하지 못한다.¹⁾ 그러나 과잉의 활성산소는 염증반응뿐만 아니라 고혈압, 심장질환, 암, 노화 및 신장질환 등의 퇴행성 질환을 유발하는 것으로 알려져 있다.²⁾ 인체는 superoxide dismutase, catalase 및 glutathione system 등의 항산화효소계라는 방어체계를 가지고 있어 활성산소를 무독화시켜 생체 항상성을 유지하고 있다.²⁾
   Cisplatin은 각종 암, 특히 이비인후과에서 두경부암에 사용되는 항암제이다. 그러나, cisplatin은 신장기능 장애, 위장관 장애, 골수 장애, 조직 내 활성산소 생성을 유도하여 난청이나 신장기능장애를 일으키는 것으로 보고되고 있다.³⁾⁴⁾
   한편 포유류의 송과체 호르몬인 melatonin(N-acetyl-5-methoxytryptamine)은 활성산소 중 peroxyl radical과 가장 반응성이 강한 수산화 radical을 분해하는 것으로 알려져 있으며, superoxide dismutase와 glutathione peroxidase의 활성을 증가시킬 뿐만 아니라 기존에 알려진 다른 항산화제들보다 강력한 것으로 밝혀져 주목을 받고 있다.⁵⁾ 또한 safrole과 같은 발암성 화학물질에 의한 DNA 손상, 방사선에 의한 손상 및 paraquat나 세균의 lipopolysaccharide에 의한 지질 과산화 등을 방지하며 활성산소에 의한 백내장 형성 억제 작용도 있는 것으로 알려져 있다.⁵⁾⁶⁾
   따라서 본 연구에서는 고농도의 cisplatin과 강력한 항산화제인 melatonin을 투여한 후 와우 조직의 형태학적 변화와 더불어 산화적 손상에 대한 연구를 수행하였으며 산화적 손상을 유발하는 활성산소의 하나인 과산화수소, 산화적 손상의 표지자인 malondialdehyde 및 항산화효소의 활성을 측정하여 그 기전을 증명하고자 하였다.

재료 및 방법

Cisplatin에 의한 내이독성 유도와 와우조직 채취
   실험동물로는 생후 4주령의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐(300~370 g)를 사용하였으며, 다음과 같이 3군으로 나누어 사육하였다.
   1) 대조군(제 1 군)은 총 30마리로 12시간 금식시킨 후 5% ethanolic saline 용액 4 mL와 생리 식염수 1 mL을 복강내로 주입한 후 72시간 후 5% ethanolic saline 용액 4 mL을 다시 주사하였다. 2) Cisplatin 투여군(제 2 군)은 총 55마리로 Rybak 등의 방법³⁾에 따라 쥐를 12시간 금식시킨 후 5% ethanolic saline 용액 4 mL과, 체중 kg당 16 mg의 cisplatin(Sigma, St. Louis, MO, 미국)을 생리 식염수 1 mL에 녹여 복강내로 주사하였다. 최초 주사 72시간 후에 다시 5% ethanolic saline 용액 4 mL를 주사하였다. 3) Cisplatin과 melatonin 투여한 melatonin 투여군(제 3 군)은 총 50마리로 12시간 금식시킨 후 Floreani 등의 방법⁷⁾에 따라 5% ethanolic saline 용액 4 mL에 melatonin(Sigma, St. Louis, MO, 미국)을 체중 kg당 10 mg이 주입되도록 녹인 액을 복강내 주사하고, 체중 kg당 16 mg의 cisplatin을 생리 식염수 1 mL에 녹여 복강내로 주사하였다. 최초 주사 후 72시간에 다시 5% ethanolic saline 용액 4 mL에 melatonin을 체중 kg당 10 mg이 주입되도록 녹인 액을 다시 복강 주사하였다.
   최초의 주사 6일 후, 에테르 마취하여 복부 대동맥으로부터 혈액을 채취하여 실혈사시키고, 목을 단두한 다음 와우 주위의 조직을 모두 제거한 후 와우 골부를 박리하여 와우 조직을 얻었다.
   와우조직은 10배 양의 생리 식염수를 넣은 다음 teflon glass homogenizer(chamber clearance 0.005~0.007 inches, Wheaton Scientific, Milville, NJ, 미국)로 마쇄하여 10%(w/v)의 내이 균질액을 만들었다. 이 균질액을 2,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 조직의 미마쇄부분을 제거한 다음 그 상층액을 시료로 사용하였다.

과산화수소 농도 측정 
   Xylenol orange hydrogen peroxide를 이용하여 과산화수소로 ferrous이온을 ferric이온으로 전환시켜 xylenol orange와의 결합에 의해 생성된 화합물을 560 nm에서 측정하여 과산화수소 농도를 계산하였다.

Malondialdehyde 농도 측정
   시료를 0.25 N 염산에 0.375%의 thiobarbituric acid와 15% trichloroacetic acid를 함유한 시약과 혼합하고, 반응액을 100℃ 수용액 중에서 15분간 방치한 후 3,000×g에서 5분간 원심분리하여 얻은 상층액을 535 nm에서 측정하였다. 시료 중 malondialdehyde 농도는 분자 흡광계수 1.56×105 M-1cm-1을 사용하여 계산하였다.

Superoxide dismutase의 활성
   Sun 등의 방법⁸⁾에 의하여 xanthine oxidase가 nitroblue tetrazolium을 환원시키는 양을 측정하였으며, 이 효소 1 unit는 효소액을 넣지 않는 반응액 중의 nitroblue tetrazolium의 환원을 50% 억제하는 효소의 양으로 정하였다. 

Catalase의 활성
   Nelson과 Kiesow의 방법⁹⁾으로 과산화수소를 기질로 사용하여 25℃에서 30초 반응시키는 동안에 240 nm 파장에서 과산화수소가 환원되어 감소하는 흡광도로써 효소 활성도를 측정하였으며, 효소 활성도의 단위는 1 분간에 1 mg의 단백질이 반응하여 환원시킨 과산화수소양으로 나타내었다.

Glutathione peroxidase의 활성
   Paglia와 Valentine 방법¹⁰⁾으로 활성을 측정하였다. 즉, 환원형 glutathione, 과산화수소 및 NADPH를 기질로, glutathione reductase를 촉매로 사용하여 시료액과 함께 25℃에서 5분간 반응하는 동안 환원형 glutathione이 과산화수소에 의해 산화형 glutathione으로 전환되며, glutathione reductase와 NADPH에 의해 산화형 glutathione이 환원형 glutathione으로 환원될 때, NADPH가 NADP⁺로 산화되는 정도를 340 nm 파장에서 time scan을 하였다. 이 때, NADPH의 분자흡광계수(E_340nm＝6.22 mM^-1cm^-1)를 이용하여 효소의 활성도를 산출하였으며, 효소 활성도의 단위는 1분간에 1 mg의 단백질이 반응하여 생성된 NADP⁺량으로 나타내었다.

Glutathione reductase의 활성 
   Glutathione reductase의 활성도 측정은 Goldberg와 Spooner 방법¹¹⁾을 이용하였다. 산화형 glutathione과 NADPH를 기질로 하여 37℃에서 2분간 반응시키는 동안에 NADPH가 NADP^＋로 산화되는 정도를 340 nm파장에서 흡광도를 측정하여 효소활성도를 산출하였다. 이 효소 활성도의 단위는 1분간에 1 mg의 단백질이 반응하여 산화된 NADPH량으로 나타내었다.

조직학적 검사
   흰쥐의 내이를 10% 중성 포르말린에 고정하고 탈수 및 침투 과정을 거쳐 파라핀에 포매한 후 5 μm의 박절편을 만들어 hematoxylin & eosin 염색하여 광학현미경으로 관찰하였다. 그리고, 와우조직을 0.5% glutaraldehyde와 0.5% paraformaldehyde를 혼합한 고정액에 담가 고정 보관한 후, 1% OsO₄ 용액으로 2시간 동안 후고정을 하고 0.1 mol/L 인산염 완충용액으로 수세하여 25% dimethyl sulfoxide(DMSO)에 30분간, 50% DMSO에 30분간 담근 다음 액체질소로 동결하였다. 동결된 조직을 할단(cracking)하여 50% DMSO에 녹여 수세하고 2% tannic acid에 침투시킨 다음, 1% OsO₄ 용액으로 전도염색을 하였다. 계열 에탄올로 탈수하고, isoamyl acetate로 침투를 시킨 후, 임계점 건조를 하고 이온증착기를 사용하여 Pt-Pd로 증착한 다음 Hitachi S-4200형 주사전자현미경으로 관찰하였다.

통계처리
   자료는 평균±표준편차로 표시하고, 대조군과 실험군 사이의 비교는 Student's t-test로 하였으며 실험 전후의 변화는 paired t-test로 하였다. 통계학적 유의수준은 p값이 0.05 미만으로 하였다.

결     과

생존율과 체중 변화
   대조군의 생존율은 100%로 실험 기간 모두 생존하였으며, cisplatin 투여군의 생존율은 37.5%, cisplatin과 melatonin을 투여군에서는 48.2%의 생존율을 보였다.
   체중의 변화(Fig. 1)는 대조군은 337±15 g에서 349±22 g으로 유의하게 증가하였으며, cisplatin 투여군은 333±30 g에서 256±29 g으로 유의적으로 감소하였다. Melatonin 투여군은 346±14 g에서 288±35 g으로 유의하게 감소하였으나(p<0.05), cisplatin 투여군에 비해 높았다(p<0.05).

과산화수소 농도 
   대조군의 과산화수소 농도는 2.24±0.83 nmol H₂O₂/mg protein이였으며, cisplatin 투여군은 4.96±1.54 nmol H₂O₂/mg protein로 대조군에 비하여 유의한 증가를 나타내었다(p<0.05). Melatonin 투여군은 2.26±0.78 nmol H₂O₂/mg protein로 대조군에 비해서는 유의한 변화가 없었으나, cisplatin 투여군에 비해서는 유의한 감소를 나타내었다(p<0.05)(Fig. 2).

Malondialdehyde 농도 
   대조군의 malondialdehyde 농도는 0.49±0.11 nmol/mg protein이였으며, cisplatin 투여군은 0.98±0.23 nmol/mg protein으로 대조군에 비하여 유의한 증가를 나타내었다(p<0.05). Melatonin 투여군은 0.73±0.19 nmol/mg protein로 대조군에 비해서는 유의한 증가를 나타내었으나(p<0.05), cisplatin 투여군에 비해서는 약간 감소하는 경향을 나타내었다(Fig. 3).

Superoxide dismutase의 활성도
   대조군의 superoxide dismutase 활성도는 0.67±0.19 unit/min/mg protein이였으며, cisplatin 투여군은 0.36±0.18 unit/min/mg protein으로 대조군에 비하여 유의한 감소를 나타내었다(p<0.05). Melatonin 투여군은 0.65±0.22 unit/min/mg protein로 대조군에 비해서는 유의한 변화가 없었으나, cisplatin 투여군에 비해서는 유의한 증가를 나타내었다(p<0.05)(Fig. 4).

Catalase의 활성도
   대조군의 catalase 활성도는 5.09±2.11 nmol H₂O₂/min/mg protein이였으며, cisplatin 투여군은 2.78±1.16 nmol H₂O₂/min/mg protein으로 대조군에 비하여 감소를 나타내었다. Melatonin 투여군은 5.56±1.27 nmol H₂O₂/min/mg protein로 대조군에 비해서는 유의한 변화가 없었으나, cisplatin 투여군에 비해서는 유의한 증가를 나타내었다(p<0.05)(Fig. 5).

Glutathione peroxidase의 활성도
   대조군에서 glutathione peroxidase의 활성도는 14.59±5.11 nmol NADP+/min/mg protein이였으며, cisplatin 투여군은 17.43±3.38 nmol NADP⁺/min/mg protein, melatonin 투여군은 16.68±3.43 nmol NADP⁺/min/mg protein으로 각 군간의 유의한 변화는 없었다(Fig. 6). 

Glutathione reductase의 활성도
   대조군에서 glutathione reductase의 활성도는 22.04±8.36 pmol NADPH/min/mg protein이였으며, cisplatin 투여군은 46.96±12.90 pmol NADPH/min/mg protein으로 대조군에 비하여 유의한 증가를 나타내었다(p<0.05). Melatonin 투여군은 43.15±11.29 pmol NADPH/min/mg protein로 대조군에 비해서는 유의한 증가를 나타내었으나(p<0.05), cisplatin 투여군에 비해서는 유의한 변화를 나타내지 않았다(Fig. 7).

조직학적 검사
   광학현미경 검사 결과, 대조군에서의 코르티기의 내유모세포의 stereocilia 및 외유모세포는 수적 감소가 없는 정상적인 모양을 유지하였다(Fig. 8A). Cisplatin 투여군에서는 내유모세포의 stereocilia가 현저한 수적 감소를 나타내었고 외유모세포(outer hair cell)는 경미한 수적 감소를 나타내었다(Fig. 8B). Melatonin 투여군은 내유모세포의 stereocilia 및 외유모세포의 수적 감소가 cisplatin 투여군 보다 적었다(Fig. 8C).
   주사전자현미경 검사 결과, 대조군에서는 내유모세포의 stereocilia 및 외유모세포 등의 구조에 특이한 변화가 없었으며(Fig. 9A), cisplatin 투여군에서는 내유모세포 및 외유모세포의 부분적인 손실이 나타났다(Fig. 9B). Melatonin 투여군은 비교적 유모세포들이 잘 보존되어 있었다(Fig. 9C).

고     찰

   생체는 호흡, 면역 반응 및 각종 산화 환원 반응의 결과로 superoxide 음이온, 과산화수소, 수산화 radical 등의 활성산소를 생성하며, 정상인의 경우 생성된 활성산소는 세포내 항산화계에 의해 평형을 유지하고 있다.¹⁾ 즉, superoxide는 superoxide dismutase에 의해 과산화수소로 바뀌어지며, 과산화수소는 catalase와 glutathione peroxidase에 의해 물로 무독화되어진다.
   이러한 활성산소에 의한 손상을 감소시키기 위한 여러 연구가 시도되고 있으며, 최근에는 melatonin이 활성산소를 직접 제거하며, 항산화효소들의 활성을 자극한다는 보고가 있다.⁵⁾¹²⁾ 특히 cisplatin에 의해 생성된 활성산소로 인한 손상을 방지하기 위한 연구가 이비인후과 영역에서도 행해지고 있다.^3)13)14) Teranishi 등¹⁵⁾에 따르면 guinea pig에 cisplatin을 처치한 후 항산화제인 α-tocopherol을 투여하면 cisplatin에 의한 Preyer 반사의 소실, 청각 뇌간 반응의 명백한 소실, 와우조직 내의 malondialdehyde의 증가 등을 막는다고 보고하였다. 또한 Lopez-Gonzalez 등¹⁴⁾에 따르면 흰쥐에서 cisplatin에 의한 청력 소실을 melatonin 및 기타 항산화제 혼합 투여로 방지하였으나, 이음향방사로 이를 증명하였을 뿐 그 기전에 대하여는 증명되지 않았다.
   본 연구 결과, 대조군의 생존율은 100%인 반면, cisplatin 투여군은 37.5%, melatonin 투여군은 48.2%로서 cisplatin 투여군보다 약간 높은 생존율을 보였다. 체중 변화는 대조군에서만 체중이 증가하고 cisplatin과 melatonin 투여군은 모두 유의한 감소를 보였다. 이러한 결과는 Hara 등¹⁶⁾의 결과와 일치하는 것으로서, cisplatin 투여에 의한 위장관와 신장기능 손상에 의한 체중 감소가 나타나며, melatonin이 cisplatin의 독성을 완화시킴으로써 melatonin 투여군의 생존율이 cisplatin 투여군 보다 약간 더 높은 것으로 생각된다.
   활성산소의 하나인 과산화수소 생성량은 대조군에 비해 cisplatin 투여군에서 약 200% 증가하였고, cisplatin 투여군에 비해 melatonin 투여군에서는 감소하였다. 이는 melatonin의 electron donor 작용에 의한 것으로 사료된다.¹⁷⁾ 또한 활성산소로 인한 손상 표지자인 malondialdehyde 농도는 cisplatin 투여군이 대조군에 비해 약 200% 높았으며, Rybak 등³⁾의 결과와 일치하였다. Melatonin은 지질 과산화의 지표인 malondialdehyde를 감소시켜 조직 내 산화적 손상을 억제하는 물질로,³⁾ 비록 cisplatin 투여군과 melatonin 투여군의 malondialdehyde 농도는 유의적인 차이는 없었으나, melatonin 투여군에서 감소하는 경향을 나타내었다. Superoxide dismutase 및 catalase 활성도는 대조군에 비해 cisplatin 투여군에서 유의하게 감소되었고, melatonin 투여군은 cisplatin 투여군에 비해 유의적으로 증가하였다. 또한 melatonin 투여군의 superoxide dismutase와 catalase 활성도는 대조군 수준으로 정상화되는 양상을 나타내었다. Ichikawa 등¹⁸⁾에 따르면 superoxide 음이온의 양적 증가로 superoxide dismutase의 활성이 저하되어 조직 손상을 유발한다고 하였다. 따라서 cisplatin 투여군에서 superoxide dismutase와 catalase의 활성 저하는 각각 superoxide 음이온과 과산화수소의 증가로 인해 조직 손상이 초래되며, melatonin이 항산화효소의 활성을 증가시킨다는 보고와 일치하였다.¹⁹⁾
   한편 과산화수소 처리 효소인 glutathione peroxidase는 세 군 간에 유의한 차이는 나타나지 않았다. 그리고 glutathione을 환원형으로 유지시키는 glutathione reductase 활성도는 모두 대조군에 비해 cisplatin과 melatonin 투여군에서 모두 유의하게 증가하였고, cisplatin 투여군에 비해 melatonin 투여군에서는 유의한 차이는 없었으나 약간 감소하는 경향이 나타났다. Cisplatin 투여군에서 glutathione계 효소들의 활성 증가는 catalase 활성 저하의 결과로 세포내 과다 생성된 과산화수소를 분해하여 생체 항상성을 유지하기 위한 세포 자체 작용인 것으로 보인다. 이러한 항산화효소들의 변화에서 melatonin은 glutathione계 효소보다 catalase에 작용하는 것으로 사료된다.
   또한 광학 및 주사전자현미경 소견을 보면 cisplatin 투여군은 stereocilia 및 유모세포의 수적 감소를 보였으나 melatonin 투여군은 cisplatin 투여군에 비해 비교적 stereocilia와 유모세포가 보전되어 있었다. 이는 cisplatin으로 인해 신체 전반에 걸쳐서 뿐만 아니라 내이에서도 활성산소의 생성이 증가되어 이로 인한 손상이 증가되며, melatonin이 이를 방지하는 것을 나타내는 결과로 생각된다.
   이상 문헌적 고찰과 본 실험 결과로 볼 때, cisplatin에 의한 내이독성은 cisplatin에 의해 생성된 활성산소가 superoxide dismutase와 catalase 활성을 저하시키고, cochlea의 항산화 방어 체계의 손상에 의한 것으로 사료된다. 이러한 cisplatin에 의한 내이 손상은 강력한 항산화제인 melatonin에 의해 억제될 수 있을 것으로 생각된다.

결     론

   본 연구에서는 melatonin이 cisplatin에 의해 발생된 활성산소의 작용으로 감소된 항산화효소들의 활성을 정상화시키고, stereocilia 및 유모세포 보호작용을 확인하였다. 따라서 melatonin은 cisplatin에 의해 생성된 활성산소에 의한 내이 손상을 감소시킬 수 있을 것으로 사료된다.

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