교신저자：태  경, 471-701 경기도 구리시 교문동 249-1  한양대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   신생혈관생성은 기존의 모세혈관에서 새로운 모세혈관이 형성되는 것을 뜻하는데 정상적으로는 배성장(embryonic development) 및 상처 치유의 과정에서 일어나며, 병적인 경우는 당뇨병성 망막장애, 건선, 류마티스성 관절염 및 암세포의 증식 과정에서 볼 수 있다. 악성 종양, 특히 고형암에서 새로운 혈관의 생성은 암세포가 증식하고 성장하는데 필수적인 과정이며 암세포의 성장과 전이에 관여하는 것으로 알려져 있다.¹⁾²⁾³⁾ 따라서 암의 증식과 신생혈관생성과의 관계를 연구하는 것은 악성 종양의 진행과정을 이해하는데 절대적으로 필요하다. 악성 종양의 성장이 신생혈관의 생성에 의존한다는 것은 1971년 Folkman⁴⁾⁵⁾ 등에 의해 처음 보고된 이래 많은 연구들에 의해 주장되어져 왔으며, 이러한 신생혈관생성의 여러 조건들을 변화시켜 악성 종양의 성장을 제어하려는 시도들이 계속되어지고 있다. 인간의 악성 종양에서 신생혈관생성의 정도는 Srivastava⁶⁾⁷⁾에 의해 피부 악성 흑색종에서 처음 보고되었으며, 원격 전이를 예측할 수 있는 인자인 것으로 주장되었다. 최근의 연구들에 의하면 유방암, 비소세포성 폐암, 전립선암 등에서 원발 악성 종양의 미세혈관 밀도가 원발 병소의 원격 전이 및 생존율을 예측할 수 있는 지표로 보고되고 있다.^8)9)10) 
   본 연구는 두경부 편평세포암종 환자에서 면역조직화학적 방법으로 미세 혈관 밀도를 측정하고 의무 기록의 후향적 고찰을 통해 성별, 연령, 흡연력, 병기, 경부 림프절 전이, 재발, 생존율 등의 임상 양상과 비교 분석하여 두경부 편평세포암종에서의 신생혈관생성의 의의를 알아보고자 하였다.

대상 및 방법

대  상
   1995년부터 1999년까지 한양대학교의료원 이비인후과에서 두경부 편평세포암종으로 진단받고 치료받은 환자 중 파라핀 종괴의 보관이 양호하고 추적 관찰이 가능하였던 40예를 연구대상으로 하였다.

방  법

면역조직화학적 염색
   10% 중성 포르말린에 고정 후 파라핀에 봉입되어 있는 조직 종괴에서 4 μm 두께의 절편을 만들어 L-lysine으로 처리된 슬라이드에 고정하여 사용하였다. 미세 혈관 밀도는 혈관 내피 세포의 세포막에 특징적으로 존재하는 CD34에 대한 면역조직화학적 염색을 통해 측정하였다. 조직 슬라이드를 65°C 보온기에서 밤새 배양하였으며, xylene에 20분간 2회 담그어 탈 파라핀 과정을 거쳤다. 그 후 100%, 90%, 70%, 30%의 에틸 알코올에 각 10분, 5분, 5분, 5분씩 처리하여 함수화를 유도하였다. 내인성 과산화효소의 활성을 억제시키기 위하여 메틸 알코올과 과산화 수소를 1：4로 혼합한 용액에 15분간 반응시킨 후 phosphate-buffered saline(이하 PBS, pH 7.0)에 3회 세척하였다. 이후 슬라이드를 pH 6.0 시트르산(citric acid) 용액에 담그고 전자렌지에서 10분 정도 가열하여 항체 재생(antigen retrieval)을 시행하였다. 30분 정도 상온에서 방치하여 식힌 후 PBS에 3회 세척하였다. 차단 항체(blocking antibody)를 도포하여 37°C에서 30분을 반응시킨 후 PBS용액에 3회 세척하였다. CD34에 대한 항체(NeoMarker, CA, USA)를 슬라이드에 도포하고 37°C에서 2시간동안 반응시킨 후 PBS에 세척하였다. 이차 항체를 도포하여 37°C에서 30분을 반응시킨 후 재차 세척하였다. Avidin-biotin 복합체를 도포하여 37°C에서 30분을 반응시킨 후 Diaminobenzidine으로 발색시키고 헤마톡실린으로 대조염색을 시행한 후 봉입하였다.

미세혈관 밀도(microvascular density, MVD)의 측정
   동일한 조직 표본에 대하여 헤마톡실린-에오신 염색을 시행하여 종양이 있는 부분을 슬라이드에 표시한 후 CD34로 면역조직화학적으로 염색한 슬라이드를 겹쳐서 종양이 있는 부분을 표시하였다. 광학현미경 400배 시야에서 종양이 있는 부분을 찾아서 CD34의 염색에 의해 혈관 내피 세포의 세포막이 갈색으로 염색된 혈관의 개수를 측정하였다(Fig. 1). MVD가 가장 높은 부위를 찾아 400배 시야에서 한 시야 내의 모든 혈관의 개수를 측정하였고(Maximal MVD), 400배 시야에서 무작위로 5개의 시야를 골라 혈관의 개수를 측정한 후 그 평균값을 구하였다(Average MVD).

의무기록의 후향적 고찰
   대상자 40명의 의무기록을 후향적으로 고찰하여 성별, 나이, 원발 부위, 병기(TNM Stage, AJCC-1997 edition에 의함), 흡연력의 유무, 경부 림프절 전이, 재발, 3년 생존율 등을 조사하여 Maximal MVD, Average MVD와의 상관관계를 알아보았다.

통계 처리
   연령, 흡연력, 경부 림프절 전이의 유무, 원발 병소나 경부 림프절 재발 유무, 생존율의 경우에는 t-test를, 성별, 흡연량의 경우에는 Mann-Whitney U test를, 원발 병소의 위치, 전체적인 병기, T 병기, N 병기의 경우에는 Kruskal-Wallis test를, 미세혈관 밀도에 따른 생존율의 비교에는 Log Rank 방법을 이용하였다.

결     과

연령별 차이
   65세를 기준으로 65세 미만과 65세 이상의 경우로 나누어 비교하였다. 총 40예 중 65세 미만이 30명이었으며 65세 이상이 10명이었다. 연령은 Maximal MVD, Average MVD 모두와 통계적으로 연관관계가 없었다(p＝0.618, p＝0.563)(Table 1).

성별에 따른 차이
   대상자 40예 중 남자가 37명, 여자가 3명으로 남자가 많았으며 성별과 Maximal MVD, Average MVD는 통계적으로 유의한 연관관계는 없었다(p＝0.959, p＝0.98)(Table 1).

흡연력에 따른 차이
   흡연력이 있는 경우와 없는 경우가 각각 35예와 5예였으며 Maximal MVD, Average MVD와는 모두 통계적으로 유의한 연관관계는 없었다(p＝0.918, p＝0.967)(Table 1). 흡연력이 있는 경우 흡연력의 정도에 따라 40 pack X year(amount of smoking X duration of smoking)를 기준으로 40 pack X year가 되지 않는 경우를 저흡연군으로, 그 이상인 경우를 고흡연군으로 나누어 Maximal MVD, Average MVD를 비교하였다. 흡연량과 Maximal MVD, Average MVD는 통계적으로 유의한 연관관계는 없었다(p＝0.552, p＝0.469)(Table 1).

원발 병소의 위치에 따른 차이
   대상자 40예 중 후두에 발생한 경우가 26명으로 가장 많았고, 구강에 발생한 경우와 하인두에 발생한 경우가 각각 5명이었으며, 구인구에 발생한 경우가 4명이었다. 원발 병소와 Maximal MVD, Average MVD는 통계적으로 유의한 연관관계를 나타냈으나(p＝0.015, p＝0.016) 각각의 위치에 따른 상호 비교는 할 수 없었으며 구인두에 발생한 경우가 미세혈관 밀도가 가장 높은 경향을 보였다(Table 2).

병기에 따른 차이
   1997년 AJCC에 의한 TNM Stage에 의해 병기를 결정하였으며, 전체적인 병기(Stage I-IV)와 각각의 T, N 병기에 대하여 Maximal MVD와 Average MVD를 비교하였다. M stage의 경우 M1에 해당하는 대상자가 1명 뿐 이어서 통계적 의미를 찾기 힘들어 비교하지 않았다.

전체적인 병기에 따른 차이
   병기 I, II, III, IV에 해당하는 대상자는 각각 12, 10, 5, 13명이었다. 병기에 따라 Maximal MVD, Average MVD는 통계적으로 유의한 차이를 보였으며(p＝0.014, p＝0.012) 병기가 증가할수록 미세혈관 밀도가 증가하였다(Table 3-1).

T stage에 따른 차이
   T1, T2, T3, T4에 해당하는 대상자는 각각 14, 12, 3, 8예였다. T 병기와 Maximal MVD, Average MVD는 통계적으로 유의한 연관관계가 있었으며, T병기가 증가할수록 미세혈관 밀도가 증가하였다(p＝0.001, p＝0.001)(Table 3-2).

경부 림프절 전이(N stage)에 따른 차이
   N0, N1, N2, N3에 해당하는 대상자는 각각 27, 6, 5, 2예였다. 경부 림프절 전이가 없는 27예과 경부 림프절 전이를 동반한 13예에 있어서 경부 림프절 전이의 유무에 따라 Maximal MVD, Average MVD를 비교하였고 경부 림프절 전이가 있는 경우가 그렇지 않은 경우에 비해 미세혈관 밀도가 통계적으로 유의하게 높았다(p<0.001, p<0.001)(Table 3-3).
   각각의 N Stage에 대하여 비교하였을 경우도 통계적으로 유의한 차이를 보였으며 N 병기가 증가할수록 미세혈관 밀도가 증가하였다(p<0.001, p<0.001)(Table 3-4).

재발과 원격 전이에 따른 차이
   추적 관찰 중에 원발 병소나 경부 림프절에 재발이 확인된 10예와 폐와 늑골에 각각 원격 전이가 발생한 2예, 재발이 없는 28예에 대하여 Maximal MVD와 Average MVD를 비교하였으며 통계적으로 유의한 차이는 없었으나 국소나 원격 재발이 있었던 경우 Maximal MVD, Average MVD가 증가하는 경향을 보였다(p＝0.074, p＝0.052)(Table 4).

3년 생존율에 따른 차이
   추적 관찰 중 36개월 이상 생존한 26예과 36개월 이전에 사망한 14예 두 군에 대하여 Maximal MVD, Average MVD를 비교하였다. 진단 후 36개월 이전에 사망한 14예의 생존 기간은 5개월에서 24개월이었으며 평균 12.4개월이었다. 36개월 추적 관찰 결과 생존해 있는 사람이 36개월 이내에 사망한 사람에 비하여 Maximal MVD, Average MVD 모두 유의하게 낮은 값을 나타냈다(p＝0.019, p＝0.014)(Table 5).

Maximal MVD와 Average MVD에 따른 생존율의 차이

Maximal MVD
   Maximal MVD의 경우 36개월이 지나도 생존하고 있는 사람의 95%가 26 이상이었고, 반면 36개월 이내에 사망한 사람의 95%는 28 이하였다(Fig. 2). 따라서 26~28 사이의 값을 기준으로 생존율을 분석하였다. 그러나 Maximal MVD의 기준 값의 변화에 따라 사망의 변화가 거의 없고 통계적인 유의수준도 모두 유의하고 큰 차이가 없어 26을 기준으로 하였다. Maximal MVD 26을 기준으로 이보다 작은 Maximal MVD를 나타낸 환자 군이 그 이상의 Maximal MVD를 나타낸 환자 군에 비하여 통계적으로 유의하게 높은 생존율을 나타냈다(p＝0.003)(Fig. 3).

Average MVD
   Average MVD의 경우 36개월이 지나도 생존하고 있는 사람의 95%가 20 이상이었고, 반면 36개월 이내에 사망한 사람의 95%는 22 이하였다(Fig. 4). 따라서 20~22 사이의 값을 기준으로 생존율을 분석하였다. 그러나 Average MVD의 기준 값의 변화에 따라 사망의 변화가 거의 없고 통계적인 유의수준도 모두 유의하고 큰 차이가 없어 20을 기준으로 하였다. Average MVD 20을 기준으로 이보다 작은 Average MVD를 나타낸 환자 군이 그 이상의 Average MVD를 나타낸 환자 군에 비하여 통계적으로 유의하게 높은 생존율을 나타냈다(p＝0.008)(Fig. 5).

고     찰

   암의 신생혈관생성은 암종괴를 향하여 기존의 미세혈관들로부터 모세혈관이 뻗어나가는 여러 단계의 과정을 통해 이루어진다. 신생혈관생성이 없으면 대부분의 고형암은 1 내지 2 mm 이상으로 자라지 못하고, 원발 위치에 국소화된 채로 남아있을 것이다. 악성 종양에서의 새로운 혈관의 생성은 특히 고형암에서 암세포가 확장하고 성장하는데 필수적인 과정이며, 암세포의 성장과 전이에 관여하는 것으로 여겨진다. 침윤성 유방암에서 신생혈관생성의 정도(microvascular density, MVD)는 원격 전이와 상관관계가 있으며,⁸⁾ 초기 유방암 환자의 생존율을 예측할 수 있는 가장 중요하고도 독립적인 변수로 보고되었다.⁹⁾ 폐의 비소세포성 암종의 경우 미세 혈관 밀도가 원격 전이를 예측할 수 있는 유일한 독립 인자로 보고되어졌다.¹⁰⁾ 두경부 편평세포암종의 경우 정확하고도 특징적인 예후 인자가 아직 밝혀지지 않았으며,^1)2)3)12)13) 생존율에 가장 중요한 영향을 미치는 인자는 경부 림프절 전이인 것으로 알려져 있다.^1)2)3)14) 경부 림프절 전이를 동반하지 않은 초기 두경부 편평세포암종의 경우에도 상당히 다양하고 예측할 수 없는 경과를 나타내는 경우가 적지 않아 두경부 편평세포암종의 생물학적 특성, 특히 예후 인자로서의 미세 혈관 밀도에 대한 연구가 주목받고 있다.¹⁶⁾ 그러나 두경부 편평세포암종의 경우 종양 내의 신생혈관의 생성 정도와 원격 전이, 원발 병소의 재발, 생존율 사이에 연관이 없다는 연구도 있어¹³⁾ 예후 인자로서의 가능성에 대해 더 많은 연구가 필요하다 하겠다.
   본 연구에 의하면 대상자의 연령, 성별, 흡연력, 흡연량은 Maximal MVD, Average MVD와 모두 통계적으로 유의한 연관관계는 보이지 않았다. 원발 병소의 위치에 따라 미세혈관 밀도는 통계적으로 유의한 차이를 보였으나 각각의 위치에 따른 상호 비교는 할 수 없었으며 구인두에 발생한 경우가 미세혈관 밀도가 가장 높은 경향을 보였다. Stage I, II, III, IV에 따라 Maximal MVD와 Average MVD 모두 통계적으로 유의한 차이를 보였다. T Stage의 경우에 Maximal MVD와 Average MVD 모두 통계적으로 유의한 차이를 보였으며, 이것은 원발 병소의 크기가 커질수록 신생혈관생성이 더욱 활발히 이루어진 결과일 수도 있고, 처음부터 암종의 생물학적 특성상 활발한 신생혈관생성을 보이는 암종이 빠른 성장을 나타내어 결과적으로 진행된 병기에서 발견되어지기 때문일 수도 있을 것이다. 경부 림프절 전이(N Stage)에 따라 Maximal MVD와 Average MVD 모두 통계적으로 유의한 차이를 보였으며, 각각의 N Stage에 대하여도 Maximal MVD와 Average MVD 모두 통계적으로 유의한 차이를 보였다. 암종이 림프절로 전이되기 위해서는 림프계로의 침범이 필요한데, 인간에서 이러한 침범이 새로운 림프관의 생성(tumor lymphangi-ogenesis)에 의한 것인지 기존의 림프관의 침범에 의한 것인지는 아직 알려진 바 없으며, 이것은 림프관과 혈관의 구분이 어렵고, 림프관생성(lymphangiogenesis)의 분자생물학적 기전이 아직 명확하게 밝혀지지 않았기 때문이다.¹⁷⁾ 그러나 본 연구의 결과에 의하면 두경부 편평세포암종에서 신생혈관생성이 기존의 연구들에서 가장 중요한 예후 인자로 알려진 경부 림프절 전이¹⁴⁾와 연관성이 있으며, 따라서 림프절 전이를 예측할 수 있는 인자로서의 의미를 가질 수 있다고 하겠다. 추적 관찰 중에 원발 병소나 경부 림프절에 재발된 경우나 원격 전이가 발생한 경우와 그렇지 않은 경우에 대하여 Maximal MVD와 Average MVD는 통계학적으로 유의한 차이를 보이지는 않았지만 p-value가 각각 p＝0.074, p＝0.052로 경계선 수준의 유의성을 보였다.
   본 연구의 대상이 40예로 대상의 수가 비교적 적어 통계적으로 유의한 결과를 나타내지는 않았으나 좀더 큰 규모의 연구가 이루어진다면 통계적으로 유의한 결과를 보일 가능성도 있을 것으로 생각된다. 이러한 상관관계는 생물학적 특성상 활발한 신생혈관생성을 보이는 암종이 원발 병소나 경부 림프절의 재발이 많을 수 있음을 나타내며 신생혈관생성이 두경부 편평세포암종의 중요한 예후 인자로 이용되어질 수 있는 또 하나의 가능성을 제공한다고 하겠다. 또한 원격 전이에 있어서는 암세포의 혈행성 전파가 원격 전이에 필수적이라는 기존의 연구 결과¹⁵⁾와도 부합한다고 하겠다. 생존율에 있어 3년 이상 생존한 경우가 그렇지 않은 경우에 비해 통계적으로 유의하게 낮은 Maximal MVD와 Average MVD를 나타내었는데 이는 신생혈관 생성이 생존율을 예측할 수 있는 중요한 예후 인자임을 의미한다고 할 수 있다. 생존율에 있어 대부분의 대상자가 진단 후 아직 5년 이상의 기간이 경과되지 않아 3년 생존율을 비교하였으며 추후 5년 이상의 생존율에 대한 연구가 필요할 것으로 생각된다. Maximal MVD 26, Average MVD 20을 기준으로 이보다 작은 MVD를 나타낸 환자 군과 이 이상의 MVD를 나타낸 환자 군 사이에는 통계적으로 유의한 생존율의 차이를 나타내었다. 이것은 Maximal MVD와 Average MVD가 모두 환자의 생존율을 예측할 수 있는 좋은 예후 인자임을 의미한다고 하겠다.

결     론

   두경부 편평세포암종으로 진단받은 환자의 원발 병소의 조직 표본을 면역조직화학적으로 염색하여 미세혈관 밀도를 측정한 후 환자의 임상 소견과 비교 분석한 결과 두경부 편평세포암종에서의 미세혈관 밀도(Maximal MVD, Average MVD)는 두경부 편평세포암종에서 생존율을 예측할 수 있는 중요한 예후 인자라 사료된다.

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