교신저자：도남용, 501-759 광주광역시 동구 서석동 375  조선대학교 의과대학 이비인후과학교실
              전화：(062) 220-3205 · 전송：(062) 225-2702 · E-mail：nydo@mail.chosun.ac.kr

서     론

   악성종양은 유전자의 변화에 의해서 발생할 수 있고, 암이 진행하는 동안 종양세포들은 일련의 유전자 변화를 통해 침윤성과 전이능력을 얻게 되며, 원발 종양에서 탈락한 종양세포는 결체조직과 기저막을 뚫고 림프절이나 혈관에 들어가 인접장기를 침범하거나 원격전이를 일으킨다. 이런 일련의 과정에는 다양한 유전자의 변형이 수반되며 최근 종양의 형성 및 성장과 암종의 침윤에 관여하는 다양한 종양표지자에 대한 많은 연구가 진행되고 있다.
   암 억제 유전자로 알려진 p53유전자는 폐암, 유방암, 식도암, 대장암 등에서 가장 흔히 돌연변이 되는 종양억제 유전자이다. p53유전자는 사람의 제 17 번 염색체의 단완에 위치하며 세포증식을 조절하는 393개의 아미노산으로 구성된 53 kd의 핵인단백질을 암호화하여 세포주기중 G0기에서 G1기로의 이행에 관여한다고 알려져 있다.¹⁾²⁾
   Cyclin은 cyclin-dependent kinase(CDKs)와 복합체를 형성하여 유핵세포의 세포주기를 조절하는 중요한 단백으로 종양세포에서 cyclin A, E, D 유전자 변이가 보고되고 있으며, Cyclin D1 유전자는 11번 염색체의 단완(11q13)에 위치하여, 세포가 G1기에서 머무르는 시간을 짧게 하여 G1기에서 S기로의 이행을 촉진하는 역할을 한다.³⁾⁴⁾
   Cathepsin D는 aspartic proteinase계에 속하는 acidic lysosomal proteinase로서 성장인자 수용체와 상호작용하여 종양세포의 분열을 촉진시킨다.⁵⁾ 또한 산성인 상태에서 세포외 기질 및 proteoglycan을 용해시키고 종양세포 전이과정의 침윤단계에 관여하는 다른 단백분해효소의 잠복형 전구물질(latent precusor)을 활성화시킴으로서 종양세포의 파급(dissemination)을 촉진시키는 것으로 알려져 있다.⁵⁾⁶⁾
   비-부비동 종양 중 반전성 유두종은 드물게 발생하는 양성 상피성 종양이지만 임상적으로 국소 침윤, 높은 재발율, 악성종양과 동반 및 악성전환 등의 특징이 있어 전암성 병변으로 간주되고 있어 그 성장과 악성변화로의 기전에 관한 연구를 통해 암의 다단계 암화과정을 이해하기 위한 연구재료로 많이 이용되고 있다. 이에 저자들은 비-부비동 악성종양에서 종양의 발생과 성장 및 전이, 악성도 등과 관련 있을 것으로 여겨지는 p53, cyclin D1, cathepsin D단백에 대해서, 면역조직화학적 염색에서의 발현 빈도를 서로 비교하며 이들의 발현 양상이 비-부비동 악성종양의 발생 과정에 어떤 역할을 하는 지 알아보고, 여러 임상병리학적 예후인자와 상관관계가 있는지를 밝히고자 본 연구를 시행하였다.

재료 및 방법

재  료
   1992년부터 1999년까지 8년간 조선대학교 의과대학 이비인후과학 교실에서 조직검사로 진단된 비강 및 부비동 종양 중 조직의 재검토가 가능하고 파라핀 블록이 충분한 반전성 유두종 27예, 이행대(transitional zone)가 확인된 악성변화를 동반한 반전성 유두종 5예와, 편평세포암 16예를 대상으로 하였다.

방  법

임상적 소견의 검토
   환자의 임상기록과 병리기록으로부터 편평세포암군에서는 임상적 병기, 성별, 림프절 전이, 술후 재발을 그리고 반전성 유두종군에서는 나이, 술후 재발, 악성도 등 여러 임상적 특징을 후향적으로 분석하였다.

광학현미경적 검사
   대상 예의 조직표본 재료는 적출된 조직의 H-E 염색표본을 검토하여 종양조직이 50%이상 포함되고 파라핀 포매조직의 보관상태가 양호한 부위를 선택하여 면역조직화학적 검사를 위한 슬라이드를 제작하였다.

면역조직화학적 염색
   일반 광학현미경 검경 후 선택된 파라핀 블록을 찾아, 이를 각각 4 μm로 박절하여 슬라이드에 부착하고 xylene에 탈파라핀한 후 함수 과정을 거쳐 세척하였다. 조직의 항원성을 살리기 위해 함수과정 후 PelcoTM3440 laboratory micro-wave oven(Ted Pella, Inc, USA)을 98°C로 맞춘후 5분간 가열된 TUF(target unmasking fluid, Monosan Co., Italy)용액에 담구어 10분간 가열한 후 oven에서 꺼내어 20분간 실온에 방치하였다. 내인성 과산화효소의 활성을 억제하기 위하여 3% 과산화 수소 용액에 10분간 반응시켜 phosphate-buffered saline(PBS, pH 7.4)에 3회 세척하였다. 실온에서 20분간 식힌 다음 tris 용액에 세척하고 Labelled Streptavidin Biotin(LSAB, DAKO, Denmark) 방법을 이용하여 일련의 통상적인 방법으로 면역조직화학적 염색을 실시하였다. 1차와 2차항체에 대한 비특이적 결합을 방지하기 위해 blocking 항체에 10분간 처리한 후 PBS로 세척하고, 각각의 1차 항체로 반응시켜 PBS로 3회 충분히 씻었다. 사용된 1차항체는 p53(DAKO, Denmark, DO-7, 1：50), cyclin D1(DAKO, Denmark, DCS-6, 1：50) 및 cathepsin D(Zymed, USA, polyclonal, 1：50) 단백이었다. Biotin과 결합된 2차항체를 가하고 10분간 반응시켜 PBS로 씻은 후 streptavidin-peroxidase와 반응시켜 PBS로 세척한 뒤 peroxidase의 기질액인 hydrogen peroxide와 발색제인 AEC(3-amino-9-ethylcarbazol)에 반응시켜 발색 시작 5분 경과시점으로부터 수시로 현미경을 통한 정색반응을 확인하여 발색을 마친 후 Mayer's hematoxylin으로 대조염색을 하여 universal crystal mount(Biomeda Co., USA)로 봉입하였다.

면역 조직화학적 염색의 결과 판정
   염색 결과의 평가는 주관성을 어느 정도 배제하기 위해 해부병리 전문의의 도움으로 시행하였다. 각 항체에 대한 양성 판정기준으로는 p53과 cyclin D1은 핵에 분명하게 염색된 경우를 양성으로, cathepsin D는 세포질에 염색된 경우를 양성으로 판정하였다. 또한 각 항체 모두에 대해서 종양 세포가 10%미만으로 염색되는 경우는 음성, 10%이상이면 양성으로 판정하고, 10~40%를 1＋로, 41~70%를 2^＋로, 71%이상의 반응을 보인 경우를 3^＋로 판정하였다. 술후 재발 등 임상적 변수와 비교시 10%이상 발현된 경우는 모두 양성반응으로, 10%미만의 발현은 음성반응으로 하였다. 대조군으로 비교된 주변의 정상 점막에서의 발현율은 p53과 cyclin D1에서는 모두 5% 이하였으며, cathepsin D에서는 모든 예에서 음성소견을 보였다.

통계학적 검증
   p53, cyclin D1, cathepsin D의 양성발현률과 여러 가지 임상적 변수들과의 상관성은 Chi-square test를 통해 시행하였으며 유의수준은 p<0.05로 정하였다.

결     과

p53, cyclin D1 및 cathepsin D의 발현양상
   p53단백의 경우는 편평세포암에서 16예 중 12예(75%), 악성변화를 동반한 반전성 유두종군에서는 5예 중 3예(60%), 반전성 유두종군에서는 27예 중 8예(29.6%)에서 양성발현율을 보였다(Fig. 1). Cyclin D1의 경우는 편평세포암에서 16예 중 10예(62.5%), 악성변화를 동반한 반전성 유두종군에서는 5예 중 3예(60%), 반전성 유두종군에서는 27예 중 5예(18.5%)에서 양성발현을 보여 각 각의 경우 편평세포암군에서 가장 높은 양성 발현율을 보였으며 이는 통계적으로 유의하였다(p<0.05)(Fig. 2). 한편 cathepsin D의 경우는 편평세포암군, 반전성 유두종군 등 모든 예에서 양성반응을 관찰할 수 있었다(Fig. 3, Table 1).

p53단백 발현에 대한 cyclin D1단백 발현의 관계

편평세포암군
   Cyclin D1 단백의 양성 발현은 p53 단백에 양성을 보였던 12예 중 8예(66.7%)였고 음성을 보였던 4예 중 2예(50%)로서 p53단백에 양성을 보인 예에서 cyclin D1 단백의 발현이 약간 높았으나 통계학적인 유의성은 없었다. p53 단백에 양성반응을 보인 경우는 모두 3^＋ 이상의 강양성 반응을 보였으며, cyclin D1의 경우도 2^＋ 이상의 강양성 발현은 6예(60%)로서 두 단백이 비슷한 발현을 보였다.

반전성 유두종군
   Cyclin D1 단백의 양성발현은 p53에 양성을 보였던 8예 중 3예(37.5%)였고, 음성을 보였던 19예 중 2예(10.5%)로서 p53에 양성을 보인 예에서 cyclin D1단백 발현이 약간 높았으나 통계학적 유의성은 없었다. 전체적으로 p53이나 cyclin D1의 양성발현을 보인 경우 모두 1^＋ 정도의 약양성 반응을 보였다.

악성변화를 동반한 반전성 유두종군
   5예 중 3예(60%)에서 p53과 cyclin D1단백에 3^＋ 정도의 강양성반응을 보였으며 이 경우 심한 이형성을 동반하였다(Table 2).

임상적 특징과 발현율과의 비교분석
   편평세포암군에서의 임상적 병기, 나이, 림프절 전이, 술후 재발 그리고, 반전성 유두종에서의 나이, 술후 재발, 악성도 등 여러 임상적 특징과 비교 분석시, 통계적으로 유의성은 없었다(p>0.05, Table 3, 4).

고     찰

   종양의 악성도는 그 종양의 특성을 결정하므로 진단 및 치료나 예후 등이 동일종양에서도 다르게 나타나므로 최근에는 성장인자와 그 수용체들이나 변형된 암유전자, 암유전자 단백산물, 혹은 암억제유전자 단백산물을 종양세포에서 규명하여 종양의 악성도 및 예후와의 관계를 밝히려는 노력이 행하여지고 있다. 면역조직화학법을 이용한 암단백의 검색은 악성병변 그리고 전암병변 및 양성병변을 동일 조건하에서 암소주위의 정상적인 조직상의 변화를 검색할 수 있고 특히 동일한 환자의 전암 병변이 악성전환 하였을 경우 동일한 세포 주위에서 암유전자 산물의 관찰이 가능하다.
   p53 단백은 1979년에 발견된 핵인단백질의 일종으로, 야생형(wild type)은 암억제 유전자로 작용하고 변이형(mutant type)만이 암 발생과정에 관여하는 것으로 밝혀졌다.⁷⁾ p53유전자는 정상에서 세포주기의 조절인자로서 DNA보수 및 세포고사에 관여하며⁸⁾ 정상적인 세포증식을 조절하는 기능을 하는데,¹⁾ 첫째는 비정상적인 세포증식을 억제하며, 둘째는 정상세포가 성장신호에 반응하게 하는 기능이 있다.⁹⁾ 현재 여러 종류의 암에서 p53과 임상적 경과 혹은 예후와의 관련성에 관한 많은 연구가 이루어지고 있으며 악성변화 및 암종의 파괴적 양태를 예측할 수 있는 초기 식별인자로서 역할이 기대되고 있다.
   Dolcetti 등¹⁰⁾은 후두편평상피암에서 p53의 발현은 임상병기나 조직학적 분화도 및 생물학적 성상과는 관련이 없으며, p53의 발현이 침윤성 암종의 초기변화라고 하였고, Field 등¹¹⁾은 말기 두경부 편평상피암의 약 16%에서 p53에 양성으로 발현되었는데 p53에 발현을 보이지 않은 환자들보다 예후가 나빴으며, 암말기에 종양의 생물학적 성상에 p53유전자가 중요한 역할을 한다고 주장하였다. Byum 등¹²⁾은 악성변화를 동반한 7예의 반전성 유두종에서 p53은 모두 발현하였다고 하였고, Cho 등¹³⁾은 반전성 유두종 16예 중 4예(25%)에서만 양성 발현을 보였으며 임상적 예후와는 의의가 없다고 하였다. 본 연구에서는 반전성 유두종의 경우 29.6%, 악성변화를 보인 반전성 유두종 의 경우 60%, 편평세포암종의 경우 75%로 종양의 악성화(tumorigenensis)가 진행될수록 높은 양성율을 보였으며(p<0.05), 편평세포암과 같이 발견되거나 나중에 편평세포암으로 진행된 반전성 유두종(IP-SCC) 5예 중 3예에서 각각 3＋ 이상의 강양성 발현율을 보여 종양의 악성화를 예측할 수 있는 지표로서의 가능성을 시사하였다. 또한 고령이거나 임상적 병기가 진행될수록, 림프절 전이가 있는 경우, 재발한 경우 각각 발현율이 높았으나 각각의 증례 수가 적어 통계적인 유의성은 없었다(p>0.05).
   Cyclin D1은 cyclin dependent kinase 4 혹은 cyclin dependent kinase 6과 결합하여 cyclin-CDK 복합체를 형성하고, 이 효소의 활성도를 조절하여 세포주기를 조절한다. 즉, Rb(retinoblastoma)단백의 인산화를 시켜 Rb의 G1 세포주기 억제기능이 불활성화되어 S기로의 전환을 촉진하여 암의 발생을 유도한다고 한다.³⁾ 여러가지 cyclin 중에서 cyclin D는 가장 중요한 조절인자로서 R point cyclin이라고 부르며, 지금까지 알려진 것은 D1, D2, D3인데 이중 cyclin D1유전자 증폭은 암 발생 및 암의 악성도와 관계가 있는 암유전자로 인정되고 있다.⁴⁾¹⁴⁾
   두경부, 폐, 식도의 편평세포암 등 여러 암종의 10~50%에서 cyclin D1 유전자의 증폭이 있으며 임상 예후와 관계가 있다는 보고가 있다.¹⁴⁾¹⁵⁾ 두경부암에서 cyclin D1 유전자의 과발현에 대한 임상적 의의는 아직 명확히 규명되지는 않았으나 Michalides 등¹⁴⁾은 두경부암의 면역 조직화학적 연구에서 47예 중 30예(64%)에서 cyclin D1의 과발현이 낮은 생존율과 관계가 있다고 하였고, Kim과 Yeom¹⁶⁾은 32예의 두경부암종에서 cyclin D1에 40.6%가 발현하였고 양성 발현예에서 생존율이 나빴다고 하였다. Kim 등¹⁷⁾은 두경부 암종에서 32.4%의 발현율을 보고하였고, Leonard 등¹⁸⁾은 두경부암에서 증폭과 생존율은 관계가 없다고 하였고, So 등¹⁹⁾의 연구에서도 cyclin D1의 발현이 임상병기나 병리학적 인자와는 관련이 없다고 하였다. 본 연구 결과에서는 편평세포암에서 16예 중 62.5%, 악성변화를 동반한 반전성 유두종군에서는 5예 중 60%, 반전성 유두종군에서는 27예 중 18.5%의 양성 발현율을 보여 p53단백과 마찬가지로 종양의 악성화가 진행될수록 양성율이 증가함을 볼 수 있어, cyclin D1의 악성화 척도로서의 가능성을 시사하였다. 또한 고령이거나 임상적 병기가 진행될수록, 림프절 전이가 있는 경우, 재발한 경우 각각 발현율이 높았으나 각각의 증례 수가 적어 통계적인 유의성은 없었다(p>0.05).
   Cathepsin D는 세포배양을 통한 생체외 실험에서 잠복형태의 성장인자의 활성화를 통한 자가분비 유사분열물질(autocrine mitogen)로 작용하거나, 성장인자 수용체와 상호작용하여 종양세포의 분열을 촉진시킨다.⁵⁾ Cathespsin D는 에스트로겐 호르몬에 의해 조절되며 세포내에 전구형(pro-cathepsin D), 중간 활성형 및 최종 활성형으로 존재한다.⁶⁾ Cathepsin D의 면역조직화학적 발현의 분포를 보면 정상조직에서는 대식세포, 결체조직세포, 상피세포 등에 존재하며, 또한 기관지암, 위암, 결장암, 신장암, 유암, 난소암, 방광암, 췌장암 등에서도 발현된다고 보고되고 있다.²⁰⁾ Cathespsin D는 유암세포에서 특히 많이 존재하여 유암의 예후와 관련된 연구가 많은데 그 결과에 대해서는 이견이 많은 실정이다. 유암에 있어서 cathepsin D의 농도가 높을수록 생존율 및 예후가 나쁘다는 연구가 있는 반면,²¹⁾ 예후가 좋다는 연구도 있고,²²⁾ 예후와 무관하다는 보고도 있으며,²³⁾ 유암의 여러 예후인자들과는 무관하게 독립적인 예후인자라는 보고도 있다.²⁴⁾ 본 연구결과에서는 비-부비동 종양의 모든 경우에서 100% 발현이 되었으며 대체적으로 편평세포암군에서 강한 양성반응을 보였으나 종양의 여러 임상적 특징과의 상관관계에서는 통계적 유의성이 없는 것으로 나타났다. 따라서 cathepsin D의 경우 비-부비동 악성종양의 예후 판정지표로서의 가능성은 미흡할 것으로 판단되었다.
   이상의 결과를 종합해보면 p53, cyclin D1, cathepsin D 단백의 발현은 비-부비동 종양의 발생에 관여함을 알 수 있었으며, 특히 p53과 cyclin D1의 경우는 종양의 악성화가 진행될 수록 발현빈도가 증가하여 비-부비동 종양의 예후판정을 위한 지표로서의 가능성을 시사하였다. 그러나 cathepsin D의 경우 비-부비동 종양의 모든 예에서 발현을 보여 종양의 악성도를 알기에는 부적합할 것으로 판단되었다. 한편 p53, cyclin D1, cathepsin D의 발현과 종양의 여러 임상적 특징 및 예후와의 상관관계에서는 모두 다 통계학적 유의성이 없었다. 따라서 p53과 cyclin D1은 비-부비동 종양에서 종양의 악성도나 예후와의 관련성을 결정하는데 제한적으로나마 사용될 수 있을 것으로 생각되나, p53, cyclin D1의 발현이 비-부비동 종양의 악성도나 예후와의 관련성을 결정하는데 보조적인 방법으로 사용되기 위해서는 보다 많은 증례를 이용한 객관적인 검토가 필요할 것으로 생각된다.

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