교신저자：임도형, 100-272 서울 중구 필동 2가 82-1  중앙대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   편평세포암종은 두경부 영역에서 가장 흔한 악성 종양으로 우리나라에서도 흡연이나 음주 등의 문제들로 인해 그 발생이 증가 추세에 있다. 최근 들어 수술, 화학요법, 방사선 치료의 발달에도 불구하고 두경부암 환자들의 생존율은 크게 좋아지지 않고 있는 실정이다. 따라서 두경부암의 예방이나 치료에 있어서 새로운 분자생물학적 연구가 활발하게 이루어지고 있다.
   두경부암을 포함하는 고형성 종양의 성장과 전이에 있어 신생혈관생성(angiogenesis)은 핵심적인 과정으로,¹⁾ 현재 알려진 혈관신생촉진인자로는 vascular endothelial growth factor(VEGF), basic fibroblast growth factor(FGF), transforming growth factor-β(TGF-β), platelet-derived endothelial cell growth factor(PD-ECGF) 등이 있다.²⁾ 이들 중 VEGF는 강력한 혈관신생촉진인자로서 종양조직에서 분비되어 주변조직에서 종양으로의 신생혈관 생성을 촉진시키고 혈관의 투과성을 증가시키는 것으로 알려져있다.³⁾ VEGF는 혈관내피세포에 선택적으로 작용하는 34~46 kDa의 단백질로 다양한 장기에서의 악성 종양에서 발현됨이 밝혀졌다. 
   두경부 편평세포암종의 악성도를 평가하는 방법으로는 종양의 원발병소, 경부 림프절 전이, 원격 전이를 종합한 TNM 병기 분류법이 널리 인정되고 있다. 근래에 들어 이러한 TNM 병기 분류와 신생혈관 생성에 관여하는 인자들 간의 상관관계가 연구되면서 강력한 혈관신생촉진인자인 VEGF의 과발현이 종양의 크기 및 침습성과 관련이 있다고 보고 된 바 있다.⁴⁾⁵⁾ 그러나 일부에서는 VEGF의 과발현이 종양의 크기나 림프절 전이와 무관하다는 보고도 있는 실정이다.⁶⁾
   이에 저자는 기존의 연구들과 같이 두경부암 중 가장 많은 빈도를 차지하고 있는 후두암에서 분화도와 임상적 병기에 따른 VEGF의 발현율과 기존의 TNM 병기 분류법과의 상관관계가 있는지 알아보고자 본 연구를 시행하였다.

재료 및 방법

재  료
   1991년 1월부터 2000년 12월까지 10년 동안 이비인후과학교실에서 후두편평세포암종으로 진단하여 조직 검사 및 후두 절제술을 시행한 환자의 표본조직 가운데 비교적 상태가 양호한 28예를 대상으로 하였다. 21예에서는 전후두적출술과 선택적 경부절제술을 시행하였으며, 7예에서는 직접 후두경하 조직 생검을 시행하였다. 
   환자들의 연령 분포는 40세에서 75세까지 다양하였으며 평균 연령은 53.3세이고 성별 분포는 28예 모두에서 남성이었다. 종양의 발생 위치는 성문상암이 9예, 성문암이 13예, 그리고 성문암과 하인두암이 동반된 경우가 6예 있었다. 조직검사 결과 전 례에서 편평세포암종으로 진단되었으며 세포의 분화도에 따라 well, moderately, poorly로 구분을 하였다. 
   후두암의 병기는 1997년 미국 암학회에서 발표한 병기분류에 의해 1기, 2기, 3기, 4기로 분류하였다. 

방  법

면역조직화학적 염색 방법
   조직의 파라핀 블록에서 파라핀을 제거한 뒤 0.05 M의 Tris buffer로 각각 2분간 3차례씩 슬라이드를 세척하고, 3분간 무수메탄올에서 3% 과산화수소를 가지고 조직을 처리하였다. 각각 5분간 3차례씩 0.05 M의 Tris buffer로 슬라이드를 세척하고 0.01 M의 Citrate buffer(pH 5.6)에 담궈서 고압멸균하여 Epitope를 상기시킨 뒤 실온에서 천천히 식혀주었다. 0.05 M의 Tris buffer로 각각 5분간 3차례씩 슬라이드를 세척하고 serum blocking 용액으로 실온에서 60분간 배양하였다. Serum blocking 용액을 털어버리고 마우스에서 추출한 VEGF 단일클론항체(Catalog No. SC-152, Cayman Chemical, USA)를 50배 희석하여 하룻밤 동안 조직에 처리하여 주었다. 0.05 M의 Tris buffer로 각각 5분간 3차례씩 슬라이드를 세척하고 비오틴이 결합된 항마우스 이차항체로 실온에서 15분간 배양한 뒤, 0.05 M의 Tris buffer로 5분간 3차례씩 슬라이드를 세척하고 효소 결합체로 실온에서 15분간 배양하였다. 0.05 M의 Tris buffer로 5분간 3차례씩 슬라이드를 세척하고 3-amino-9-ethyl carbazole(AEC) chromogen으로 발색시킨 뒤 증류수로 5분간 3차례씩 슬라이드를 세척하고 Mayer Hematoxyline으로 대조 염색 후 Gelatin mountant로 슬라이드를 제작하였다. Kit는 Histostain SP kit(Zymed LAB-SA detection system, USA)를 사용하였다.

염색 정도의 판정
   염색된 모든 조직표본은 저배율(100배 시야)로 관찰하면서 VEGF 항체에 염색이 잘된 부분을 선택하여 고배율(200배 시야)에서 관찰하여, 염색의 강도에 따라 약(weak), 중(moderate), 강(strong) 양성으로 분류하였고 조직표본 중 염색된 면적을 기준으로 50% 이상인 경우를 미만성(diffuse), 50% 미만을 국소성(focal)으로 구분하였다. 판정 기준은 정상 상피 조직에서의 VEGF 항체에 대한 염색 정도를 고려하여 미만성으로 중양성 이상을 보이는 경우에서 양성으로 판정하였고 나머지를 음성으로 판정하였다. 

연구자료의 분석
   후두암의 분화도 및 병기에 따른 VEGF의 발현율의 분석은 SPSS version 8.0 프로그램을 이용하여 Pearson Chi-Square test를 실시하였고 유의수준은 5%이내로 하였다.

결     과

후두암의 분화도에 따른 VEGF의 발현율
   면역조직화학염색법을 이용한 VEGF의 발현율은 분화도가 좋은 종양의 경우 전체 16예 중 5예(31.3%)에서 VEGF 항체에 대한 양성 반응을 보였으며, 11예(68.7%)에서 음성 반응을 나타내었다. 그에 비해 분화도가 낮은 종양의 경우 전체 12예 중 7예(58.3%)에서 양성 반응을 보였으며 나머지 5예(41.7%)에서는 음성 반응을 나타내어 통계학적으로 유의한 염색 차이를 보였다(p<0.05)(Table 1). 
   VEGF 항체에 대한 면역조직화학적 염색 양상은 분화도가 낮은 종양의 경우 전반적으로 염색이 잘 되었으며 주변의 정상조직에는 염색이 되지 않았다(Fig. 1). 분화도가 좋은 종양에서는 VEGF 항체에 대한 염색이 전반적으로 약하거나 거의 되지 않았다(Figs. 2 and 3).

후두암의 임상병기에 따른 VEGF의 발현율
   전체 28예 중 병기를 알 수 없었던 1예를 제외한 27예를 대상으로 1기의 경우 5예 중 모두(100%)에서 VEGF 항체에 대해 음성 반응을 나타내었으며, 2기에서는 6예 중 2예(33.3%)에서 양성을, 4예(66.7%)에서는 음성 반응을 보였으며, 3기에서는 7예 중 3예(42.9%)에서는 양성을, 4예(57.1%)에서는 음성 반응을 보였고, 4기에서는 9예 중 6예(66.7%)에서 양성을, 3예(33.3%)에서는 음성 반응을 보였으나(Table 2) 1, 2기와 3, 4기간의 통계학적인 유의성은 없었다(p>0.05). 

고     찰

   신생혈관 형성은 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관을 만드는 과정으로 종양의 증식과 전이에 필수적이다.¹⁾ 이 과정은 혈관신생인자(angiogenetic factor)에 의해 조절되는 것으로 알려져 있다. 종양세포에 대한 영양공급은 직경 2 mm까지는 확산으로 가능하나 그 이상의 성장에는 혈관을 통한 영양공급을 필요로 한다. 또한 복잡한 신생혈관 형성과정이 기존혈관의 기저막을 파괴하고 내피세포의 이주를 촉진하며, 종양의 신생혈관은 정상혈관보다 혈관벽이 약하여 보다 쉽게 암세포가 침습할 수 있어 림프절 전이의 통로가 될 수 있으므로 신생혈관 형성은 암세포의 성장과 전이에 중요하다.⁷⁾ 
   1971년 Folkman¹⁾⁷⁾ 등이 종양의 성장과 혈관신생이 밀접하게 연관된다는 것을 처음으로 주창한 이래 FGF, angiogenin, tumor growth factor-α(TGF-α), tumor growth factor-β(TGF-β), tumor necrosis factor α(TNF-α), VEGF, PD-ECGF, granulocyte colony-stimulating factor, proliferin, placental growth factor, interleukin-8, hepatocyte growth factor 등의 혈관 신생인자가 알려져 있다.²⁾ 이 중에서 VEGF는 34~46 kD의 당단백으로 혈관내피세포에 선택적으로 작용하며, 121, 165, 189, 206개 아미노산을 가진 4개의 이형체로 이루어져 있고 이 중 VEGF121, VEGF165 만이 확산성을 가지며 세포 외로 분비되어 기능을 하는 것으로 알려져 있다.⁸⁾ 이는 처음 신경교종에서 역할이 밝혀진 후 여러 조직에서 VEGF의 발현이 보고 되었고 실험적으로 암세포 배양시 혈관내피세포의 증식에 중요한 역할을 함이 알려졌다.⁹⁾ 이후 식도암, 소세포폐암, 갑상선암,⁹⁾ 유방암,¹⁰⁾ 자궁경부암 등에서의 연관성이 발표됐고 최근 들어 두경부암에서의 신생혈관 형성에 중요하게 관여하는 것으로 밝혀지고 있다.¹¹⁾
   VEGF는 적어도 두 가지 기전으로 혈관신생에 관계하는 것으로 생각된다. 첫째 두 개의 tyrosine receptor 단백(flt-1, kdr)과 결합하여 직접 혈관내피세포의 세포분열을 촉진시켜 강력한 혈관신생인자로 작용하며,¹²⁾ 둘째 미세혈관의 투과도를 증가시키는 강한 매개자 역할을 한다. 미세혈관의 투과도가 증가하면 혈장단백이 주변 조직으로 배출되어 세포 외 기질을 변화시켜 혈관신생을 용이하게 한다.¹¹⁾
   VEGF 발현의 조절 기전은 아직 불명확하다. 산소결핍이 일부 종양에서 VEGF의 발현을 증가시킴이 보고되어 있고¹²⁾ 후두 상피세포암의 괴사부위 근처 대식세포에서도 VEGF의 발현이 관찰되었다. 최근의 연구에서는 산소결핍 뿐만 아니라 종양세포나 기질세포에서 분비되는 TGF-α, platelet-derived growth factor(PDGF), epidermal growth factor 등의 cytokine이 VEGF의 과발현과 혈관신생에 영향을 주는 것으로 보고되고 있다.¹³⁾
   두경부종양에서 현재 가장 중요한 예후예측지표로는 종양의 크기, 경부림프절 전이, 전신전이의 내용이 포함된 TNM staging이며 VEGF의 발현과 환자의 예후 간의 관련성을 찾고자하는 연구가 활발하다. VEGF의 발현이 종양의 침습성과 관련이 있다는 보고가 있으며,⁴⁾ 초기 병변보다는 주로 진행된 편평세포암종이나 림프절 전이가 있는 경우에 대부분 나타난다고 보고되고 있다.⁵⁾ 그러나 일부 연구에서는 두경부 편평세포암종의 VEGF 발현과 종양의 크기, 경부림프절 전이 등의 임상적 병기 사이에 상관관계가 없다고 보고 되었다.⁶⁾¹⁴⁾ 혈중 VEGF 농도를 측정한 연구에서는 대부분의 두경부 편평세포암종 환자에서 정상인의 32.7 pg/ml에 비해 유의하게 높은 144 pg/ml의 평균치를 보였다.¹⁵⁾ 또한 일부에서는 종양의 미세혈관 밀도가 종양의 진행과 재발에 밀접한 관련이 있다고 보고하고 있다.¹⁶⁾ 그러나 두경부 편평세포암종 환자의 생존과 미세혈관 밀도 사이에 상관관계를 찾을 수 없었다는 발표도 있다.¹⁷⁾ 즉 아직까지는 VEGF 발현과 환자의 예후 사이의 상관관계가 명확지 않은 상황이다.
   본 연구에서는 두경부암종 중 후두암에서의 VEGF의 발현에 대해 연구하였으며 이를 후두암의 분화도나 병기와 연관하여 분석하였다. 분화도가 좋은 종양의 경우 16예 중 5예에서 VEGF 항체에 대한 염색이 강하게 나타났으며, 염색 양상을 보면 세포질 내에 국한된 과립 양상으로 종양 세포에만 염색이 되었으며 주변 정상조직에는 염색이 되지 않았다. 또한 기저부 및 기저 상부에는 염색이 강하게 나타난 반면 기질내로 종양 세포가 침윤해 들어간 곳에서는 염색이 안 되거나 약하게 나타난 것으로 VEGF의 발현과 상피세포기원의 종양과의 연관성을 시사해 주고 있다. 분화도가 낮은 종양에서는 12예 중 7예에서 VEGF 항체에 대한 양성이 관찰되었으며 5예에서는 음성으로 나타났다. 따라서 종양의 분화도와 VEGF 발현과의 상관성이 있을 것으로 사료된다.
   후두암의 병기를 나누어보면 병기가 확인된 전 27예 중 1기가 5예, 2기가 6예, 3기가 7예, 4기가 9예 있었으며 다른 장기로의 전이가 있었던 경우는 없었다. 이 중 1기에서는 VEGF 항체에 대한 염색이 모두 음성으로 나타났으나 2기에서는 2예, 3기에서는 3예, 4기에서는 6예가 양성반응을 보였고, 따라서 낮은 병기(1, 2기) 보다는 높은 병기(3, 4기)에서 VEGF의 발현이 강해지는 경향을 보였다. 
   본 연구는 상대적으로 적은 표본 수와 동결 절편된 검체는 전체 병변 중 일부분만이 포함되어 편평세포암종이 가지는 병리조직학적인 이질성의 변수를¹⁸⁾ 감안하지 못했다는 점과 검체의 반정량적인 분석방법을 이용하여 판정에 해부병리학자의 주관적인 판단이 개입될 수 있다는 한계점을 가지며 추후에 분자생물학적 방법 등을 이용, 이러한 문제점을 보완하여 실험한다면 VEGF의 발현과 종양의 분화도나 병기, 예후 등의 임상지표와 관련성 여부가 보다 명확해지고 이의 임상적 응용이 가능할 것으로 보인다. 

결     론 

   후두에서 발생한 편평세포암종을 대상으로 VEGF 단일 클론 항체를 이용, 면역조직화학적으로 염색하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
   VEGF의 양성 발현율은 분화도가 좋은 암종에서 31.3%, 분화도가 낮은 암종에서 58.3%로 분화도가 나쁠수록 통계학적으로 유의하게 발현율이 증가하는 경향을 보였다(p<0.05). VEGF의 양성 발현율은 1기에서는 0%, 2기에서는 33.3%, 3기에서는 42.9%, 그리고 4기에서는 66.7%로 병기의 진행에 따라 발현율이 증가하는 경향을 보였지만 각 병기에 따른 통계학적인 유의성이 없었다. 
   이상의 결과를 종합하면 후두암에 있어서 VEGF의 발현은 본 연구에서 분화도가 나쁠수록, 병기가 진행할수록 과발현되는 경향을 보였으며 향후 보다 객관적인 방법을 이용한 정량적인 분석이 필요할 것으로 사료된다.

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