교신저자：김경수, 135-720 서울 강남구 도곡동 146-92  연세대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   Prostaglandin 생성에 핵심적 역할을 하는 cyclooxygenase(COX)는 isoform인 COX-1, 2의 두가지 형태가 존재한다. 이중 COX-1은 구조적으로 일정량이 생성되나 COX-2는 여러 질환에서 그 양이 변화하므로 염증반응과 암 형성에서 중요한 매개체이다.¹⁾ 인체 기도의 경우 COX-2는 백혈구 소통(leukocyte trafficking), 부종 형성, 기도 과분비 등의 염증반응과 평활근 긴장에 관여하여 천식 및 과분비 질환에서 중요한 매개체이다.²⁾
   15-lipoxygenase(15-LO)는 지질대사 반응에서 불포화 지방산을 hydroperoxy 및 epoxy 대사산물로 변환시키는 역할을 한다. 이러한 반응은 사용되는 기질에 따라 대사산물이 다른 양상을 보이게 되는데, 아라키돈산을 기질로 사용할 경우 15(S)-hydroperoxyeicosatetraenoic acid (HpETE)로 대사되며 이는 다시 15(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid(HETE)로 변환된다. 리놀산을 기질로 사용할 경우 13(S)-hydroperoxyoctadecadienoic acid(HpODE)로 대사된 다음 13(S)-hydroxyoctadecadienoic acid(HODE)로 변환된다. 15-LO는 1, 2의 두 형태가 있으며 15-LO-1은 선택적으로 리놀산을 기질로 하여 13(S)-HODE를 생성하며, 일부 아라키돈산을 기질로 하여 소량의 15(S)-HETE나 12(S)-HETE를 생성한다. 15-LO-2는 주로 아라키돈산을 기질로 하여 15(S)-HETE를 만든다. 15-LO-1은 적혈구, 호산구, 단핵구, 기관-기관지 상피세포, 전립선암, 대장암 등에서 발현되며, 15-LO-2는 전립선, 피부, 각막 등에서 발현된다.³⁾⁴⁾⁵⁾
   COX-2와 15-LO는 종 및 조직 특이적으로 존재하는데, 사람 기관-기관지 조직의 경우 두 단백질이 모두 존재하며, 기관세포에서는 주로 15-LO 산물이 생성된다.⁶⁾⁷⁾ 천식환자의 기관점막에서 15-HETE의 생성이 정상보다 의의있게 증가하고 기관 점막을 제거할 경우 대사산물인 15-HETE의 생성이 감소하여 기관 점막에서 이 효소의 존재 및 천식에서 중요한 매개체임이 증명되었다.⁸⁾ 코점막의 경우 COX-2가 상피세포와 기저세포에 존재함이 밝혀졌고,⁹⁾¹⁰⁾ 15-LO가 코점막에 존재하는 것으로 알려져 있으나⁷⁾ 국소적으로 상피의 어느 부위에 존재하는 가에 대해서는 아직 명확히 밝혀진 바가 없다.
   상기도 병변이 만성적으로 지속될 경우 정상적인 섬모 상피세포가 편평 상피세포로 변화하여 기능상의 문제를 야기하게 된다. 즉, 코점막의 대표적 분화양상인 점액섬모 분화(mucociliary diffferentiation)와 편평 분화(squamous differentiation) 중 어느 분화경로를 택하느냐에 따라 점액섬모 상피조직이나 편평 상피조직으로 분화하게 되는 표현형(phenotype)을 결정하게 된다.¹¹⁾ 지금까지의 연구에 의하면 상기도에서 COX-2와 15-LO가 분화에 관여함이 일부 증명되었으나¹²⁾ 아직 코점막 상피세포에 대해서는 이러한 연구가 없는 실정이다.
   이에 연구자들은 본 연구를 통해 사람 코점막에서 15-LO의 국소화를 보고자 하였고, 또한 사람 하비갑개 점막을 이용하여 점액섬모 상피와 편평 상피로 서로 다른 분화를 보이는 조직을 관찰하여 COX-2와 15-LO가 분화에 따라 어떻게 발현되는가를 알고자 하였다. 그리고 사람 코점막 상피세포를 배양하여 분화 정도 및 분화의 양상에 따라 COX-2와 15-LO의 발현을 보아 코점막 상피세포의 분화와 COX-2 및 15-LO가 어떤 관련이 있는가를 알고자 하였다.

재료 및 방법

하비갑개 조직의 채취 및 면역조직화학 염색
   비중격성형술을 시행받는 환자의 하비갑개 점막을 전단부-중간부로 나누어 가능한 한 점막에 손상이 없이 채취하였다. 이를 파라핀에 포매한 후 조직을 4 μm 두께로 자른 다음 탈파라핀 처리하였다. 이후 내인성 peroxidase 활성을 억제하기 위해 3% 과산화수소에 10분간 처리하였고, 비특이적 항원-항체 반응 억제를 위해 5% skim milk에 30분간 처리하였다. 이후 염색은 Vectastain Elite kit(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)를 이용하였다. 다클론성 COX-2 항체(Oxford Biomedical Research, Oxford, MI, USA)는 1：1000의 농도로, 다클론성 15-LO-1 항체(Cheyman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)는 1：200의 농도로 각각 4℃에서 밤새 반응시킨 후, 이차 항체 처리한 다음 3,3’-diaminobenzidine(Sigma Co., St. Louis, MO, USA)으로 발색반응 시킨 후 hematoxylin으로 대조염색한 다음 고정 후 관찰하였다. 음성 대조군은 각 항체를 제외하고 같은 방법으로 염색하였다.

정상 사람 코점막 상피세포의 배양
   기존의 방법¹¹⁾으로 만들어 저장해 놓은 passage-2 정상 사람 코점막 상피세포를 이용하여 배양하였다. 방법을 약술하면 10 5 세포를 반투과성 막(Trans-clear, Costa Co., Cambridge, MA, USA)에 놓고 막의 위-아래에 모두 배양액을 넣어 9일간 배양하였다. 사용되는 배양액은 BEGM과 DMEM을 동량으로 섞고 여기에 첨가물로 hydrocortisone, insulin, transferrin, epinephrine, triiodothyronine, gentamycin, amphotericin, epidermal growth factor, bovine serum albumin bovine pituitary extract 등을 기존의 농도로 사용하였다. 배양은 처음 9일간은 위-아래 모두 2일에 한번 배양액을 갈아 주었고, 9일째 위의 배양액을 제거하여 air-liquid interface법을 시행하여 아래로부터 영양분을 받도록 하여 배양하였다.

점액섬모 분화와 편평 분화의 유도 및 배양기간에 따른 Western blot analysis
   레티노익산 첨가시 사람 코점막 상피세포가 점액섬모 분화를 하게 되고 미첨가시 편평 분화를 하므로¹¹⁾ 정상 사람 코점막 상피세포를 배양시부터 10^-7 M 레티노익산(Sigma Co., St. Louis, MO, USA)을 첨가한 군과 첨가하지 않은 군으로 구분하여 배양하였다. 각 군에 대해 air-liquid interface 배양 0일째(시작일), 7일째, 14일째에 radioimmunosorbent assay buffer를 이용하여 cell lysate를 얻었다. 단백질의 양은 bicinchonic acid protein assay-bovine serum albumin 법을 이용하여 측정한 후 각 배양시기에 따라 레티노익산 첨가군-미첨가군으로 구분하여 lane당 단백질 30 μg을 넣어 전기영동하였다.
   전기영동은 8% SDS-polyacrylamide gel을 이용하였고 전기영동 후 nitrocellulose membrane에 전이시킨 다음 이 막을 10% milk in TBST로 4℃에서 밤새 반응시킨 후 15-LO와 COX-2 항체로 실온에서 각각 4시간 동안 반응시켰다. TBST로 세척 후 horseradish peroxide 중합 항체(Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK)로 1시간 처치한 다음 세척하였다. 이후 enhanced chemiluminescence(ECL kit, Amersham Pharmacia Biotech)로 발색시킨 다음 autoradiography를 이용하여 15-LO와 COX-2의 밴드를 각각 검출한 다음 이에 대해 Scion Image(Scion Co., Frederick, MD, USA)를 이용하여 각 밴드의 세기를 반정량적으로 분석하였다. 위의 membrane을 deprobing 후 actin 항체(Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA)(1：500 농도)로 Western blot analysis하여 actin 밴드에 대한 세기를 구하였다. 15-LO와 COX-2 밴드의 세기를 actin 밴드의 세기에 대한 비율(15-LO 또는 COX-2/actin)로 표시하여 강도를 비교하였다.

결     과

사람 정상 코점막에서 15-LO와 COX-2의 발현
   사람 하비갑개 점막을 다클론성 15-LO와 COX-2 항체로 면역조직화학염색을 하여 각 단백의 발현을 관찰하였다.
15-LO는 섬모상피세포와 기저세포의 세포질에서 강하게 발현되었으나, 배세포에서는 발현되지 않았다(Fig. 1A). 분비선의 경우 점액 및 장액선 모두에서 발현되지 않았다(Fig. 1C).
   COX-2는 섬모상피세포의 세포질에서 주로 발현되었고 일부 기저세포에서 발현되었으나 배세포에서는 발현되지 않았고(Fig. 1B), 분비선에서도 발현되지 않았다(Fig. 1C).
일차 항체를 제외하고 염색한 음성 대조군의 경우 양성 반응이 관찰되지 않았다(Fig. 1D).

점액섬모 상피조직과 편평 상피조직에서 15-LO와 COX- 2의 발현 비교
   하비갑개의 전단부에서 편평 상피 부위와 중간부에서 점액섬모 상피조직 부위를 선택하였다. 각각에 대해 15-LO와 COX-2 항체로 면역조직화학염색을 하여 분화에 따른 각 단백 발현의 차이를 알아보았다.
   15-LO의 경우 점액섬모 상피에서 강하게 발현되었으나 편평 상피조직의 경우 발현이 매우 적거나 관찰되지 않아 점액섬모 상피조직보다 발현이 감소된 소견을 보였다(Fig. 2A and B).
   COX-2의 경우 점액섬모 상피와 편평 상피조직간에 유사하게 발현되어 유의한 차이를 보이지 않았다(Fig. 2C and D).

사람 정상 코점막 상피세포에서 분화 양상 및 정도에 따른 15-LO와 COX-2의 발현
   사람 정상 코점막 상피세포를 섬모 상피세포로 분화시키기 위하여 레티노익산을 첨가하여 배양한 군과 편평 상피세포로 분화시키기 위해 레티노익산을 첨가하지 않고 배양한 군으로 나누어 각각을 air-liquid interface 배양법으로 배양하였다. 배양 0, 7, 14일에 총단백을 채취하고 이를 15-LO와 COX-2에 대한 항체로 Western blot analysis를 시행하여 이들 단백의 발현을 보았다.
   15-LO는 레티노익산을 첨가하지 않고 배양한 경우 즉, 편평 분화의 경우 배양일 모두에서 발현되지 않았다. 반면 레티노익산을 첨가하여 섬모상피 분화를 시킨 경우에 15- LO는 air-liquid 배양 시작일부터 발현되기 시작하며 시간경과에 따라 발현이 의의있게 증가하여 14일째 가장 증가하였다(Fig. 3).
   COX-2는 레티노익산 없이 배양한 경우 배양일 모두에서 발현되었고 발현양은 배양일에 관계없이 일정한 양상이었다. 레티노익산을 첨가하여 배양하였을 때 COX-2는 배양 시작일부터 발현되기 시작하여 배양 7일째부터 의의있게 증가하였으나 배양 7일째와 14일째를 비교시 유의한 차이를 보이지 않았다(Fig. 3).

고     찰

   상기도에서 15-LO의 존재 가능성에 관한 연구로 사람 코 및 기관지 점막 조직에 대해 고성능 액체 크로마토그라피(high performance liquid chromatography)를 시행하여 이 효소의 대사산물인 15-HETE를 검출함으로서 증명되었고,⁷⁾ 면역조직화학염색상 사람 기관조직의 상피세포에서 발현됨이 보고되었다.⁵⁾¹³⁾
   본 연구 결과상 코점막에서 15-LO는 섬모상피세포와 기저세포에서 발현되고 배세포 및 분비선조직에서는 발현되지 않았다. 이런 결과는 사람 기관조직에 대한 면역형광 염색상 상피세포와 기저세포에서 발현되며 이런 반응은 세포질에서만 보인다는 보고와 일치하는 결과이다.⁵⁾ 사람 기관지와 폐의 경우 15-LO는 면역조직화학적 방법상 기관지에서의 발현은 기관에 비해 감소하고 폐에서는 거의 발현되지 않아 해부학적 위치에 따라 발현에 차이를 보인다고 하여 구조에 따라 특이하게 15-LO가 발현된다고 한다.¹³⁾ 코점막은 상기도에 속하는 조직으로 코점막과 기관점막에서 발현이 되고 하기도로 갈수록 발현이 감소하는 것은 위치 및 해부학적 구조에 따른 차이로 생각되며 상기도와 하기도의 기능면에서의 차이에 관여할 가능성을 시사한다 하겠다.
   기도점막에서 COX-2의 발현에 대한 연구 결과상 폐와 코의 점막 상층의 섬모원주 상피세포에서 발현되며 염증세포에서도 발현이 증가하였다.⁹⁾ 비갑개 조직을 면역조직화학염색한 다른 연구에서는 섬모 상피조직과 기저세포에서 발현된다고 하였다.¹⁰⁾ 본 연구결과도 상피세포와 기저세포에서 발현되고 분비선조직에서는 발현되지 않아 다른 연구결과⁹⁾¹⁰⁾와 동일함을 확인하였다.
   하비갑개 전단부의 일부는 편평화생(squamous metaplasia)된 편평상피이고 이후는 점액섬모 상피로 구성된다. 본 연구에서는 이런 조직학적 특성을 이용하여 분화의 서로 다른 양상인 점액섬모 분화와 편평 분화에서의 15-LO와 COX-2의 발현을 관찰하였다. 결과상 15-LO는 편평 분화보다 점액섬모 분화의 경우에서 더욱 많이 발현하여 점액섬모 분화와 15-LO가 관련이 있을 가능성을 알 수 있었다. COX는 두 조직간에 발현상 차이를 보이지 않아 분화에 관여하지 않을 것이라 생각되었다. COX의 경우 비용, 상악동 점막, 하비갑개 점막 등에서 조직에 관계없이 일정한 양이 발현되어 병적 상태와 관계가 없다는 보고¹⁴⁾를 참고하면 코점막에서의 병리학적 변화에서 COX-2보다는 15-LO가 더욱 중요한 매개체라고 생각된다. 그러나, COX와 LO에 대한 다른 보고¹⁰⁾에 의하면 비용, 비후된 비갑개, 정상 조직 모두에서 COX 대사산물이 상대적으로 증가한 상태였다고 하여 위의 주장과는 상반된 입장이다. 즉, 현재까지의 연구결과를 비교하여 보면 코점막에서 15-LO와 COX의 역할에 대해서는 아직 확실하게 정설이 성립되지 않은 상태로 추후 이에 대한 연구가 필요하리라 생각한다.
   사람 코점막 상피세포의 배양시 레티노익산을 첨가 혹은 미첨가하여 배양하게 되면 레티노익산을 첨가하는 경우 점액섬모 상피세포로 분화하게 되고 미첨가시 편평 상피세포로 분화하게 되어 분화에 관련된 연구에서 중요한 실험적 방법으로 이용되고 있다.¹¹⁾ 본 연구도 이러한 결과를 이용하여 분화의 서로 다른 양상에서 배양시간에 따라 15-LO와 COX-2가 어떻게 발현되는가를 관찰하여 이 두 효소가 코점막 상피세포의 분화와 관계가 있는가를 보고자 하였다.
   결과상 15-LO는 레티노익산이 있는 경우 즉, 점액섬모 분화의 경우에만 발현되며 시간 경과에 따라 유의하게 이의 발현이 증가하여 점액섬모 분화와 편평 분화간의 구분에 15-LO가 관여하며 분화가 시작된 이후 세포의 지속적 분화 혹은 성장에 관여할 가능성을 알 수 있었다. COX의 경우 점액섬모 분화와 편평 분화 모두에서 발현되어 두 분화를 결정하는 것에는 관여하지 않을 가능성을 알 수 있었다. 그러나, 편평 분화에서는 배양시간에 관계없이 일정양이 발현되나 점액섬모 분화의 경우에서는 7일째부터 발현이 유의하게 증가하여 아마도 세포의 성장에 관련될 가능성이 있다고 생각되었다.
   두 효소와 상기도 분화간의 연관성에 대한 연구¹²⁾에 의하면 사람 기관-기관지 상피세포(normal human tracheo-bronchial epithelial cells)의 경우 레티노익산 없이 배양하여 편평 상피세포로 분화시에는 15-LO와 COX-2 모두 발현되지 않는 결과를 보여 15-LO는 본 연구결과와 일치하였으나 COX-2는 본 연구결과와 상이한 양상이었다. 레티노익산을 첨가배양하여 점액섬모 상피세포로 분화시킨 경우 COX-2는 분화 초기에 발현되다가 배양시간이 증가함에 따라 발현이 감소하였고 15-LO는 분화 초기에는 보이지 않다가 배양 14일째부터 발현되며 점차 발현이 증가하는 양상을 보여 본 연구결과와는 다른 결과를 보였다. 이런 차이는 세포에 따른 COX-2와 15-LO의 발현 특이성으로 생각되며 이러한 차이가 아마도 각 세포의 기능적 특성을 반영할 수 있다고 생각한다.

결     론

   본 연구 결과상 점액섬모 분화와 편평 분화를 결정짓는 과정에는 15-LO가 관여할 가능성이 있으며, 분화가 결정되어 세포가 성장하는 과정에는 점액섬모 분화의 경우 초기부터 15-LO가 관여하나 후기에는 15-LO와 COX가 모두 관여할 가능성이 있으리라 추측된다. 한편 편평 분화되어 성장하는 경우에는 두 효소 모두 이 과정에 관여하지 않으리라 생각된다. 그러나 이러한 연관성이 과연 각 효소의 직접작용인지 혹은 분화과정이 결정되거나 성장하는 과정 중의 산물인 이차적 반응인지는 본 연구결과로 결정하기 어려우므로 이에 대한 연구가 필요하리라 생각한다.

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