교신저자：김선태, 405-220 인천광역시 남동구 구월동 1198 가천의대 길병원 이비인후과-두경부학교실
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서     론

   피부와 점막의 상피세포층은 외부환경에 대한 물리적인 방어 뿐만 아니라 여러 종류의 미생물 및 박테리아균들의 침입에 대해 이를 파괴하여 항균작용을 하는 항균펩타이드 등을 분비하여 첫번째 방어기전의 역할을 한다고 알려져 있다.¹⁾²⁾ 이러한 항균펩타이드는 후천적인 면역체계가 아닌 선천적인 면역체계를 이루며 주로 포유동물에서 여러 종류가 발견되었는데 지금까지 사람에서 발견된 항균펩타이드들은 salivary histatins과 lactoferricin, 6개의 α-defensins과 2개의 β-defensins, 그리고 human cationic antimicrobial protein(hCAP)이라고 불리는 LL-37이 있다.¹⁾³⁾
   LL-37은 사람에게서 밝혀진 유일한 cathelicidin계의 단백질로서 인간의 골수에서 처음으로 분리되었고 주로 중성구에서 발현되는 것으로³⁾⁴⁾⁵⁾ 지금까지 고환, 구강점막, 혀, 식도, 자궁경부, 질 등의 편평상피 및 폐 기도의 상피층에서 보고되었다.⁶⁾⁷⁾ 상피층에서 항균펩타이드의 역할은 아직 완전히 알려져 있지 않지만 합성된 LL-37은 그람양성균과 그람음성균에 대해 항균작용을 보인다고 알려져 있다.⁷⁾
   최근 연구에 의하면 항균펩타이드의 일종인 α와 β-defensins이 비점막에 존재하며 이것들의 발현은 국소적인 감염이나 염증에 의해 자극되어진다고 보고되었다.³⁾⁸⁾ 그러나 아직까지 비점막에서 LL-37의 발현에 대한 보고는 없다. 본 연구에서 저자들은 사람의 비점막에서 LL-37의 존재를 확인하고 이의 발현이 염증성 비점막에서 변화되는지 관찰하고자 하였다. 이와 같은 비점막의 염증성 상태는 염증전구성 싸이토카인인 IL-1β, IL-8의 양을 측정하여 확인하였다.

대상 및 방법

대  상
   만성 부비동염 및 비용 8례와 만성비염 7례를 대상으로 하였다. 남자는 9명, 여자는 6명으로 24세에서 64세로 평균연령은 37세이었다. 모든 환자에서 1개월 전부터 약물사용을 금하였고 알레르기는 임상적 증상, 피부반응검사와 집먼지 진드기에 대한 RAST를 통하여 확인하여 이중 한가지라도 양성인 경우는 제외하였다. 정상대조군은 외비성형술을 시행한 환자 6명에서 채취한 편측의 정상 하비갑개 점막조직을 사용하였다. 실험 재료는 하비갑개 전단에서부터 1 cm 뒤에서 겸자로 비점막을 채취하였다.

방  법

면역조직화학적 검사
   모든 염색은 LSAB Kit(Dako, Glostrup, Denmark)를 이용한 ABC방법을 이용하였다. 파라핀 포매조직을 자일렌을 사용하여 탈파라핀화한 후 100%, 75% 알코올로 함수화하였고 내재성 페록시다아제를 억제하기 위하여 3% 과산화수소를 5분간 반응시켰다. 조직내에 비특이적 결합을 억제하기 위하여 단백질억제제를 실온에서 15분간 적용하였다. 일차항체는 rabbit polyclonal anti-human LL-37 항체(gifted by Dr. Ole Sorensen, Granulocyte Research Laboratory, National University Hospital, Copenhagen, Denmark)를 1：500으로 희석하여 4°C에서 하룻밤 반응시켰다. 이차항체는 바이오틴이 부착된 antirabbit immunoglobulin(Dako, Carpitenia, CA)를 상온에서 30분간 반응시킨 후 스트렙아비딘-퍼옥시다제를 15분간 반응시켰다. 발색제로는 3-amino-9 ethyl carbarzole(Zymed, South San Francisco, CA)를 사용하였으며 대조염색으로 Meyer's hematoxylin을 사용하였다. 음성대조군은 일차항체 대신 인산완충용액을 사용하여 같은 방법으로 시행한 후 관찰하였다.

역전사 중합효소 연쇄 반응

총 RNA의 추출 및 cDNA의 합성
   비점막 조직에서 TRIzol^®(GIBCOBRL, Grand Island, NY)을 이용하여 총 RNA를 추출하였다. 이중 RNA 2 μg에 Moloney murine leukemia virus(Life Technologies, Gaithersberg, MD)역전사 효소, 5x Reverse transcription buffer, 10 mM dNTPs, RNase inhibitor, random hexamer 등을 첨가하여 37°C에서 1시간 반응시킨 후 94°C에서 5분간 불활성화시켜 cDNA를 합성하는 역전사 반응을 시행하였다.

중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)
   5 μl의 cDNA에 10x PCR reaction buffer, 25 mM MgCl2, 2.5 mM dNTPs, LL-37의 sense와 antisense primer 20 ρmol ,또는 IL-1, IL-8 및 GAPDH의 sense와 antisense primer, Taq polymerase, 증류수 등을 넣어 중합효소 연쇄반응에 사용하였다(Table 1). 중합효소 연쇄반응은 Gene Amp PCR system 2400(Perkin Elmer)에서 94°C에서 5분간 변성시킨 후 94°C에서 45초, 55°C에서 30초, 72°C에서 1분 주기로 약 35회 증폭한 후 최종 72°C에서 약 7분간 반응을 연장시켰다. 음성 대조군으로는 cDNA 대신 증류수와 반응액을 혼합한 것을 사용하였다. 최종 중합효소 연쇄반응 산물을 2% agarose gel에서 전기영동을 한 후 ethidium bromide 용액으로 30분간 염색하여 확인하였다. 총 RNA의 파괴여부 및 상대적 정량비를 구하기 위하여 대조군으로 GAPDH을 사용하였다.

연구자료분석
   통계학적 분석은 SPSS 7.5 for Windows(version 7.5, SPSS Inc., Chicago, USA)을 이용하여 paired t-test를 시행하였고 p 값이 0.05이하인 경우 통계학적으로 유의하다고 하였다.

결     과

면역조직화학적 검사
   비점막에서 LL-37 양성세포의 분포는 주로 상피세포층에 분포하였고 점막하 고유층에서는 일부 염증세포 및 점막하 분비선의 내피세포 등에 분포함을 보여주었다(Fig. 1). LL-37 양성세포는 정상조직 6명중 2명(33%)에서 비용에서는 8명중 5명(63%)에서 만성 비염에서는 7명중 6명(85%)에서 발현되었다. LL-37에 대해 양성반응을 보였던 조직중 정상대조군과 염증조직간에 분포양상의 별다른 차이는 없었고, 상피세포층 및 점막하 분비선과 기질내 염증세포 등에서 양성세포의 수가 정상조직보다 비용 및 비후성비염 조직에서 증가하였으나 통계학상 유의한 차이는 없었다(p<0.05)(Fig. 2).

역전사 중합효소반응
   LL-37 mRNA의 전기영동 결과 약 560 bp 크기의 띠가 관찰되었다. 정상 대조군에서는 6례중 3례에서, 염증성 조직에서는 15례 모두에서 LL-37 mRNA가 관찰되었다. IL-1β는 모든 염증 조직에서 388 bp 크기의 띠가 관찰되었고 정상에서는 2례만 관찰되었다. IL-8은 289 bp의 크기로 IL-1와 비슷한 발현을 보여 정상에서는 나오지 않았으나 염증조직에서는 15례 중 13례에서 관찰할 수 있었다. 따라서 IL-1β와 IL-8은 정상보다 비용 및 만성비염의 비점막에서 많이 발현되었고 LL-37 mRNA의 발현과 일관되는 양상을 보여주었다. 또한 모든 조직에서 GAPDH(267 bp)의 발현을 보여주었다(Fig. 3).

고     찰

   본 연구에서 저자들은 항균펩타이드의 일종인 LL-37이 비점막 상피세포, 점막하 분비선 내피세포 및 염증세포 등에 존재하며 정상에서도 일부 존재하지만 비점막의 염증반응시에 LL-37의 발현이 증가됨을 보여주었다.
   기도의 선천성 면역체계는 기도염증을 막는데 중요한 역할을 하는데 이를 구성하는 요소들에는 상피층, 기도표면의 체액, 폐포내 대식세포 등이 있다.⁷⁾ 이중 기도표면의 체액에는 항균작용을 보이는 물질들이 상피층으로부터 분비되어 있는데 여기에는 lysozyme, phopholipase, lactoferrin, histones, antimicrobial peptides 등이 있다.⁹⁾ 기도상피세포는 이중 항균펩타이드들의 분비를 증가시켜 미생물의 침입에 반응하여 기도염증의 기회를 줄이는 역할을 한다. 이러한 항균펩타이들중에 LL-37은 폐포내 대식세포, 기관지 상피세포, 기관지 점막하 분비선 등에 존재하며 기도 점막에서 방어역할을 하는 것으로 알려져 있다.⁷⁾⁹⁾ 저자들의 결과에서도 LL-37이 정상 비점막에 존재하여 비점막의 선천성 면역체계를 이루는 항균펩타이드임을 보여주었다.
   상피세포층에서 LL-37의 기능은 아직 확실히 알려져 있지 않다. 정상 성인의 기관지 세정액에는 항균펩타이드중에서 α-defensins, LL-37, antileukoprotease 등이 존재하는데 이들은 sarcoidosis 환자의 기관지 세정액에서 정상 기관지보다 더욱 증가되었다는 보고하였다.⁹⁾ 혀에서도 점막하 고유층의 급성 및 만성 염증시에 설표면의 상피층에서 이러한 항균펩타이드가 증가된다는 보고가 있다.¹⁰⁾ 또한 LL-37은 정상피부의 상피세포층에서는 발현되지 않지만 염증성 피부질환의 각질층에서는 증가되어 피부방어층이 파괴되었을때 방어의 첫번째 기전으로 참여하여 병원균에 의한 국소염증과 전신침범을 막는다고 보고되었다.¹¹⁾ 저자들의 결과는 LL-37 mRNA가 염증성 비점막에서는 모두 발현되었지만 정상에서는 6명중 3명에서 발현되었다. 이것은 비점막 상피조직에서 LL-37의 분비가 비점막 염증시 활성화됨을 보여준다. 또한 본 실험에서 정상조직보다는 LL-37 mRNA의 발현이 증가된 염증조직에서 IL-1β와 IL-8 mRNA 등이 증가되는 양상을 보여주어 이러한 싸이토카인의 발현이 LL-37의 발현과 밀접한 관련이 있음을 보여주었다. Frohm Nilsson 등⁶⁾에 의하면 LL-37 유전자의 촉진자 부위에는 acute-phase response factor와 nuclear factor for IL-6 등의 두가지 전사인자들에 대한 결합부위가 있는데 IL-6는 이들 전사인자들의 활성화를 조절한다고 하였다. 이와 같이 IL-6는 LL-37 유전자를 발현을 조절하는데 중요한 역할을 한다고 알려져 있는데 저자들의 실험에서는 IL-1와 IL-8이 LL-37의 발현과 유의한 관계를 보였지만 이들이 LL-37의 발현을 조절하는지는 알 수 없었으며 앞으로 추가연구가 필요할 것으로 생각된다.
   따라서 Lee 등⁸⁾이 밝힌 염증성 비염에서의 β-defensins의 증가와 함께 염증성 비점막조직에서 LL-37의 증가는 이러한 항균펩타이드들이 비염증을 억제하는 선천성 면역체계에서 주요 역할을 할 수 있음을 의미한다.
   일반적으로 LL-37은 골수세포와 후골수세포에서 주로 만들어지며 또한 LL-37의 전구물질은 주로 중성구에서 발현된다고 알려져 있다.⁴⁾¹²⁾ 최근 LL-37은 또한 중성구, 단핵구, T-림파구에 대한 화학주성 효과가 있어 염증조직에서 백혈구의 모집에 참여하여 선천성면역 뿐만 아니라 후천성 숙주의 방어 기능을 증가시키는 능력이 있다고 보고되었다.¹³⁾ 저자들의 연구에서 LL-37이 비점막하 기질내의 염증성 세포에도 발현이 되었으나 이러한 세포들의 기원이 중성구일 수 있지만 이의 확인을 위해서는 이중 염색이 필요하다고 생각한다.
   본 연구는 선천적 면역기능을 담당하는 항균펩타이드의 일종인 LL-37이 정상 비점막에서 발현됨을 보여주었고 또한 만성 염증시에 정상보다 지속적으로 증가되는 것으로 보고하였다.

결     론

   정상 비점막에서 항균펩타이드의 일종인 LL-37이 존재하며 염증반응시에 증가하여 상피세포의 항균작용에 중요한 역할을 할 수 있음을 보여주었다. 향후 LL-37의 발현을 조절하는 인자들에 대한 연구 및 비점막에 존재할 수 있는 다른 항균펩타이드들에 대한 연구가 필요할 것으로 사료된다.

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