교신저자：노영수, 134-701 서울 강동구 길동 445  한림대학교 의과대학 강동성심병원 이비인후-두경부외과학교실
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서     론

   두경부 영역의 암 발생율은 전체 암의 6.6%를 차지하며 이중 대부분을 차지하는 편평세포암종의 경우 세포의 이질성이 많아 진행양상이 다양하며 예측이 어렵고 발생부위 별로 다양한 생물학적 특성과 전파경로를 가지나 조기에 발견하여 치료하면 좋은 예후를 기대할 수 있는 특징을 가지고 있다. 최근에는 여러 성장인자와 그 수용체, 암유전자, 암단백산물, 혹은 암억제유전자 변이 등을 종양세포에서 규명하여 예후와의 관련성을 밝혀 생물학적 표지자로 이용하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.
   Maspin은 인간의 유방 상피세포에서 42 kDa의 serpin 구조를 갖는 세포질 단백질로 처음 소개되었고¹⁾²⁾ 이후 유방암세포 및 전립선암세포에서 기저막을 통한 종양의 침습 및 이동 억제기능과 maspin의 프로모터 인자(promoter)와 전사조절(transcriptional regulation)기능을 매개로 종양의 유도억제와 전이억제능이 제시되었다.^2)3)4)5) 이와 같이 maspin의 종양 억제능을 뒷받침하는 다양한 연구결과에 근거하여 maspin의 발현증가와 종양의 침습 및 림프절 전이 억제와의 관련성을 제안하는 면역조직학적 연구결과가 보고 되었으나²⁾⁶⁾ 종양 환자의 생존율과 maspin의 발현정도와의 관련성을 뒷받침하는 임상적 연구는 부족한 실정이다.
   본 연구는 이에 착안하여 두경부암 중 가장 흔한 편평세포암종 환자를 대상으로 maspin의 발현정도와 임상병기, 조직병리학적 인자 및 추적생존율을 비교분석 함으로써 두경부 편평세포암종 환자에서 maspin의 예후적 의미를 평가하고 생물학적 예후인자로서의 임상적 유용성을 알아보고자 하였다.

대상 및 방법

대  상
   1996년 9월부터 2000년 7월까지 한림대학교 의과대학 강동성심병원 이비인후-두경부외과학 교실에서 두경부 편평세포암종으로 진단받고 수술을 시행받은 30예의 환자를 대상으로 하였다. 환자의 의무 기록지 및 조직병리 검사결과지를 토대로 성별, 연령, 미국 암학회(American Joint Commitee on Cancer；AJCC, 1997)의 TNM 체계에 따른 원발 종양의 크기 혹은 국소 침범정도(size and/or local invasion of the primary tumor；T), 경부 림프절 전이여부(regional lymph node involvement；N), 조직병리학적 분화도, 재발여부, 무병생존기간(disease free survival time) 등을 후향적으로 분석하였다. 성별은 남자가 22예, 여자가 8예, 연령은 36세부터 87세까지로 55세 미만이 9예, 55세 이상이 21예이었고 평균연령은 63.6세이었다. 원발병소로는 후두암 8예, 구강암 10예, 구인두암 6예, 하인두암 2예, 상악동암 3예, 피부암 1예였고, 원발 병소 병기로는 T1 2예, T2 15예, T3 5예, T4 8예이었다. 조직병리학적 분화도는 고분화군 15예, 중분화군 9예, 저분화군은 6예였고 수술 후 병리적 경부림프절 전이는 11예에서 관찰되었고 19예에서는 전이가 없었다. 추적기간은 짧게는 3개월, 길게는 49개월이었고 평균추적관찰기간은 20.7개월이었다.

방  법

면역조직화학적 염색
   수술시 적출된 종양을 10% 중성포르말린 고정과 파라핀 포매를 거친 후 hematoxylin-eosin(H-E) 염색을 시행하여 광학 현미경하에서 조직학적 유형과 등급을 정한 다음 보관 상태가 양호한 조직을 선택하여 4 μm의 연속절편으로 만들어 사용하였다.
   LSAB(labelled streptavidin-biotin) kit(DAKO, USA)를 이용한 ABC(avidin-biotin complex)기법으로 면역염색을 하였다. 파라핀 블록을 4 μm두께로 박절하여 슬라이드에 부착시킨 후 xylene에 5분간 3회 처리하여 파라핀을 제거하고, 계열별 ethanol에 처리한 후 증류수로 함수시켰다. 처리된 조직절편은 10 mM citrate buffer에 담근 후 약 5분씩 2회 microwave oven에서 끊인 다음 citrate buffer에서 약 20분 정도 식혔다. 이후 내인성 과산화 효소의 활동을 억제하기 위하여 3% H₂O₂가 포함된 methanol 용액에 20분간 처리하고 일차 항체의 비특이적 결합을 감소시키기 위하여 정상 염소혈청에 30분간 처리한 후 일차 항체인 maspin(purified human monoclonal antibody 15781A, Oncogene, Pharmingen International, USA)을 5% 소혈청 알부민을 함유한 희석액을 이용하여 1：20으로 희석하여 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. TBS(Tris-buffered saline) 완충액으로 세척한 후 biotin이 부착된 anti-mouse 항체(2차 항체, K0681, DAKO, Carpinteria, USA)를 30분간 반응시키고 TBS 완충액으로 세척한 후 streptavidin-peroxide를 30분간 실온에서 반응시켰다. 다시 TBS 완충액으로 세척한 후 발색제인 AEC(3-amino-9-ethylcarbazole)를 이용하여 5분간 반응시킨 다음 세척하여 Mayer’s hematoxylin으로 대조염색 후 wet mounting하여 광학현미경으로 관찰하였다. 음성대조군으로는 일차항체대신 Tris 완충액을, 양성대조군으로는 구개 편도적출시 채취한 정상 점막조직 5예를 상기 방법으로 염색하여 사용하였다.

판정 및 통계처리
   종양세포의 밀도가 비교적 높은 부위를 임의로 3~5곳을 선정하여 200배 시야에서 1000개의 종양세포 당 세포질내에 적갈색의 과립이 관찰되는 세포의 수를 세어 백분율(P：percentage)을 구하여 각각 25% 미만 염색군에 1점, 25%이상 50%미만군에 2점, 50%이상 75%미만군에 3점, 75%이상군에 4점을 부여하였고 염색의 강도(I：intensity)는 해부병리과 전문의 2인의 교차 판독을 종합하여 3그룹으로 구분하여 각각 1점에서 3점을 부여한 후 백분율(P)과 강도(I)를 합한 값을 3그룹으로 분류하였다. 일반적으로 염색되는 종양세포수가 많을수록 염색 강도도 증가하여 각 그룹은 백분율을 기준으로 25%미만 발현군(low), 25%이상 75%미만 발현군(intermediate), 75%이상 발현군(high)과 일치하였다.⁶⁾ 통계처리는 윈도우형 SPSS 통계 프로그램을 사용하였으며 이들의 발현 양상과 임상병리학적 인자들과의 관계는 Chi-square와 Fisher’s extract 검정으로 분석하였고 무병생존기간은 Kaplan-Meier법을 이용하였고 maspin 발현정도에 따른 각 집단간의 차이는 log-rank법을 이용하여 비교 분석하였으며, 유의수준은 p<0.05를 의의있는 것으로 하였다.

결     과

면역조직화학적 발현 양상
   Maspin의 염색은 양성대조군인 정상점막조직 5예 모두에서 발현되었으며, 편평상피세포의 기저부 및 세포질 또는 핵에 강한 발현을 보였다(Fig. 1). 두경부 종양조직에서 maspin에 대한 면역조직화학적 염색에서도 종양세포의 세포질 및 핵에 모두 염색되었으며 대부분 비만성으로 염색되었다. 총 30예의 종양조직의 염색은 경도 발현 8예(26.6%)(Fig. 2), 중등도 발현 14예(46.8%)(Fig. 3)를 나타냈고, 나머지 8예(26.6%)에서는 고발현(Fig. 4)양상을 나타냈다(Table 1).

성별 및 연령과 Maspin의 발현정도
   총 30예 중 남자가 22예(73.3%), 여자가 8예(26.7%)이었다. 22예의 남자 중 maspin은 17예(77.3%)에서 경도 및 중등도 발현을 보였고, 나머지 5예(22.7%)에서 강한 발현을 나타냈다. 여자에서는 8예 중 5예(62.5%)에서 경도 및 중등도, 나머지 3예(37.5%)에서 강한 발현을 나타냈다. 연령별 분포에 있어 55세 이상이 21예(70.0%), 55세 미만이 9예(30%)이었다. 55세 이상인 군에서 maspin의 발현은 경도 및 중등도 발현군이 16예(62.5%), 고발현군이 5예(23.8%)였고, 55세 미만인 군에서는 경도 및 중등도 발현군이 6예(66.7%), 고발현군이 3예(33.3%)였다. 성별 및 연령별 각각의 두 군과 maspin의 발현정도 사이에는 통계적 유의성은 없었다(p>0.05)(Table 2).

원발병소 및 림프절 전이와 Maspin의 발현정도
   원발병소의 병기 분류는 1997년 American joint committee on cancer(AJCC)의 기준을 따랐으며, T1이 2예(6.7%), T2가 15예(50%), T3는 5예(16.7%), T4는 8예(26.7%)이었다. 경도 및 중등도 발현군에서는 국소침습도에 따라 각각 T1 2예, T2 11예, T3 2예, T4 7예로 침습도 변화에 따른 발현 양상의 통계적 의미를 나타내지 않았고 고발현군에서는 T1 병기를 제외하고는 침습도가 진행할수록 T2 4예, T3 3예, T4 1예로 발현이 감소 양상을 보였으나 통계적 의미는 없었다. 수술 후 병리적으로 경부림프절 전이가 있었던 경우는 11예(36.7%)이었고, 없었던 경우는 19예(63.3%)이였다. 림프절 전이가 있었던 11예는 모두 원발병소에서 maspin의 발현이 경도 및 중등도 발현을 보였고 고발현군은 없었다. 경부림프절 전이가 없었던 19예에서는 11예(81.8%)에서 경도 및 중등도를 보였고 나머지 8예(28.2%)에서 강한 발현 양상을 보였다. 따라서 maspin이 강한 발현을 보일 경우 경부 림프절 전이가 억제되는 결과를 보였고 이는 통계적으로 의미있는 결과를 보였다(p<0.05)(Table 2 and 3).

조직학적 분화도와 Maspin의 발현정도
   총 30예 중 고분화도는 15예(50%), 중분화도는 9예(30%), 저분화도는 6예(20%)였고 본 연구에서는 고분화도군 및 중분화도군을 G1그룹으로 저분화도군을 G2그룹으로 분류하여 발현율을 비교하였고 두 군 사이의 통계적 유의성은 없었다(p>0.05)(Table 3).

병리학적 병기(Stage)와 Maspin의 발현정도
   총 30예 중 stage Ⅰ은 1예(3.3%), stage Ⅱ는 10예(33.3%), stage Ⅲ는 6예(20%), stage Ⅳ는 13예(43.3%)이었다. Maspin의 발현이 강한군에서는 병리학적 병기가 높아질수록 발현율이 감소하였으나 통계적 유의성은 없었다(p>0.05).

국소재발에 따른 Maspin의 발현정도
   전체 30예 모두 술 후 병리소견상 절제 경계부에 종양 침습이 없었으며 모든 치료 종료 후 9예에서 재발을 보였고 이중 8예는 술 후 방사선치료를 시행받았다. 재발군의 maspin발현정도는 경도 및 중등도 발현이 6예(66.3%), 고발현군이 3예(33.3%)였고 재발하지 않은 군에서는 16예(77%)에서 경도 및 중등도 발현을 나머지 5예(33%)에서 고발현을 보였고 두 군 사이의 통계적 유의성은 관찰할 수 없었다(p>0.05)(Table 3).

무병생존과 Maspin의 발현정도
   환자의 추적 관찰 기간은 최장 49개월, 최소 3개월이었고 평균 추적 관찰 기간이 20.7개월로 비교적 짧았기 때문에 의미 있는 평균 생존 기간(mean survival time)을 구할 수 없었다. 평균 무병 생존기간(mean disease-free survival time)은 maspin 고발현군에서는 평균 무병기간이 37.5개월, 경도 및 중등도 발현군에서는 20.7개월이었고 log rank 법을 이용한 두 군 사이의 비교에서 고발현군의 생존율이 경도 및 중등도 발현군보다 높았으며 통계적 유의성을 나타냈다.(p<0.05)(Fig. 5).

고     찰

   최근 종양의 분자 유전학적 측면에 대한 연구가 활발히 진행되면서 침윤된 종양세포가 혈관신생, 주위세포 및 세포외 기질과 유착 파손, 원격 부위로 내피 세포의 이동과 유착, 증식과정을 통해 전이가 이루어지는 일련의 과정에 관련된 다양한 종양 유전자(oncogene) 및 종양 억제 유전자(tumor suppressor gene)들이 보고되고^7)8)9)10)11) 있으나 아직까지 두경부암의 특성 및 자연경과를 예측하는 뚜렷한 인자는 얻지 못하고 있는 실정이다. 현재까지 두경부 편평세포암종의 임상경과를 예견하는 인자로는 성별, 나이, 영양 및 면역상태 등의 환자요인, 국소침습도(T병기), 경부림프절전이(N병기), 조직학적 분화도로 대표되는 종양요인과 치료요인 등이 사용되고 있다.
   이 중 maspin은 단백분해효소를 억제하는 serpin superfamily로 인간의 염색체중 18q21.3에 위치하며 종양세포의 침습, 이동, 증식에 관련된 종양 억제능을 갖는 것으로 알려져 있으나 그 작용기전은 불명확한 상태이다.¹⁾¹²⁾ 또한 maspin의 발현을 조절하는 인자에 대한 연구가 부족하나 Zou 등은 adenovirus p53 발현 벡타(expression vector)를 이용하여 maspin promoter를 조절함으로써 maspin 발현을 조절하는 연구 결과를 보고하였다.¹³⁾ Phillip 등은 유방암 조직에서 유래한 cDNA 서열을 encoding하는 maspin probe를 이용한 분석에서 maspin은 인간의 태반, 고환, 전립선, 결장, 흉선, 유방, 피부, 편도상피 등에 분포하고 용해성 세포질 단백으로 분비성 수포(secretory vesicle)와 관련된 세포내 형태(intracellular maspin)와 세포외 형태로 존재한다고 하였으며 특히 세포내 형태의 maspin은 종양의 침습, 이동, 증식에 관련한다고 보고하였다.¹⁴⁾¹⁵⁾ 또한 maspin을 발현하는 형질전환된 종양세포를 이용한 연구에서 종양의 성장 및 전이 억제능이 확인되었고 이후 유방암 환자 및 전립선암 환자의 임상 연구에서 침습성이 강한 대부분의 악성종양세포에서 maspin의 발현을 관찰할 수 없었으나 잘 분화된 종양세포에서는 국소적 발현을 나타냈다.^2)17)18)
   한편 Xia 등은 Northern blot을 이용한 maspin mRNA 발현에 대한 연구를 사람의 정상 구강 점막조직과 구강 편평세포암종에서 시행하였고 연구결과 정상 구강점막에서는 일관성있게 모든 점막에서 강한 발현을 보고하였으며 악성변환된 세포에서는 그 발현율이 감소함을 관찰할 수 있었다고 보고하였다.⁶⁾⁷⁾ 그리고 maspin mRNA의 발현율은 경부 림프절 전이가 심할수록 통계적으로 유의하게 감소하였다. 이것은 maspin이 종양의 전이와 관련된 효소의 발현에 영향을 미친다는 것을 추측할 수 있었다.
   이번 연구에서도 편도의 정상점막 5예 모두에서 maspin은 강한 발현을 나타냈고 악성종양조직에서는 그 발현정도가 감소하여 다른 여러 논문들과 유사한 결과를 얻을 수 있었다. 또한 maspin이 강한 발현을 보인 8예 모두에서 경부 림프절 전이가 나타나지 않았으며 통계적으로 유의한 결과를 얻을 수 있어(p=0.014) 국소침습과 전이과정에 관여함을 추측할 수 있었다. 그러나 원발병소, 병리적 병기, 조직학적 분화도와 발현율 사이에는 의미있는 결과를 얻을 수 없었는데 이는 암발생 기전에 근거하여 병소 주위의 간질세포에서 분비되는 cytokine 및 여러 성장인자 등과의 상관관계가 영향을 미친 것으로 생각된다. 더불어 원발 병소부위별로 보다 세분화된 연구가 부족한 것이 한 요인으로 여겨진다. 본 연구에서 원발부위별 비교가 불가능한 피부암, 상악동암을 제외한 원발 부위에 따른 maspin의 발현 정도와 림프절 전이 여부와의 차이는 미미하였으나 증례수의 제한으로 통계적 의의가 없어 추후 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다(Table 4).
   Maspin이 비교적 최근에 발견되었고 특히 두경부 편평세포암종에 대한 관심이 최근에 이루어져 현재까지 생존율과 maspin의 발현과의 상관관계에 대해 보고한 연구는 없는 실정이다. 본 연구에서도 환자의 추적기간이 20.7개월로 짧아 평균생존기간(mean survival time)에 대한 의미 있는 통계는 구할 수 없었다. 평균 무병 생존기간(mean disease-free survival time)은 maspin의 발현이 강한군에서는 37.5개월, 경도 및 중등도 발현군에서는 20.7개월이었고 log rank법을 이용한 두 군 간의 평균 무병생존기간(mean disease-free survival time) 비교에서 통계적으로 유의한 차이를 관찰하여 maspin의 발현이 강한군에서 무병생존기간 및 생존율이 높게 분석되었다.
   지금까지 발표된 여러 연구와 이 연구에서 밝혀진 것처럼 편평세포암종에서 maspin 발현의 감소는 좋지 못한 예후와 관련되며 임상적 예후 인자로서의 활용이 기대되며 maspin의 발현을 선택적으로 억제함으로써 편평세포암종의 국소 침윤 및 전이에서의 역할을 관찰할 수 있고 이의 조절기전을 통해 이러한 악성종양의 침습을 방지할 수 있는 새로운 치료법의 개발에 기여 할 수 있을 것으로 사료된다.

결     론

   두경부 편평세포암종 30예를 대상으로 maspin에 대한 면역조직화학적 염색을 시행한 결과 병기가 진행할수록 발현율이 감소하는 경향을 보여 앞으로 보다 많은 증례를 통한 신뢰도 보완 및 원발 병소별 부위를 보다 세분화 한다면 발현율과의 상관관계에 대해 귀중한 자료를 제공할 수 있을 것으로 기대되며 특히 고발현군에서 경부림프절 전이가 적게 나타나 림프절전이와 유의한 상관관계를 확인하였고 더불어 통계적으로 의미있게 무병생존기간이 연장된 소견보여 예후적 지표로서의 활용도 기대된다. 또한 maspin 발현 유전자의 조절을 통해 maspin의 역할을 연구하고 조절기전을 통해 두경부 편평세포암종의 보조적 치료법 개발에 일조를 할 수 있을 것으로 기대되어 진다. 앞으로 역전사 중합효소 연쇄반응과 같은 RNA 수준에서의 반정량적 연구와 두경부 편평 세포암종의 침윤 및 전이에 관여하는 것으로 알려진 다른 생물학적 표지자와의 상관관계에 대한 연구가 병행되어야 할 것이다.

1. Potempa J, Korzus E, Travis J. The serpin superfamily of protinase inhibitor: structure, function, and regulation. J Biol Chem 1994;269: 15957-60.

2. Zou Z, Anisowicz A, Hendrix MJ, Thor A, Neveu M, Sheng S, et al. Maspin: a serpin with tumor-supressing activity in humen mammary epithelial cells. Science 1994;263:525-9.

3. Zhang M, Sheng S, Mass N, Sager R. mMaspin: the mouse homolog of a human tumor suppressor gene inhibits mammary tumor invasion and motility. Mol Med 1997;3:49-59.

4. Sheng S, Truong AR, Fredrickson D, Wu R, Pardee AB, Sager R. Tissue-type plasminogen activator is a target of the suppressor gene maspin. Proc Natl Acad Sci USA 1998;95:499-504.

5. Li JJ, Colburn NH, Oberley LW. Maspin gene expression induced by overexpressing manganese-containing superoxide dismutase cDNA in human breast cancer cells. Carcinogenesis 1998;19:833-9.

6. Weiya Xia, Yiu-Keung Lau, Micky C-T Hu, Lei Li, Dennis A Johnston, Shi-Jie Sheng, et al. High tumoral maspin expression is associated with improved survival of patients with oral squamous cell carcinoma. Oncogene 2000;19:2398-403.

7. Ahomadegbe JC, Barrois M, Fogel S, Le Bihan ML, Douc-Rasy S, Duvillard P, Armand JP, Riou G. High incidence of p53 alterations in head and neck primary tumors and metastasis. Oncogene 1995;10: 1217-27.

8. Berenson JR, Yang J, Mickel RA. Frequent amplification of the bcl-1 locus in head and neck squamous cell carcinoma. Oncogene 1989;4: 1111-6.

9. Field JK, Spandidos DA, Stell PM, Vaughan ED, Moore JP. Elevated expression of the c-myc oncoprotein correlates with poor prognosis in head and neck squamous cell carcinoma 1989;4:1463-8.

10. Nigro JM, Baker SJ, Presinger AC, Jessup JM, Hostetter R, Clery K. Mutations in the p53 gene occur in diverse human tumor types. Nature 1989;342:705-8.

11. Zhang M, Volpert O, Shi YH, Bouck N. Maspin is an angiogenesis inhibitor. Nat Med 2000;6:196-9.

12. Sager R, Sheng S, Pemberton P, Hendrix MJ. Maspin: A tumor suppressing serpin. Adv Exp Med Biol 1997;425:77-88.

13. Zou Z, Gao C, Nagaich AK, Connell T, Saito S, Moul JW, et al. p53 regulates the expression of the tumor suppressor gene maspin. J Bio Chem 2000;275:6051-4.

14. Pemberton PA, Tipton AR, Pavloff N, Smith J, Erickson JR, Mouchabeck ZM, Kiefer MC. Maspin is an intracellular serpin that partitions into secretory vesicles and is present at the cell surface. J Histochem Cytochem 1997;45:1697-706.

15. Zhang M, Magit D, Botteri F, Shi HY, He K, Li M, et al. Maspin plays an important role in mammary gland development. Dev Biol 1999; 215:278-87.

16. Philip AP, Nadine Pavloff, Jason Smith, James RE, Zahi MM, Michal CK, et al. Maspin is an intracellualr serpin that partions into secretory vesicles and is present at the cell surface. J Histochem Cytoche 1997;45:1697-706.

17. Sheng S, Carey J, Seftor EA, Dias L, Hendrix MJ, Sager R. Maspin acts at the cell membrance to inhibit invasion and motility of mammary and prostatic cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA 1996;93: 11669-74.

18. Sheng S, Pemberton PA, Sager R. Production, purification, and charecterization of recombinant maspin proteins. J Bio Chem 1994;269: 30988-93.