교신저자：이상학, 136-705 서울 성북구 안암동 5가 126-1  고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
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서     론

   비용은 만성 비부비동염 환자의 비점막에서 발생하며 비폐색, 비루, 후각장애, 두통 등의 증상을 유발한다. 비용의 발생원인은 현재까지 불확실하며 주로 호산구등과 같은 염증세포의 침윤이 보이며, 조직부종과 함께 상피세포, 분비선, 결체조직 그리고 혈관들이 산재하고있다.¹⁾²⁾³⁾ 동물조직을 이용한 실험모델과 비용조직을 이용한 연구 결과들은 비용의 형성과 성장에 세포외 기질(extracellular matrix)의 축적이 필요한 것으로 알려져 있다. 또한 비용에서 혈관의 증식에 관한 연구는 거의 없지만 비용의 조직학적 소견을 보면 비용에서 혈관의 증식이 일어난다는 것이 관찰된다.
   비용조직은 인슐린 유사 성장인자(insulin-like growth factor), 섬유모세포 성장인자(fibroblast growth factor), 혈소판 유리 성장인자(platelet derived growth factor) 등의 발현이 비용조직에서 증가하며,⁶⁾⁷⁾⁸⁾ 최근에 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor)가 비용조직에서 발현되어 혈관의 성장 및 혈장성분의 투과를 촉진함으로써 비용조직의 형성에 중요한 역할을 할 수 있다고 보고하고있다.⁹⁾¹⁰⁾ 이러한 각각의 성장인자가 혈관의 증식뿐만 아니라 혈장성분의 혈관외유출과 세포외 간질 및 콜라겐의 형성등을 유도함으로써 비용의 형성에 중요한 역할을 할 수 있다고 생각된다.
   Midkine은 분화하는 생쥐의 태생암종세포(embryonic carcinoma cell)에서 발견된 성장인자로서, 여러가지 암종의 조직세포에서 혈관의 성장에 관여하며,¹⁴⁾¹⁵⁾ 섬유모세포를 자극함으로써 세포외 간질과 콜라겐의 합성을 유도한다.¹⁶⁾ 이러한 관점에서 보면 midkine은 새로운 세포조직의 성장에 관여하는 하나의 성장인자로서 만성 비부비동염으로 유발되는 비용조직의 형성에도 관여될 수 있다고 생각된다.
   본 연구의 목적은 이전까지 비용과 midkine과의 연관성에 대한 연구가 없었기에 비용을 동반한 만성부비동염 환자에서 채취한 비용조직에서 midkine의 발현여부를 조사하고 정상 하비갑개점막에서 발현양상을 비교하여 비용형성과 midkine의 연관성에 대하여 연구하고자 하였다.

재료 및 방법

조직채취
   비중격만곡증으로 교정술을 받은 10명의 환자(남자 5명, 여자 5명, 연령 24~45세)에서 수술시 하비갑개 점막을 채취하였다. 그리고 비용을 동반한 만성 비부비동염으로 비내시경 수술을 받는 10명의 환자(남자 8명, 여자 2명, 연령 20~50세)에서 비용을 채취하였다. 이들은 모두 3년 이상의 병력을 가진 환자들로 알레르기, 천식, 아스피린과민증, 낭성섬유증(cystic fibrosis) 등의 병력은 없었다.
   모든 하비갑개와 비용조직은 두 부분으로 나누어 한쪽은 RNA 추출을 위해 조직채취 후 즉시 액화 질소에 냉동하여 -70°C에 보관하였고, 다른 한쪽은 in situ hybridization을 위해, 0.1 M 인산완충생리용액(PBS, pH 7.2)에 용해시킨 4% 파라포름알데히드에 24시간동안 4°C에서 고정 한 다음, 인산완충생리식염수에 용해한 20% 자당으로 수세하고 액체 질소로 급속냉동시켜 동결절편기(Leica CM 1900, USA)를 이용하여 12 μm 두께의 조직절편을 만들었다.

RNA 분리, 역전사중합효소연쇄반응과 소식자 제작
   냉동된 조직 50~100 mg을 1 ml의 TRIzol^®(GIBCOB-RL, Grand Island, NY, USA) 시약에 균질화시킨 후, guanidium thiocyante-phenol-chloroform 추출방법¹⁸⁾으로 총 RNA를 추출하였다. 하비갑개와 비용에서 추출된 총 RNA 4 μg을 각각 2.5 U의 M-MLV 역전사효소(GIBCOBRL, Grand Island, NY, USA)와 50 pm의 random hexanucleotide를 포함한 반응혼합물 20 μl에 넣고 42°C에서 60분간 역전사시켰다. 중합효소연쇄반응은 gene cycler(Biorad, USA)를 사용하였고, 1 μl의 cDNA를 Taq DNA polymerase 0.125 U와 각각의 시발체 12.5 pmol을 함유한 25 μl의 중합효소연쇄반응 혼합물에서 증폭시켰다. RNA 통합성과 역전사반응의 적합성 여부를 확인하기위해 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) 전사물의 발현을 관찰하였고 음성대조군으로는 각 표본에서 cDNA 합성시 역전사효소를 생략한 다음 반응을 관찰하였다.
   이 실험에서 사용된 midkine시발체와 GAPDH 시발체의 염기배열 순서는 다음과 같다：midkine；sense；5-CAGCACCGAGGCTTCCTCC TC-3, antisense：5-GTCCTTTCCCTTCCCTTTCTT-3, GAPDH；5-AT CTTCCAGGAGCGAGATCC-3, 5-ACCACTGACACGTTGG CAGT-3. midkine은 94°C 1분, 50°C 2분, 72°C 1분씩 30 사이클 증폭되었고, GAPDH는 94°C 45초, 57°C 45초, 72°C 45초 씩 30 사이클 증폭되었다. 증폭된 중합효소연쇄반응 산물을 2% agarose gel에 전기영동한 다음 각 중합효소연쇄반응 산물의 특이성은 예견된 크기와 DNA염기서열에 따라 확인하였다.
   Southern blot을 위한 소식자 제작은 cDNA 조각을, 선형화한 숙주인 pCR^® II TOPO Cloning vector(Invitrogen Corp., Carlsbad, USA)에 접종한 후, EcoRI로 절단하여 random priming technique을 이용하여 digoxigenin-dUTP를 포함한 deoxyribonucleoside 혼합물(Boehringer Mannheim, Germany)로 표식하였다. In situ hybridization을 위한 소식자를 만들기 위하여 cDNA 분절을 pCR^® II TOPO Cloning vector(Invitrogen Corp., Carlsbad, USA)에 subclonig하였다. RNA probe를 제작하기 위하여, 정제된 plasmid를 HindIII와 T7 polymerase promoter를 이용하여 in vitro transcription하여 antisense probe를 제작하였고, 같은 plasmid를 Not I과 SP6 polymerase promoter로부터 전사하여 sense probe를 제작하였다. Transcription reaction은 DIG RNA labeling kit(Boehringer Mannheim, Germany)을 이용하여 시행하였다.

Southern blotting
   중합효소연쇄반응에서 양성으로 나온 표본은 반정량적 dot blot hybridization 분석으로 조사하였다. 위에서 기술 한 것처럼 총 RNA 추출과 역전사 실시 후 각 표본에서 얻어진 cDNA들을 각각의 시발체로 중합효소연쇄반응을 진행하면서 20, 25, 30, 35, 40 사이클에서 채취하였다. 적절한 증폭 횟수를 보기위해 time kinetic study를 실시하였다. 이러한 분석을 근거로 GAPDH와 midkine은 각각 30회가 적절하다고 결정되었다. 각 중합효소연쇄반응의 산물은 2% agarose gel에서 분리한 후 Hybond-N 나일론 막(Amersham, UK)에 부착시켰다. 각 blot들은 25 ml의 hybridization 용액(6 SSC, 1% SDS, 5 Denhardt's solution, denatured salmon sperm DNA 10 μg)으로 68°C에서 16시간동안 sealable bag에서 전처리 후 소식자를 넣어 68°C에서 24시간 동안 hybridization 하였다. hybridization된 blot들을 항 digoxigenin-AP로 면역염색 후 NTB/X phosphate(Boehringer Manheim, Germany)로 발색반응을 일으켜 발현시켰다.
   각각의 dot blot 결과는 wet filter를 image scanner로 scanning 한 다음, blot의 강도는 NIH image 1.57 soft ware(Division of Computor Research and Technology, National Institute of Health, Bethesda, USA)를 이용하여 정량하였다. GAPDH는 각 PCR에서 사용된 cDNA의 실질적 양에 대한 지시자로 사용하여 목표로하는 cDNA의 양을 GAPDH 발현정도와 비교하여 정량하였다. 모든 자료는 각기 다른 세번의 실험평균의 표준편차로 도출하였고 통계학적 의미는 student t-test로 결정하였다. p 값이 0.05 이하일 때 의미있는 것으로 하였다.

In situ hybridization
   Poly-L-lycine으로 피복된 유리슬라이드에 12 μm 두께의 조직절편을 부착시키고 proteinase K(1 μg/ml)로 37°C에서 30분, 0.25% acetic anhydride로 실온에서 10분간 처리하고, prehybridization buffer에 30분간 처리하였다. 정제된 probe를 1× Denhart용액, 50% deionized formamide, 0.3 M NaCl, 20 mM Tris, pH8.0, 5 mM EDTA, 0.5 mg/ml yeast tRNA, 80 μg/ml denatured salmon sperm DNA, 10 mM sodium phosphate, 10% dextran sulphate, 0.1 M dithiothreitol이 포함된 혼합용액에 1：100의 농도로 희석시키고 각각의 조직슬라이드에 probe가 포함된 hybridization용액을 100 μl씩 점적하였다. 그리고 이 슬라이드를 가습장치안에 넣은 후 42°C에서 18시간동안 hybridization하였다. Hybridization 후 조직절편을 ribonuclease용액과 농도가 감소하는 standard saline citrate(SCC)에서 철저히 세척함으로써 비특이적 반응을 감소시켰다. 일부의 조직 절편을 hybridization하기 전에 ml당 RNase A 20 μg으로 37°C에서 20분동안 처리함으로써 음성대조군으로 간주하였다. 반응이 끝난 조직 슬라이드는 공기건조시킨 후 DIG nucleic acid detection kit를 이용하여 발색여부를 확인하였다.

결     과

   정상 하비갑개와 비용조직에서 midkine유전자의 발현양상을 관찰하기 위하여 본 연구에서는 민감도가 높은 방법인 역전사중합효소연쇄반응을 실시하였다. 이때 각각의 조직에서 분리한 총 RNA에서 GAPDH 발현을 확인함으로써 RNA 통합성과 RT-PCR의 적합성 여부를 확인하였고, 하비갑개 점막과 비용 각각 10예 모두에서 midkine mRNA가 발현되었다(Fig. 1). Southern blot hybridization 방법을 이용한 반정량적 분석에서, midkine mRNA의 경우 비용과 정상 하비갑개 점막사이에 서로 의미있는 차이는 없었다(Figs. 2 and 3).
   In situ hybridization 검사상 모든 조직절편에서 midkine mRNA는 하비갑개 점막의 상피층과 점막하 분비선에 강하게 발현되었고, 점막하조직에 산재한 염증세포 및 혈관의 내피세포에도 양성반응이 관찰되었다. 이러한 소견은 역시 비용조직에서도 같은 양상으로 관찰되었다(Fig. 4). Sense riboprobes(Fig. 4B and 4D)로 hybridization 시키거나 antisense probe로 hybridization 하기전에 RNase로 처리한 경우에는 signal이 관찰되지 않았다(not shown).

고     찰

   본 연구결과는 정상 인체 비점막과 비용조직에서 midkine mRNA의 발현 여부 및 분포양상을 확인할 수 있었다. RT-PCR 결과 midkine mRNA는 정상 인체 비점막에서 발현되었으며, in situ hybridization 결과 midkine mRNA는 하비갑개 점막의 상피층과 점막하 분비선에서 주로 관찰되었고, 점막하 조직에서 산재된 염증세포와 혈관의 내피세포에서도 발현되었다. 이러한 결과는 midkine이 인체 비점막에서 어떠한 자극에 의하여 발현되는 것이 아니고 정상적으로 내재해 있다는 것을 의미한다. 반정량적으로 분석한 southern blot의 결과 midkine mRNA는 정상 하비갑개 점막과 비용조직에서 의미있는 발현량의 차이는 관찰되지 않았고, 비용조직에서 그 발현양상은 정상적인 하비갑개 점막에서 발현된 분포양상과 유사하였다. 비용조직은 다양한 염증반응의 산물이라는 것을 고려하여 볼 때 본 연구 결과는 midkine은 인체 비점막에서 생리적인 역할뿐만 아니라 비점막에서 염증반응에 관여하리라고 생각한다.
   Midkine은 태생기의 세포분화에 관련되지만 성숙기에 접어들면 그 발현량이 감소함으로써 완전히 성장이 끝난 경우에는 정상 조직에서는 거의 발현되지 않는다.¹⁹⁾ 그러나 이 성장인자는 종양, 즉 간암종, 위장암종, 신경세포아종, 윌름종양 그리고 유방암종 등에서 강하게 발현된다고 알려져있다.²⁰⁾ 이것과는 대조적으로 정상적인 조직에서는 그 발현량이 매우 적다고 한다. 발현되는 인체의 정상 조직 중 소장에서는 강하게 발현되며, 그다음 갑상선에서는 약하게 발현되며 폐, 대장, 위장, 신장, 피부 및 비장에서도 발현된다고 한다.²⁰⁾ 그러나 본 연구에서는 midkine은 정상 하비갑개 점막에서도 강하게 발현되었다. 특히 상피세포, 점막하 분비선의 상피세포, 혈관내피세포 및 염증세포의 일부에서 강하게 발현되었다. Midkine의 지금까지 알려진 기능 즉 세포분화와 세포성장 촉진 작용들을 고려하여 볼 때 인체의 비점막에서 midkine은 상피세포, 분비선상피세포 및 혈관내피세포의 분화, 유지 및 성장에 관여할 수 있다고 추측된다. 다른 한편으로는 비점막은 항상 외부의 해로운 흡기에 노출되어 비록 비증상이 없는 경우라 하더라도 비점막에는 염증반응이 발생하고 있다. 따라서 염증반응에 대한 대처방안의 하나로 세포의 분화와 유지에 필요한 이차반응으로 midkine의 발현이 발생할 수 있다고도 생각된다. 이러한 추측은 midkine이 염증반응뿐만 아니라 염증 후 회복되는 과정에 관여한다는 연구결과가 뒷받침한다.⁴⁾⁵⁾
   Midkine의 중요한 기능의 하나인 혈관성장인자로서 특히 종양의 성장에 관여하고 있다.¹⁵⁾ 한편 비용조직에도 최근에 혈관의 성장을 촉진시키며, 혈관의 투과성을 증가시키는 vascular endothelial growth factor(vascular permeability factor)가 비용조직에도 발현된다고 알려졌다.⁹⁾¹⁰⁾ 따라서 본 연구는 위와 같이 midkine이 혈관성장인자로서 작용한다는 점에 착안하여 midkine이 비용형성에 관여할 수 있다는 가능성을 분석하기 위하여 시도하였다. 그러나 midkine이 비용조직에도 강하게 발현되었으나 발현 양상은 정상 하비갑개 점막과 차이가 없었고, 반정량적인 southern blot의 결과에서도 정상 하비갑개 점막과 발현량의 차이가 관찰되지 않았다. 따라서 현재의 결과로서는 midkine이 비용형성에 관여 할 수 있다는 결론은 얻을 수 없었다.

결     론

   비용조직에는 비록 호산구 침윤이 특징적인 소견이지만,¹⁾ 여러가지 다양한 염증세포가 분포되어 있고 사이토카인 및 여러가지 성장인자가 발현되고 있다.⁶⁾⁷⁾⁸⁾
   본 연구결과는 이러한 염증매개물에 추가적으로 midkine이 역시 발현된다는 것을 처음으로 보고한다. 더나가서 앞으로 midkine이 정상적인 인체 비점막에서 수행하는 생리학적 역할 및 비용조직에서 발현의 의의에 대해서는 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.

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