교신저자：남순열, 138-736 서울 송파구 풍납2동 388-1  울산대학교 의과대학 서울아산병원 이비인후과학교실
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서     론

   악성흑색종은 피부 혹은 점막의 멜라닌세포에서 기원하며, 두경부영역에서 발생하는 비율은 전체의 대략 18~25% 이고,¹⁾ 두경부영역에서 더 공격적인 특징을 보인다.²⁾ DNA 부조화 복구 체계는 Escherichia coli의 MutHLS 경로에서 처음 연구되었고,³⁾ 사람에서 이와 동일한 경로에 작용하는 것으로는 MSH2(human MutS homologen 2), MLH1 (human MutL homologen 1) 유전자가 있다. 이 중에서 MSH2 유전자는 박테리아의 MutS 단백질에 해당하는 동일물(homologue)을 사람에서 만들어내도록 하며 MutS 단백질은 잘못 짝지어진 DNA 염기서열을 인식하는 역할을 하고, 염색체 2p16에 위치하며 16개의 exon으로 이루어져 있다.⁴⁾ MLH1 유전자는 MutL 단백질과 동일물을 만들도록 하며 MSH2와 상호작용을 한다고 추측되나 정확한 기전은 잘 알려지지 않았다.⁴⁾ 이는 염색체 3p21에 위치하며 19개의 exon을 함유하고 756개의 아미노산을 부호화한다.⁵⁾ 미세위성 불안정성은 흑색종의 악성화와 관련이 의심되어 왔으나 흑색종에서는 드물게 발생하는 것으로 알려져 있으며, 두경부영역의 흑색종에서 MLH1과 MSH2의 발현에 대한 보고는 거의 없다. 
   본 연구에서는 미세위성 불안정성과 관련하여 DNA 부조화 복구 단백질 MLH1과 MSH2의 발현양상을 두경부영역의 점막 악성 흑색종에서 알아보고자 하였고, 비교군으로 피부 악성 흑색종환자를 설정하여 비교하여 차이 유무를 알아 보고자 하였다. 

대상 및 방법

대  상
   1989년 6월부터 2002년 1월까지 조직검사로 확진된 악성 흑색종 환자 총 19명을 대상으로 하였다. 11명은 두경부 영역의 점막 악성 흑색종이었고, 8명은 그 외 피부에 발생한 피부 악성 흑색종이었다. 남성 9명, 여성 10명이었고, 나이는 32세에서 77세로 평균 55세였다. 치료는 16명에서 절제수술이 시행되었고, 2명은 방사선 치료만 시행하였으며, 치료를 거부하여 추적이 되지 않은 경우가 1예 있었다. 수술시 경부 임파선 곽청술이 함께 시술된 경우가 4예 있었으며, 술 후 항암치료가 시행된 경우가 6예 있었다(Table 1 and 2).

방  법
   1989년 6월부터 2002년 1월까지 수술로 얻어진 11예의 점막 악성흑색종과 8예의 피부 악성 흑색종 검체가 병리학 교실에서 제공되었다. 동시에 다발성의 병변을 가지고 있던 환자는 없었다.
   파라핀 포매조직으로부터 4 μm의 연속 절편을 만들었고, 한 절편은 hematoxylin-eosin 염색을 하여 병리조직학적 확진에 이용하였다. 1000개 이상의 세포가 헤아려질 때 충분한 상피조직으로 판단하였다. 면역조직화학염색은 poly-L-lysine이 씌워진 유리 슬라이드 위에 검체를 올려놓고 시행하였다. 내부 과산화효소(endogenous peroxidase)를 0.3% hydrogen peroxide in methanol에서 20분간 incubation하여 제거하였다. 염색 양식(staining pattern)을 증강하기 위해 절편을 10 mM citrate 완충용액(buffer)에서 3분간 3회 가열하였다. 비특이적 항체반응이 발생하는 것을 방지하기 위해 절편들은 상온에서 25분간 PBS(phosphate buffered saline)/BSA(bovine serum albumin)(1%)에서 반응시켜 묽게 조절된 nonimmune mouse serum(1：20, Dakopatts, Hamburg, Germany)에서 미리 반응시켰다. Tris-HCL 완충용액에서 2차례 세척된 후 일차 항체가 주입되었다. 양성 대조군으로 각 항체마다 정상 편평상피세포의 면역활성도가 악성세포와 비교되었다. 음성 비교군으로는 일차 항체와 동형(isotype)이나 전혀 무관한 특성(irrelevant specificity)을 가지는 항체를 이용하였다. 모든 슬라이드는 각 단계마다 Tris-HCL 완충용액에 2차례 세척되었다. 항원 회수(antigen retrieval)를 위해 일차항체를 배양하기 전 절편은 heat plate(2×5 minutes, 85°C, citrate buffer(pH=2.0))에서 처리되었다. 일차 항체는 MLH1항원에 대한 생쥐 단세포군 항체(mouse monoclonal antibody)인 clone G168-15(Pharmingen, Hamburg, Germany)와 MSH2항원에 대한 토끼(rabbit) 다세포군 항체인 N-20(Santa Cruz, Heidelberg, Germany)를 사용하여 24°C에서 30분간 반응시켰으며, 결과 판정시에는 standard LSAB 기법(labelled streptavidine-biotin)을 이용하였고, 3.3’-diaminobenzidine(DAB, Vectro Laboratories, Burlinghame, U.S.A.)를 chronigen으로 사용하였다. Hematoxylin을 이용하여 nuclear counterstaining을 시행하였다. 염색 결과는 핵양성(nuclear positivity)유무에 따라 음성과 양성으로 나누는 정성적 검사를 하였고, 통계적 유의성 검정은 p<0.05를 기준으로 하였다. SPSS software를 이용하여 Fisher’s exact test를 시행하여 검정하였다.

결     과

점막 악성 흑색종에서의 MLH1 발현
   점막 악성 흑색종에서 MLH1은 11예 중 1예(9%)에서만 핵내에서 양성을 보였다. 첫 번째 환자에서는 초기에 시행한 조직검사에서는 핵양성을 보였으나 추적관찰 중 재발하여 시행한 수술에서 얻어진 조직에 대한 재검사에서는 음성으로 전환됨을 보였다. 진단시 경부 전이가 있던 세 환자들은 모두 음성결과를 보였다(Table 3, Fig. 1). 점막 악성 흑색종의 MLH1 핵내의 양성도는 피부 악성 흑색종과 비교하여 통계적으로 유의하게 높지 않았다(p=0.546).

피부 악성 흑색종에서의 MLH1 발현
   피부 악성 흑색종에서 MLH1은 8명 중 2예에서(25%) 핵 내 양성을 보였다. 경부전이가 있던 첫 번째 환자의 경우는 양성을 보였고 진단시 두개강 내 전이가 있던 두 번째 환자의 경우에는 활성도가 소실되어 있었다(Table 4). 

점막 악성 흑색종에서의 MSH2 발현 
   점막 악성 흑색종에서 MSH2는 11명 중 5예에서 핵 내 양성을 보였다. 진단시 경부 전이가 있던 세 환자들의 경우는 모두 음성을 보였으나 전신적 전이가 있던 세 번째 환자의 1예는 핵 내 양성을 보였다. 재발한 첫 번째 환자의 경우 MLH1에 대하여는 양성에서 음성 전환이 있었으나, MSH2에는 초기부터 음성으로 핵활성도가 소실되어 있음을 알 수 있었다(Table 3, Fig. 1). 점막 악성 흑색종의 MSH2 양성도는 피부 악성 흑색종과 비교하여 통계적으로 유의하게 높지 않았다(p=0.633).

피부 악성 흑색종에서의 MSH2 발현
   피부 악성 흑색종에서 MLH2는 8명 중 2예에서 염색반응 양성을 보였다. 경부전이가 있던 첫 번째 환자의 경우는 핵내 양성을 보였고 진단시 두 개강 내 전이가 있던 두 번째 환자의 경우 활성도가 소실되어 있었다. 피부 악성 종양의 환자들의 경우는 MLH1과 MSH2의 활동성이 유사하게 나타나는 것을 볼 수 있었다(Table 4). 

고     찰

   본 연구에서는 DNA 부조화 복구 단백질(mismatch repair protein) MLH1, MSH2의 발현양상을 두경부 영역의 점막 악성 흑색종에서 알아보았다.
   미세위성(microsatellites)은 인간유전체(human genome)에서 유전자 사이 혹은 유전자 내에서 발생되는 다양한 길이의 반복되는 뉴클레오티드(nucleotide) 서열이다.    미세위성 서열(microsatellite sequence)은 불안정하여 유전체의 반복되지 않는 순서에도 영향을 미칠 수 있다. 그러나 대부분의 미세위성 반복(microsatellite repeats)은 유전자 부호화 지역(coding region)의 외곽에서 발생하므로 미세위성의 불안정성(microsatellite instability)은 직접 발암을 일으키지는 않으며 다만 과다돌연변이성 유전체(hypermutable genome)를 불안정화시킨다.⁶⁾ 미세위성 불안정성은 직장결장암, 자궁내막암, 위암, 식도암에서 보고되어 왔다.^7)8)9)10) 미세위성 불안정성은 부조화 유전자의 돌연변이와 연관이 있다.¹¹⁾ DNA 부조화 복구 유전자의 소실시 복제오류(replication error)가 발현되고, 이러한 오류는 돌연변이로 인해 발암유전자(oncogene)를 활성화 시키거나 암억제유전자(tumor suppressor gene)를 불활성화시킨다. 암세포의 DNA에는 특징적으로 반복복제오류(replication error of repeats；RER)가 보인다는 발표가 되어 왔다.¹²⁾
   MLH1, MSH2 유전자는 복제과정 중 잘못 짝지어진 염기서열을 복구하는 역할을 하는 유전자로 다양한 조직에서 발현되나 식도와 장 상피(intestinal epithelia), 그리고 피부 부속조직(adnexal structures)의 핵 내에서 많이 발견된다. 구강 점막 내에서는 기저층(basal layer)과 부기저층(parabasal layer)에서 더욱 많이 분포하는 것으로 보이며, 표피층(superficial layer)에서는 발견되지 않아 증식 영역에서 주로 분포하며 활동을 하는 유전자로 추정되고 있다.¹³⁾ 또 핵내에 주로 분포하는 것으로 보여(nuclear localization) DNA 복구 작업에 관여할 것이라는 가설을 뒷받침하는 증거가 되고 있다.¹³⁾ 이러한 MLH1, MSH2 유전자의 결손시 미세위성 서열(microsatellite sequence)등의 복제과정에서 오류가 발생하고 이러한 오류가 복구되지 않음으로써 돌연변이가 발생하여 발암유전자(oncogene)를 활성화시키거나 암 억제 유전자(tumor suppression gene)를 불활성화시켜 종양의 악성 전환과 관련이 될 것으로 보여지고 있다.¹²⁾ Fishel 등은 MLH1과 MSH2의 돌연변이가 유전성 비폴립증 결장암(hereditary nonpolyposis colon cancer；HNPCC)의 발생과 관련된다고 보고하였다.¹³⁾ 그들은 HNPCC에서 가장 흔한 돌연변이는 exon 12와 13에서 MSH2, exon 15, 16에서 MLH1이라고 하였다. 돌연변이를 보이는 하나의 반복되는 서열인 미세위성 서열의 불안정성은 이러한 HNPCC의 암 발생과 관련이 있는 것으로 생각되고 있다. 또한 DNA ploidy와 관련되어 exon 상실과 유전자 불안정성과 관련되는 연구도 진행되었다. 흑색점(lentigo)에서는 ploidy와 관련하여 exon 양성 종양과 exon 음성 종양사이에 차이가 없었고, 악성 흑색종에서는 두배수체 세포(diploid cell), 홀배수체 세포(aneuploid cell), 네배수체 세포(tetraploid cell)에서는 종양과의 관련성이 유의하게 높았던 결과를 보였다.¹⁴⁾ 이러한 서열상의 불안정성으로 인한 결손은 자궁내막암, 결장암, 전립선암, 그리고 유방암에서도 보고되어 여러 암에서 발현될 수 있는 것으로 인정되었다.¹⁵⁾
   악성 흑색종은 피부와 점막형의 두 가지 유형이 있고, 두경부 영역에서 더욱 공격적인 진행형태를 보인다. Manolidis와 Donald¹⁶⁾의 연구에 의하면 두경부 영역 중에서도 구강 점막 흑색종이 더욱 더 악성도가 높다고 하였다. 구강 점막 흑색종에 대한 Muzio 등¹⁷⁾의 연구에서 9명 중 1명이 MSH2의 단백질의 핵내 염색에서 양성을 보여 11%의 양성률을 보였다고 하였다. 본 연구에서도 역시 점막 악성 흑색종에서 핵내 단백질 염색상 MSH2 45%, MLH1 9%의 양성률을 보였고, 피부 악성 흑색종에서도 MSH2 25%, MLH1 25%의 양성률을 보여 단백질의 발현이 저하되는 것을 확인할 수 있었다.
   Hussein 등¹⁸⁾에 의하면 다양한 멜라닌세포에서 부조화 복구 단백질을 염색해 보았을 때 멜라닌세포 모반(melanocytic nevi)에서 멜라닌세포 형성이상 모반(melanocytic dysplastic nevi), 그리고 피부 악성 흑색종(cutaneous malignant melanoma)으로 진행하면서 면역반응력(immunoreactivity)이 점점 감소한다고 한다. 본 연구에서도 재발한 악성 흑색종의 경우 MLH1이 양성에서 음성으로 소실되는 것을 알 수 있었다. 
   Rass 등¹⁹⁾은 멜라닌 암세포에서 mRNA를 추출하여 MSH2 유전자의 변성을 확인하였는데, MSH2 유전자의 발현이 세포의 악성화와 관련되어 소실되는 것을 보고하였다.
   Leach 등²⁰⁾은 유전성 비폴립증 결장암(hereditary nonpolyposis colon cancer；HNPCC)에서 MSH2 돌연변이시 단백질의 분자량이 절반으로 줄어들지만, 특정 단클론 항체를 사용하여도 돌연변이 산물인 RNA나 단백질이 불안정하여 결과가 잘 검출되어 나오지 않을 수 있음을 지적하였다. 그러나, Rass 등¹⁹⁾은 임상적으로 DNA검사보다 항체에 의한 단백질 검사가 더 도입하기 쉽고, 암조직에서 MSH2 단백질저하를 면역탁본(immunoblot)법으로 분석하는 것은 진단용으로 적절하지 않으나 면역조직화학분석(immunohistochemical analysis)으로 발견하는 방법이 결손 MSH2에 관련된 부조화 복구를 발견하는 선별검사로 이용될 수 있다고 제안하였다. 향후 더 많은 연구를 통하여 부조화 복구 유전자의 소실유무를 면역조직화학염색하는 방법을 재발성 혹은 전이 고위험군 악성 흑색종에서 이용할 수 있을 것이다. 

결     론

   두경부영역의 점막 악성 흑색종군을 대상으로 한 연구에서, MLH1, MSH2의 발현이 저하되는 것을 관찰할 수 있었다. 악성 흑색종의 상당한 부분에서 발견되는 부조화 복구 손상 기전의 이상이 이들 종양의 발생과 관련되는 것으로 보이며, 향후 추가 연구를 통해 면역화학염색으로 질병을 진단, 추적 관찰하는 데 도움이 될 수 있는 것으로 생각 된다.

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