교신저자：전시영, 660-751 경남 진주시 칠암동 90번지  경상대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   과민반응이란 어떤 자극에 대한 반응이 정상인에 비해 증강되어 나타나는 현상으로 천식, 알레르기 비염 등의 호흡기 질환에서 특징적으로 보이는 현상 중의 하나이다.¹⁾ 이러한 과민반응의 발병기전은 아직 명확히 밝혀지지 않았다. 알레르기 비염에서 과민반응의 발병기전은 기관지 과민반응보다 더 알려져 있지 않지만 첫째, 상피세포가 손상되고 상피 투과성이 증가됨으로 인해 자극물질이 감각신경의 종말, 혈관, 분비선에 쉽게 접촉하여 발생한다는 설, 둘째, 감각신경 종말의 민감도가 증가하여 정상적인 자극에도 반응이 증가한다는 설, 셋째, 혈관이나 비선 등의 반응성이 증가한다는 설 등이 있다.²⁾ 알레르기 반응이 일어나는 데에는 다양한 매개체, 즉 혈소판활성인자(1-O-hexadecyl-2-acetyl-sn-glycerol-3-phosphocholine), 히스타민, prostaglandin, leukotriene, thromboxane, bradykinin, 등이 관여한다.³⁾ 이 중 혈소판활성인자는 생물학적으로 활성을 띈 내인성 인지질로서 비반세포, 호산구, 중성구, 단핵세포의 phospholipase A2에 의해 생성되는 염증성 매개체로 호흡기 평활근을 수축시키고, 혈장의 삼출을 유도하며, 염증세포 특히 호산구와 중성구를 응집시키는 것으로 보고되고 있다.⁴⁾ 또 혈소판활성인자는 기관지 과민반응을 가장 강하게 야기하는 것으로 알려져 있다.⁵⁾⁶⁾ 산화질소(Nitric oxide, NO)는 세포내에서 산화질소 합성효소(NO synthase, NOS)에 의해 아미노산 L-arginine으로부터 합성되는 기체로 유기체의 신호들을 전달한다고 알려져 있다.⁷⁾ 호흡기에서의 NO의 역할은 콜린성 신경에서 신경전달물질로서 작용하고, 혈관내피세포에서 혈관 운동성 조절과 혈장의 삼출에 관여한다고 보고되었으며, 염증세포에서는 병원체에 대해 방어적인 역할과 조직에 손상을 주는 병적인 역할을 함으로서 근래에는 기관지 천식 혹은 알레르기성 비염의 진단에서 호기 중의 NO가 염증 표시자로서 임상에 적용되고 있다.⁸⁾ 최근에는 신경성 혈관 삼출과 알레르기성 호흡기 과민반응에도 관여하는 것으로 보고되고 있다.⁹⁾¹⁰⁾
   그동안 알레르기성 비염이나 천식에서의 과민반응에 관한 보고가 많았지만 비부비동염에서 비 과민반응이 나타난다는 보고는 거의 없는 실정이다. 또 비 과민반응의 형성에 NO가 어떤 연관성을 보이는지 아직 확실치 않다. 따라서 본 연구에서는 우선 흰쥐에 혈소판활성인자를 투여하여 비부비동염 모델을 만들고 호산구 침윤과 상피세포의 손상 등 조직학적 관찰을 하였고, 이러한 비부비동염 모델에서 비 과민반응이 나타나는지 알아보기 위하여 capsaicin을 투여하고 혈장 삼출의 변화를 관찰하였다. 다음 단계로 비 과민반응에서 iNOS와 NO의 역할을 밝히기 위해 iNOS 억제제를 투여하였을 때 capsaicin에 대한 반응이 어떻게 차이가 나는지 관찰하였으며 마지막으로, 조직면역화학염색을 하여 혈소판활성인자에 의해 유발된 비부비동염 흰쥐모델의 비 점막에서 iNOS 발현을 관찰하였다.

실험 동물과 방법

실험 동물
   실험동물로는 체중 250~350 g의 외견상 건강하고, 비공이 깨끗한 4~6주령의 Sprague-Dawley계의 126마리의 흰쥐를 사용하였다. 실험군 72마리와 대조군 54마리로 나누었으며 실험기간 중에는 동일한 조건하에서 사육하였다.

방  법

혈소판활성인자에 의한 비부비동염 흰쥐 모델제작과 조직처리
   Ketamine hydrocloride(Ketalar, 75 mg/kg)와 xylazine hydrocloride(Rampun, 10 mg/kg)의 혼합용액을 복강내 주사하여 마취하였다. 실험군 18마리에는 16 μg/ml의 혈소판활성인자용액을 양쪽 코구멍에 각 50 μl씩 점적하였으며, 대조군 18마리에는 동량의 매개체(vehicle, 실험군에 투여한 혈소판활성인자용액 중에서 혈소판활성인자만 뺀 용액)를 점적하였다. 그리고 실험군과 대조군 모두 1일, 3일, 5일간(각각 6마리)의 생존기간을 둔 후 각각 해당일에 다시 마취하고 전흉벽을 절개하여 대동맥에 16게이지 도관을 삽입하여 0.9% 생리 식염수 200 ml로 관류한 다음 곧 이어 1% paraformaldehyde(PFA) 첨가한 0.1 M의 인산완충액 200 ml로 관류고정하였다. 이후 흰쥐의 머리를 적출하여 고정액에 4°C에서 2시간동안 담가 후고정을 한 뒤 1주일간 250 mM EDTA【ethylene diamine tetra acetic acid (pH 7.4)】용액에 담궈 탈회를 실시하였다. 면도칼로 앞니의 바로 뒤쪽과 어금니의 바로 앞쪽에서 조직을 취하였다. -20°C의 cryostat를 이용해 10~20 μM 두께로 연속절편을 제작하여 gelatine coating slide에 올린 후 -80°C에 보관하였다. 비점막의 일반적인 형태학적 변화, 즉 비강내의 중성구 군집, 상피세포의 손상, 조직내 호산구의 침윤 등을 관찰하기 위해 Hematoxylin & Eosin(H & E) 염색을 하였으며, 배상세포를 관찰하기 위해 Alcian Blue(AB) 염색을 한 뒤 methly green으로 대조염색을 하였다. 염색된 각 조직에서 중성구 군집의 수는 40배의 저배율에서 모든 비강에서 그 수를 세었으며, 호산구와 상피세포 손상의 수는 비점막에서 10군데를 정하여 400배의 고배율에서 세었다. 배상세포의 수는 호흡상피가 있는 비점막에서 4군데를 정해 400배의 고배율에서 세었다.

혈소판활성인자에 의한 비부비동염군과 대조군에서 capsaicin에 대한 혈장 삼출의 변화
   실험군 27마리에는 16 μg/ml의 혈소판활성인자 용액을 흰쥐의 양쪽 코구멍에 각 50 μl 씩 점적하였으며, 대조군 27마리에는 실험군과 동일한 양과 방법으로 매개체를 점적하였다. 그리고 실험군과 대조군을 각각 9마리씩 나누어 1일, 3일, 그리고 5일 간의 생존기간을 둔 후 각각 해당일에 다시 동일 마취액으로 마취하고 꼬리 정맥을 확보한 뒤 30 mg/ml의 Evans blue 용액을 흰쥐 100 g당 0.1 ml씩 천천히 주사하였다. 5분을 기다린 후 흰쥐의 양쪽 코구멍에 10 μM/ml capsaicin 용액 30 μl를 micropippet로 점적하였다. 다시 5분을 기다린 후 전흉벽을 절개하여 심장을 노출한 다음 우심방을 절개하여 실혈시켰다. 생리 식염수 200 ml로 관류하고 곧 이어 1% PFA 첨가한 0.1 M의 인산완충액 200 ml로 관류고정을 하였다. 이어서 비중격과 비갑개에서 손상을 주지 않도록 주의하면서 점막을 박리하였다. 얻은 조직의 무게를 구한 후 2 ml formamide 용액에 24시간동안 60°C로 유지 배양하였고 이를 분광광도계(Beckmam, DU 650, USA) 620 nm에서 측정하였다.

혈소판활성인자에 의한 비부비동염에서 aminoguanidine 전처치 후 capsaicin에 대한 혈장 삼출의 변화
   전술한 방법과 같이 실험군 27마리와 대조군 9마리를 처리하고 꼬리 정맥을 확보한 뒤 75 mg/ml aminoguanidine을 흰쥐 100 g당 0.1 ml을 천천히 주사하였고 1시간을 기다린 후 30 mg/ml의 Evans blue 용액을 흰쥐 100 g당 0.1 ml씩 천천히 주사하였다. 5분 후 흰쥐의 양쪽 코구멍에 10 μM/ml capsaicin 용액 30 μl를 점적하였다. 다시 5분 후 관류고정하였다. 이어서 비중격과 비갑개로부터 손상을 주지 않도록 주의하면서 점막을 박리하였다. 얻은 조직의 무게를 구한 후 2 ml formamide 용액에 24시간동안 60°C로 유지 배양하였고 이를 분광광도계 620 nm에서 측정하였다.

혈소판활성인자에 의한 비부비동염에서 iNOS에 대한 면역조직화학염색
   위의 혈소판활성인자에 의한 비부비동염 흰쥐모델제작과 조직처리에서 기술한 방법과 같은 방법으로 조직처리를 하였다. 냉동조직절편을 0.5% periodic acid에 실온에서 10분 동안 처리하여 내인성 peroxidase의 활성을 억제하였다. 조직절편에 차단혈청용액(3% normal goat serum, 1% bovine serum albumin, 0.3% triton X-100 in 0.1 M PBS)을 점적하여 실온에서 3시간 동안 반응시킨 후 희석한 일차 항체(1：1,000 rabbit anti-iNOS serum, Transduction laboratories Inc., KY)에 실온에서 15시간 동안 반응시켰고 이차 항체(biotinylated anti-rabbit IgG in 3% normal goat serum, 1% bovine serum albumin, 0.3% triton X-100 in 0.1 M PBS)에 실온에서 1시간 처리하였다. avidin-biotin-complex(Vector laboratories Inc., Burlingame, CA)에 실온에서 30분 동안 반응시킨 후 Karnovski-Nickel용액(0.025% diaminobenzidine, 0.04% nickel chloride, 0.03% hydrogen peroxide in PBS)에 3분 동안 발색시키고 methyl green으로 대조 염색하였다.

통계분석
   통계분석은 실험군과 대조군간의 차이는 t-test를 이용하였으며, 실험군과 대조군의 시간별 차이는 일원분산분석(ANOVA)을 이용하였다. 유의수준은 p<0.05 범위로 정하였다.

결     과

혈소판활성인자에 의한 비부비동염 모델에서 관찰된 조직학적 변화
   H & E 염색에서 중성구 군집, 호산구 침윤, 그리고 상피세포의 손상은 대조군보다 실험군에서 1일, 3일 그리고 5일 모두 현저한 증가를 보였다(t-test, p<0.01). 실험군에서 혈소판활성인자 투여 후 1일째에 중성구 군집, 호산구 침윤, 그리고 상피세포의 손상이 관찰되어 3일째에 그 수가 현저히 증가(ANOVA, p<0.05) 하였으나 5일째에는 조금 감소하는 소견을 보였다(Figs. 1 and 2). AB 염색에서 배상세포는 대조군보다 실험군에서 1일, 3일 그리고 5일 모두 현저한 증가를 보였다(t-test, p<0.01). 실험군에서 혈소판활성인자 투여 후 1일째부터 배상세포가 증가하기 시작하여 3일째 그 수가 현저히 증가(ANOVA, p<0.01) 하였으며 5일째에는 약간 감소하는 소견을 보였다(Figs. 1 and 2). 

혈소판활성인자에 의한 비부비동염군과 대조군에서 capsaicin에 대한 혈장삼출의 변화
   대조군보다 실험군에서 1일, 3일 그리고 5일 모두에서 비점막에 삼출된 Evans blue의 양이 현저히 증가되어 있었다(t-test, p<0.01). 실험군에서 혈소판활성인자 투여 후 3일째에서 Evans blue 삼출이 가장 증가함을 관찰할 수 있었다(ANOVA, p<0.01)(Fig. 3).

혈소판활성인자에 의해 유발된 비부비동염에서 aminoguanidine 전처치 후 capsaicin에 대한 혈장 삼출의 변화
   Aminoguanidine을 전처치하지 않은 군에 비해 aminoguanidine을 전처치한 군에서는 1일, 3일 그리고 5일 모두에서 비점막에 삼출된 Evans blue의 양이 현저히 감소되어 있었다(t-test, p<0.01). 그리고 1일, 3일 그리고 5일째 측정한 비점막에 삼출된 Evans blue의 양은 통계학적으로 유의한 차이가 없었다(Fig. 4).

혈소판활성인자에 의해 유발된 비부비동염에서 iNOS에 대한 면역조직화학염색
   iNOS 양성 염증세포들은 비점막과 비강 내의 삼출물에서 관찰되었다(Fig. 5). 비점막내의 iNOS 양성 염증세포는 대조군보다 실험군에서 1일, 3일 그리고 5일 모두 현저한 증가를 보였다(t-test, p<0.01). 실험군에서 혈소판활성인자 투여 후 1일째에서 iNOS 양성 염증세포의 수가 관찰되어 3일째에서 그 수가 현저히 증가(ANOVA, p<0.01) 하였으며 5일째에는 감소하는 소견을 보였다(Fig. 6).

고     찰

   비부비동염 모델은 동물은 비교적 크고, 수술적 조작이 용이하기 때문에 토끼가 널리 이용되어 왔으며, 유발하는 방법도 매우 다양하게 발표되어 있다.¹¹⁾¹²⁾ 흰쥐는 의학적 연구에 광범위하게 사용되고 있으나 아직 흰쥐를 이용한 실험적 비부비동염 모델이 보고된 바가 없으므로 본 연구에서는 Sprague-Dawley계의 흰쥐를 사용하였으며, 염증성 매개체인 혈소판활성인자를 이용하여 비부비동염 흰쥐모델을 만들었다. 실험적으로 유발한 급성 비부비동염에서는 상피하 부종, 소정맥의 확장, 배상세포의 형성, 섬모의 융합 및 탈락, 상피세포의 괴사 및 궤양, 중성구, 임파구, 형질세포, 대식세포 등의 염증세포 침윤, 편평상피로의 이행 등의 병리학적 변화가 나타난다고 알려져 있다.¹³⁾ 흰쥐를 사용한 본 연구에서도 혈소판활성인자를 점적한 실험군에서 대조군에 비해 비강 내에서 중성구 군집, 비점막내 호산구 침윤, 상피세포 손상, 배상세포의 과형성 등이 현저하게 증가됨을 관찰하였다. 이러한 현상은 모두 1일째부터 나타나기 시작하여 3일째에서 현저한 증가를 보였으며 5일째에는 감소하였다. 5일째 감소한 이유는 혈소판활성인자가 급성 비부비동염을 일으켰다가 호전되는 양상이라고 사료된다. 따라서 혈소판활성인자를 흰쥐의 비강 내에 점적하였을 때 비부비동염이 유발됨을 확인할 수 있었다. 
   비 반응성을 측정할 수 있는 물질로는 histamine, metacholine, capsaicin, substance P 등이 있으며, 비 반응성을 측정할 수 있는 방법으로는 증상점수, 혈관확장, 비 저항, 점액분비 등이 있다.¹⁴⁾ 본 연구에서는 capsaicin과 혈장삼출을 보기 위한 Evans blue assay를 선택하였다. 그 결과 혈소판활성인자를 투여한 실험군에서 vehicle 용액을 투여한 대조군에 비해 capsaicin 투여 후 혈장삼출이 유의하게 증가함이 관찰되었다. 따라서 혈소판활성인자에 의한 비부비동염 흰쥐모델에서 비 과민반응이 나타남을 명백히 알 수 있었다. 
   많은 학자들은 endothelial 또는 neuronal NOS, 그리고 염증세포로 부터의 iNOS에 의해 생긴 NO가 혈장삼출을 매개한다고 보고하고 있다.¹⁰⁾¹⁵⁾ 그래서 본 연구에서는 iNOS를 선택적으로 억제하는 aminoguanidine을 사용하였다.¹⁶⁾ Aminoguanidine을 전처치하였을 때 대조군에서는 혈장삼출의 감소가 거의 없었으나 혈소판활성인자에 의한 비부비동염에서는 증가된 혈장삼출이 통계학적으로 유의하게 감소되었다. 또 iNOS에 대한 조직면역화학염색에서는 염증세포에서 iNOS의 발현을 확인하였다. 따라서 혈소판활성인자에 의해 유발된 비부비동염에서 capsaicin 투여 후 염증세포에 있는 iNOS에 의해 생성된 NO가 혈장삼출의 증가를 매개하였다는 것을 설명할 수 있었다. iNOS의 기원세포는 염증세포, 혈관내피세포, 신경세포, 그리고 상피세포 등이 있다고 알려져 있다.¹⁷⁾ 본 연구에서 사용한 anti-iNOS 항체는 혈관내피세포와 상피세포에 면역반응성이 거의 없거나 비특이적 반응이기 때문에 상피세포의 끝을 따라 있는 양성 반응은 비특이적이라고 생각되며 iNOS 발현되는 기원세포는 점막내에 침윤된 염증세포라고 사료된다.
   따라서 혈소판활성인자에 의해 유발된 비부비동염의 흰쥐모델에서 capsaicin에 대한 혈장삼출의 과민반응을 설명하였고, 점막내에 호산구의 침윤, 상피세포의 손상, 그리고 iNOS의 발현 등을 관찰함으로서 염증 정도의 유의한 변화를 보았다. 비 과민반응의 정도와 iNOS 양성 염증세포 수의 정도는 혈소판활성인자의 투여 후 시간의 변화에 따라 비슷한 양상으로 나타났으며(Figs. 3 and 6) 모두 3일째 최고점을 이루었다. 이 소견은 호산구 침윤과 상피세포의 손상처럼 염증세포에서 iNOS 발현이 비 과민반응의 원인이 될 수 있다는 것을 의미한다고 생각한다. 

결     론

   흰쥐의 비강에 국소적으로 혈소판활성인자를 투여한 후 비부비동내에서 비부비동염을 관찰하였고, 비부비동염 흰쥐모델에 capsaicin 유해자극을 가하였을 때 비 과민반응이 나타남을 확인하였다. 또 비부비동염의 흰쥐모델에 iNOS의 선택적 억제제인 aminoguanidine을 전처치 했을 때 혈장삼출이 감소되어 비 과민반응이 iNOS와 관계되어 있다는 것을 알 수 있었으며, 흰쥐모델의 비점막에서 iNOS 양성 염증세포가 증가되어 있음을 관찰하였다. 따라서 혈소판활성인자는 비 점막에 침윤된 염증세포에서 iNOS의 발현을 유도하고 이 iNOS에서 생성된 NO는 비 과민반응을 일으키는데 중요한 역할을 할 것으로 사료된다.

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