교신저자：이정구, 330-714 충남 천안시 안서동 산 29 단국대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
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서     론

   세균성 뇌막염에 의한 합병증으로 유발되는 감각신경성 난청은 소아의 후천적 감각신경성 난청 중 가장 흔한 원인 중의 하나로, 세균성 뇌막염의 5% 내지 33%에서 생기는 것으로 알려져 있다.¹⁾²⁾
   이러한 청력감소의 원인은 아직 확실히 밝혀지지 않았으나, 세균이나 내독소가 cochlear aqueduct를 통해 뇌척수액으로부터 와우로 흘러 들어가 화농성 미로염을 일으켜 생기는 것으로 생각되고 있다.³⁾⁴⁾ 그러나 최근에 세균성 뇌막염에서의 조직손상에 세균이나 내독소 자체뿐 아니라 TNF-α, β, IL-1α, β, PGE,₂ PGI,₂ PAF, IFN-γ, MIP-1,2 같은 cytokines에 의한 염증반응이 중요한 역할을 한다는 연구 결과가 보고되고 있다.^5)6)7)8) 이 중에서 특히 IL-1β는 세균성 뇌막염시 뇌척수액내에 높은 농도로 존재함이 증명되었고,⁷⁾⁸⁾⁹⁾ 세균감염에 의한 초기염증 반응에 가장 중요한 역할을 담당하고 있는 것으로 알려지고 있다.⁸⁾⁹⁾ 또한 Ramilo 등¹⁰⁾은 실제로 실험 동물의 뇌척수강내에 IL-1β를 주입하였을 때에 염증 반응이 일어남을 확인하였다.
   이와 같이 세균성 뇌막염시 IL-1β에 의한 뇌조직 손상에 대해서는 알려져 있으나 이러한 cytokines이 세균성 뇌막염에 의한 감각신경성 난청에 직접 혹은 간접적으로 관여하는지에 관한 연구 보고된 바 없다.
   이에 저자들은 세균성 뇌막염시 뇌척수강내에서 발견되는 IL-1β를 기니픽 뇌척수강 내로 주입함으로써, IL-1β에 의해 청력 감소가 오는지를 기니픽을 이용한 실험을 통하여 확인하고자 하였다.

대상 및 방법

대  상
   실험동물은 체중 300~350 g의 외견상 건강하고 광학현미경 소견상 중이내에 염증 소견이 없는 기니픽 30마리(60귀)를 사용하였다. 실험 전에 측정한 청성뇌간유발반응(ABR)은 모두 정상이었다. 이들을 무작위로 phosphate buffered saline(PBS)를 주입한 대조군(10마리), 10 ng/ml의 IL-1β를 주입한 10 ng 군(10마리), 100 ng/ml의 IL-1β를 주입한 100 ng 군(10마리)으로 나누어 실험하였다.

방  법

뇌척수강내로 PBS, IL-1β의 투여
   기니픽을 체중 kg당 30 mg의 ketamine hydrochloride과 2 mg의 xylazine을 혼합한 후, 근육주사하여 자기호흡을 유지한 상태로 전신마취를 하여 고정하였다. 기니픽을 움직이지 못하도록 고정한 뒤 실험자의 검지로 경추부 중간부위를 확인한 후, 29-gauge 1 ml 주사기를 척수강내로 찔러서 cisterna magna에 도달하였다. 뇌척수강에 올바로 도달한 것을 확인하기 위해 주사기에 음압을 가한 뒤, 뇌척수액 0.1 ml를 역류시켜 확인한 후 PBS, IL-1β를 PBS로 희석하여 만든 IL-1β 10 ng/ml, 100 ng/ml용액을 각각의 실험군에 0.1 ml씩 뇌척수강내로 주입하였다.

청성뇌간유발반응 청력검사
   대조군과 실험군은 PBS와 IL-1β를 뇌척수강 내로 주입하기 전과 주입 후 10, 24시간 후에 청성뇌간유발반응을 통한 청력검사를 시행하였다. 청성뇌간유발반응은 증폭(Nicolet RGA-200A) 및 여과(band filter)(10 KHz)되었으며, 검사당 400회 이상의 자극을 평균하였다(Nicolet CA-100). 자극음은 100 msec 펄스의 교대극성에 의해 생성된 광역밴드의 클릭음을 33.3/sec의 비율로 TDH-49 insert earphone을 통해 귀에 삽입하였다. 클릭강도는 90 dB peak sound pressure level에서 시작하여 청성뇌간유발반응이 나타나지 않을 때까지 5 dB씩 감소시켰으며, 청력역치는 측정가능한 파형의 wave V를 보이는 최저 자극역치로 결정하였다.

ELISA를 이용한 외림프액내 IL-1β 농도 측정
   PBS와 IL-1β 투여 10시간 후와 24시간 후 각각 청성뇌간유발반응을 측정한 뒤 뇌척수액이 외림프에 섞이는 것을 방지하기 위하여 실험동물을 단두하여 와우 첨부에 구멍을 뚫고 1 cc 주사기를 이용하여 외림프액을 채취하였다. 외림프액내의 IL-1β 농도는 ELISA kit(genzyme, Cambridge MA. USA)를 이용하여 측정하였다. 1차 항체로 mouse anti-IL-1β를 사용하였으며, 차단완충액으로 37°C에서 40분 동안 차단하여 비특이적인 반응을 제거한 후 ELISA 과정에 들어갔다. 제시된 표준(405 pg/ml, 135 pg/ml, 45 pg/ml, 15 pg/ml, 0 pg/ml)과 샘플을 넣고 37°C에서 40분간 항온배양 하였으며 샘플희석을 위해 세척 완충액을 사용하였다. 4회 세척한 후 Horse radish peroxidase(HRP) 효소가 부착된 streptavidine을 37°C에서 25분간 반응시켰다. 세척후 기질로서 TNB용액을 이용하여 5분간 반응시켰으며 sulfuric acid로 반응을 중지시켰다. 다음에 ELISA reader(Emax precision microplate reader, Molecular Devide, CA)로 판독하였으며 발색정도에 따라 농도를 구하였다.

실험동물의 와우에 대한 주사전자현미경 검사
   주사전자현미경 검사를 위해 2% paraformaldehyde와 25% glutaldehyde의 혼합액을 사용하여 심장 내 관류를 시행한 후 실험동물을 단두하여 와우를 체취하였다. 생체 외 관류는 scala tympani에 낸 구멍을 통하여 난원창으로 관류를 시켰으며, 관류 후 정원창을 제거하고, 와우를 4°C에 하루동안 액침시켰다. Glutaldehyde로 하루동안 고정시킨 후 와우를 0.1 M phosphate 완충액으로 고실계에 낸 구멍을 통하여 씻어내는 과정을 3회 반복하고 1.5% OsO4로 후고정시켰다. 이어서 광학현미경하에서 와우의 골피막을 제거하고, 체취한 조직은 에탄올액 50%, 70%, 85%, 95%, 100%로 탈수하여 critical point dryer(Hitachi HCP-2^®, Tokyo, Japan)로 건조한 후 13 nm 플라티늄으로 도포된 stub(Hitachi, Tokyo, Japan)위에 위치시켰다. 위의 과정을 거친 조직을 주사전자현미경(Hitachi S-2500^®, Tokyo, Japan)을 이용하여 관찰하고 Polaroid type 55 landfilm으로 촬영하였다. 주사전자현미경을 통한 유모세포 손상의 평가는 Corti 기관 유모세포의 1부터 4열 사이의 입체섬모의 정렬, 융합, 벌어진 정도(splaying), 섬모의 손실 및 분열을 고려하였다.

통계처리방법
   PBS를 사용한 대조군과 IL-1β 10 ng군, IL-1β 100 ng군 사이의 청력변화를 비교하기 위해 oneway ANOVA법을 이용하였으며 5% 유의수준에서 통계적 분석을 하였다.

결     과

청성뇌간유발반응을 통한 청력변화
   청성뇌간유발반응상 PBS를 주입한 대조군에서는 주입후 10시간, 24시간 후에 각각 3.3±2.6 dB, 2.8±2.0 dB의 청력역치 변화를 보였다. IL-1β 10 ng/ml를 주입한 군에서는 10시간 후에 21.94±14.46 dB의 청력역치 변화를 보였으며 이는 대조군과 비교했을 때 유의한 차이를 보였다(p<0.05). 24시간 후에는 5.83±9.74 dB의 청력역치를 보였고 이는 대조군과 유의한 차이가 없었다. IL-1β 100 ng/ml를 주입한 군에서는 10시간 후에 21.58±15.99 dB의 청력역치 변화를 보였으며 이는 대조군과 비교했을 때 유의한 차이를 보였다(p<0.05). 24시간 후에는 4.74±9.05 dB의 청력역치 변화를 보였으며 이는 대조군과 유의한 차이가 없었다. 10시간 후와 24시간 후 모두 IL-1β 10 ng/ml를 주입한 군과 IL-1β 100 ng/ml를 주입한 군 사이에 유의한 차이가 없었다(Fig. 1).

외림프액에서의 IL-1β 농도
   PBS를 투여한 대조군에서는 외림프액에서 IL-1β가 검출되지 않았다.
   IL-1β를 10 ng/ml를 주입한 군에서 10시간 후와 24시간 후 외림프액에서의 IL-1β 농도는 각각 2.17±0.6 ng/ml, 0.53±0.1 ng/ml이었고, IL-1β 100 ng/ml을 주입한 군에서는 10시간 후와 24시간 후 각각 3.58±1.1 ng/ml, 0.86±0.2 ng/ml이었다(Table 1).

전자현미경 소견
   와우의 중간 회전부에서 촬영한 주사전자현미경 소견에서 IL-1β 10 ng/ml를 주입한 군에서 내유모세포와 외유모세포의 제 1, 2열에는 경도의 disruption이 관찰되었으나, 제 3열은 가장 손상이 심하여 외유모세포의 disruption, splaying, fusion 등의 소견이 관찰되었다(Fig. 2).

고     찰

   세균성 뇌막염에 속발하는 감각신경성 난청의 기전은 아직 명확히 밝혀지지 않았으나 세균이나 내독소가 와우도수관(cochlear aqueduct)을 통해 뇌척수액으로부터 와우로 흘러 들어가 화농성 미로염을 일으켜 생기는 것으로 생각되어져 왔다.³⁾⁴⁾ 세균성 뇌막염시 내이에 생기는 조직학적 변화에 대한 연구에서 Bhatt 등⁴⁾은 염증이 와우도수관 근처의 와우 기저부에서 시작하여 첨부쪽으로 진행함을 관찰하였고, 고도난청시에는 외림프강 전반에 걸쳐 급성 염증이 생기는 것을 관찰하였다. 또한 Rappaport 등¹¹⁾은 실험동물에 세균성 뇌막염을 만든 후 측두골에 대한 전자현미경 소견을 관찰하였는데, 그 결과 10 dB 정도의 경도 난청이 있는 경우에도 외유모세포 내측 1열에 부분적인 퇴행성 변화와 혈관조(stria vascularis) 변연세포의 공포화(vacuolization), scala tympani 및 scala vestibuli에 염증세포의 침윤이 있음을 관찰하였고, 난청의 정도가 심해질수록 외유모세포, 내유모세포, 지지세포를 포함한 와우 전반에 염증세포의 침윤이 있음을 보고하였다. 세균성 뇌막염시 생기는 이러한 염증반응에 최근 염증매개체인 cytokine의 중요성이 부각되었다. IL-1β, TNF-α, PAF, leukotriene 등은 세균성 뇌막염 환자의 뇌척수액에서 높은 농도로 존재함이 보고되었고,⁶⁾⁷⁾⁸⁾ 이 중 IL-1β는 염증의 정도에 비례하여 높은 농도로 존재함이 보고되었다.⁹⁾ 또한 IL-1β를 동물의 뇌척수액 내로 주입했을 때 뇌척수액내에 백혈구 증가증을 유발하는 것이 보고되었다.¹²⁾ 이와 같이 세균성 뇌막염시 세균이나 내독소 자체에 의한 조직손상 뿐아니라 cytokines에 의해 매개되는 염증반응에 의해서도 조직손상이 온다는 연구가 최근 보고되고 있다.^5)6)7)8)9) 본 연구에서도 기니픽의 뇌척수강내로 IL-1β를 주입했을 때, 10시간 후에 대조군에 비해 유의한 청력감소를 보였다. 이는 세균성 뇌막염에 속발하는 청력손상에 IL-1β에 의한 염증반응이 중요한 역할을 함을 의미한다.
   IL-1β는 초기 염증반응에 중요한 polypeptide cytokine으로서 세균의 내독소에 의해 자극받을 때, 대식세포와 혈관내피세포에서 합성된다.¹²⁾¹³⁾ IL-1β는 T-세포 증식을 촉진시키고, 대식세포를 활성화시키며, 염증지역으로 granulocyte를 유입시키고, 열을 유발하며, 급성기 단백합성을 유도하며, 혈관투과성을 증가시키고, arachidonic acid 대사산물의 형성을 통해 응고체계를 변형시킨다.¹⁰⁾¹⁴⁾ 뇌척수강내로 주입된 IL-1β가 어떤 기전으로 청력손상을 일으키는지는 확실하지 않으나, 최근 IL-1β가 inducible nitric oxide synthase(iNOS)를 활성화하여 nitric oxide를 생성함을 보여주는 많은 연구가 있었다.¹³⁾¹⁵⁾
   따라서 IL-1β가 직접적으로 조직손상을 일으키기보다는 상기한 작용들을 통해 염증반응을 일으키며, 이 때 생성된 nitric oxide에 의해 와우에 손상이 생겼을 것으로 추정된다. 이를 뒷받침하는 증거로 세균성 뇌막염에시 뇌척수강 내에서 nitric oxide가 높은 농도로 존재함이 보고되었고,¹⁶⁾ 1997년 Amaee 등¹⁷⁾은 그의 실험을 통하여 세균성 뇌막염시 감각신경성 난청이 생기는 기전으로 nitric oxide의 역할을 주장한 바 있다. 그는 nitric oxide에 의해 와우의 지지세포 및 내·외유모세포에 손상이 오는 것을 기니픽을 이용한 실험을 통하여 확인하였다.
   본 연구에서 뇌척수강내에 투여한 IL-1β의 농도는 10 ng/ml와 100 ng/ml를 사용하였는데, 이는 세균성 뇌막염시 뇌척수강 내에서 발견되는 IL-1β의 농도가 80~5,500 pg/ml이므로 이보다 고용량의 IL-1β를 사용하였다.⁶⁾⁹⁾ 초기 실험시 1 ng/ml의 IL-1β를 뇌척수강 내에 주입하였을 때 24시간 이내에 청력감소가 없었음을 확인하였다. 따라서 실제 뇌척수액에서 발견되는 농도보다 고농도의 IL-1β를 주입하고 단기간 내에 청력감소를 일으켰다.
   본 연구에서 10 ng/ml의 IL-1β를 투여한 군과 100 ng/ml의 IL-1β를 투여한 군 사이에 청력감소를 비교할 때 두 군간에 10시간 후와 24시간 후 모두 통계적으로 유의한 차이가 없었는데, 이는 어느 일정수준 농도 이상이면 농도와 관계없이 내이에 청력감소를 유발할 수 있는 염증을 일으키기 때문일 것으로 추정된다. 또한 어떤 feedback mechanism에 의해 투여한 IL-1β의 양에 비례하여 청력감소가 증가하지는 않은 것으로 생각한다. 또한 본 연구에서 10 ng군과 100 ng군 모두 IL-1β 투여 후 10시간 후에는 대조군에 비해 유의한 청력변화가 있었으나 24시간 후에는 대조군과 차이가 없었다. 이는 IL-1β에 의한 청력변화가 최소한 초기에는 가역적임을 의미할 수 있다. 이러한 결과는 경도나 중등도의 청력손실이 있는 경우에는 가역적인 장액성 미로염이 일어나고, 고도의 청력손실이 있는 경우에는 비가역적인 화농성 미로염이 생겼다는 Rappaport 등의 보고와 일치하는 결과이다.¹¹⁾ 이에 맞게 외림프액 내의 IL-1β 농도도 24시간 후에는 10시간 후에 비해 유의성 있게 감소하였다. 이는 뇌척수강내로 주입한 IL-1β가 시간이 경과함에 따라 재생성되지 않고 대사되어 그 효능이 소실되었거나, 지속적으로 새로 생성되고 순환되는 뇌척수액에 희석되어 농도가 낮아졌기 때문일 것으로 추정된다.

결     론

   본 연구 결과 기니픽 뇌척수강 내에 투여한 IL-1β에 의해서 대조군에 비해 유의한 청력감소가 유발되었다. 이러한 결과는 뇌척수액에 유지된 IL-1β가 외림프액에 침투되어 내·외유모세포를 파괴시키는 등의 작용으로 청력감소를 유발하였을 것으로 보인다.
   이는 세균성 뇌막염에 속발하는 청력손실에 있어서 IL-1β가 중요한 역할을 담당하고 있음을 제시하는 결과이다.

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