교신저자：진영완, 134-791 서울 강동구 둔촌2동 6-2번지  한국보훈병원 이비인후과
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서     론

   섬유아세포는 IL-1β, IFN-γ, TNF-α, TGF-β 등의 물질에 반응하여 IL-6, IL-8, GM-CSF(granulocyte macrophage-colony stimulating factor), SCF(stem cell factor), RANTES(regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted) 등의 proinflammatory cytokine을 생산하여 알레르기성 비염의 발생에 중요한 역할을 한다.¹⁾²⁾³⁾ 이중 RANTES는 호산구의 화학주성을 매개하는 중요한 cytokine으로 알레르기성 비염에서 계속적인 항원자극시 호산구를 비점막으로 연속적인 침윤을 일으켜 알레르기성 비염의 만성화에 영향을 미친다.³⁾⁴⁾
   하지만 강력한 항염증성 작용으로 인해 알레르기성 비염치료의 대표적인 약물중 하나로 알려진 스테로이드가 알레르기성 비염과 비(非)알레르기성 비염 비점막 섬유아세포에서 RANTES의 생성에 어떠한 작용을 미치는지는 아직 명확히 규명되어지지 않고 있다. 이에 저자들은 알레르기성 비염과 비알레르기성 비염 섬유아세포에서 IFN-γ, TNF-α로 자극시 RANTES의 발현 여부를 비교하여 보고 실제 스테로이드가 알레르기성 비염과 비알레르기성 비염 섬유아세포에서의 RANTES 생성에 미치는 영향을 살펴보고자 본 연구를 시행하였다.

재료 및 방법

대  상
   경희대학교 의과대학 이비인후과학교실에 내원한 환자중 병력, 이학적 검사와 MAST, 피부반응검사(skin prick test), 비유발반응검사(nasal provocation test)를 통해 집먼지진드기에 양성반응을 보인 환자 3명을 알레르기군(Allergic Group, AG)으로 정하였고, 병력상 코막힘을 주소로 하고 일련의 알레르기검사에서 음성반응을 보인 환자 3명을 비알레르기군(Non-Allergic Group, NAG)으로 정하였다. 위 각각 3명의 환자에서는 비용, 만성부비동염의 소견이 없었으며 술전 스테로이드, 항히스타민제 등 일련의 알레르기 약물을 복용한 과거력이 없는 환자를 대상으로 하였다.

방  법

섬유아세포 배양
   알레르기군과 비알레르기군 환자 각각 3명의 비점막을 하비갑개 수술시 채취하여 penicilline(10 U/ml)과 streptomycin(100 μg/ml) 용액에서 5분간 소독한 뒤 1 mm3 크기로 절단하여 배양용 접시에 1 cm 간격으로 놓고 5분간 실온에서 유착시킨 후 배양액에 Dulbeco's Modified Eagle's Medium(DMEM)(Gibco, Grand Island, NY)과 10% FBS(fetal bovine serum)을 첨가하여 배양하였다. 단층을 형성하면 배양액을 제거한 후 잔존 세포를 phosphate buffered saline(PBS)로 세척하고, 0.05% trypsin, 0.02% ethylene diamine tetraacetic acid(EDTA)로 37°C에서 5분간 처리하여 세포들을 분해하였다. 그 후 분해된 세포를 얻어 다시 2% FBS와 DMEM액을 넣은 상태에서 배양하였다. 이들 알레르기군(AG)과 비알레르기군(NAG)에서 얻어진 섬유아세포를 계대배양하여 3세대 배양 섬유아세포를 이용하여 실험하였다.

RANTES 발현량의 측정
   배양된 세포를 6×10⁴개/ml로 분주하여 24시간 동안 세포를 유착시킨 후 배양액을 교체하고 IFN-γ(500 U/ml, Genzyme, Boston, MA), TNF-α(50 ng/ml, Genzyme, Cambridge, MA)로 각각 자극하여 배양 24, 48, 72시간째 부유액에서 RANTES의 발현량을 ELISA(R & D, Minneapolis, MN)를 사용하여 측정하여 알레르기군과 비알레르기군에서의 발현량을 비교하였다. 이때 동일 조건하에서 알레르기군과 비알레르기군에 각각 Dexamethasone(1 μM)을 첨가하여 배양 24, 48, 72시간째 RANTES의 발현량을 ELISA를 사용하여 측정하여 Dexamethasone을 첨가하지 않은 군에서의 RANTES 발현량과 비교하였다.

통계학적 분석
   이상의 얻어진 결과들은 Student's t-test를 이용하여 통계 처리하였으며 유의성 검증에서는 유의수준을 p<0.05로 정하였다.

결     과

비알레르기군에서의 RANTES의 발현량
   비알레르기군(NAG)에서 IFN-γ로 자극을 가한 경우 RANTES의 발현량(ng/ml)은 배양 24시간째 26.7±1.6, 배양 48시간째 116.4±8.7, 배양 72시간째 112.8±9.4로 나타나 배양 24시간째 발현량에 비해 배양 48시간째 발현량이 급격히 증가하여(p<0.05) 배양 48시간째 최고조를 이루었으며 배양 72시간째 약간 감소하였다. 하지만 배양 48시간째 발현량과 배양 72시간째 발현량 사이에의 통계학적 유의성은 발견하지 못하였다(p＝0.652). 반면 TNF-α로 자극을 가한 경우에는 배양 24시간째 44.6±6.1, 배양 48시간째 94.4±11.0, 배양 72시간째 136.9±12.4로 나타나 배양 24시간째부터 배양 72시간째까지 통계학적으로 유의하게(p<0.05) 지속적인 증가 추세를 보였다. 동일 자극시간째 IFN-γ와 TNF-α로 자극을 가한 이후의 RANTES의 발현량 비교는 배양 24시간째 TNF-α로 자극을 가한 경우가 IFN-γ로 자극을 가한 경우보다 통계학적으로 유의하게(p<0.05) 발현량이 증가된 소견이었지만 배양 48, 72시간째의 발현량은 통계학적 유의성을 찾아볼 수 없었다(Table 1).

알레르기군에서의 RANTES의 발현량
   알레르기군(AG)에서 IFN-γ로 자극을 가한 경우 RANTES의 발현량(ng/ml)은 배양 24시간째 41.1±4.3, 배양 48시간째 139.2±11.2, 배양 72시간째 216.3±9.6으로 나타나 배양 24시간째부터 배양 72시간째까지 통계학적으로 유의하게(p<0.05) 지속적인 증가 추세를 보였다. 한편 TNF-α로 자극을 가한 경우에도 배양 24시간째 76.8±4.4, 배양 48시간째 139.3±11.0, 배양 72시간째 215.2±9.3 으로 나타나 배양 24시간째부터 배양 72시간째까지 통계학적으로 유의하게(p<0.05) 지속적인 증가 추세를 보였다. 동일 자극시간째 IFN-γ와 TNF-α로 자극을 가한 이후의 RANTES의 발현량 비교는 비알레르기군에서와 마찬가지로 배양 24시간째 TNF-α로 자극을 가한 경우가 IFN-γ로 자극을 가한 경우보다 통계학적으로 유의하게(p<0.05) 발현량이 증가된 소견이었지만 배양 48, 72시간째의 발현량은 통계학적 유의성을 찾아볼 수 없었다(Table 2).

비알레르기군과 알레르기군에서의 RANTES의 발현량의 비교
   알르레기군(AG)에서 IFN-γ로 자극시 24, 48, 72시간째 RANTES의 발현량이 비알레르기군(NAG)에 비해 통계학적으로 의미있게 증가되었다(Fig. 1). 또한 알르레기군(AG)에서 TNF-α로 자극시 24, 48, 72시간째 RANTES의 발현량도 비알레르기군(NAG)에 비해 통계학적으로 의미있게 증가되었다(Fig. 2).

Dexamethasone이 섬유아세포에서 RANTES의 발현량에 미치는 영향
   비알레르기군(NAG)에서 IFN-γ로 자극을 한 경우와 IFN-γ자극시 Dexamethasone을 첨가한 경우에서 RANTES 발현량의 비교에 있어서는 배양 24, 72시간째 Dexamethasone을 첨가한 경우에서 약간 발현량이 감소하였지만 통계학적 유의성은 없었다. 그리고 배양 48시간째에서는 오히려 Dexamethasone을 첨가한 경우에서 발현량이 증가함을 관찰하였지만 통계학적 유의성은 없었다(Fig. 3). TNF-α로 자극을 한 경우에서도 배양 24시간째 Dexamethasone을 첨가한 경우에서 발현량이 감소하였고 배양 48, 72시간째에서는 Dexamethasone을 첨가한 경우에서 발현량이 증가함을 관찰하였지만 모두 통계학적 유의성을 발견할 수 없었다(Fig. 4).
   알레르기군(AG)에서는 IFN-γ로 자극을 한 경우와 IFN-γ 자극시 Dexamethasone을 첨가한 경우에서 RANTES 발현량의 비교에 있어서 배양 24, 48, 72시간째 Dexamethasone을 첨가한 경우에서 통계학적으로 유의하게 RANTES의 발현이 억제되었다(p<0.05)(Fig. 5). 하지만 TNF-α로 자극을 한 경우에서는 배양 72시간째 Dexamethasone을 첨가한 경우에서 발현량이 감소하였고 배양 24, 48시간째에서는 Dexamethasone을 첨가한 경우에서 발현량이 증가함을 관찰하였지만 통계학적 유의성을 발견할 수 없었다(Fig. 6).

고     찰

   알레르기성 비염, 비용, 천식, 아토피성 피부염 등의 발병기전에 있어 호산구의 침윤은 특징적인 현상으로 호산구는 호산구 과립단백인 major basic protein(MBP), eosinophil cationic protein(ECP), eosinophil-derived protein(EDN), eosinophil peroxidase(EPO) 등을 분비하여 호흡상피에 대하여 세포독성을 가지고 있으며, platelet activating factor(PAF)와 같은 지질매체를 생산하여 알레르기성 호산구 염증과 관련되어 과반응성의 일부를 담당하는 것으로 알려져 있다.⁵⁾ 알레르기 반응이 일어나는 부위에 호산구가 동원(recruitment)될 때에는 여러 가지 인자들이 관여하며, 이러한 호산구 화학주성인자로는 IL-5, eotaxin, RANTES 등이 대표적으로 알려져 있다.⁶⁾ 이중 RANTES는 T세포에서 분비되는 CC chemokine의 일종으로 호중구가 아닌 호산구에 대해서만 화학주성이 있다고 알려져 있으며,⁵⁾ 호산구의 알레르기 염증반응에 있어 내피세포(endothelial cell)에의 접착, 경내피이동(transendothelial migration) 등에도 관여하는 것으로 알려져 있다.⁷⁾
   하지만 비점막 세포에서 RANTES의 분비가 어디에서 일어나지는 지에 대해서는 아직 명확히 밝혀지고 있지 않다. Sticherling 등⁸⁾이 피부 섬유아세포에서 여러 종류의 cytokine으로 자극을 가한 이후 RANTES의 발현을 보고한 이후, Maune 등⁹⁾이 IL-1β, IFN-γ, TNF-α로 자극을 가한 이후 비점막 섬유아세포에서 RANTES 발현이 관찰되는 반면 비상피세포에서의 RANTES 발현이 관찰되지 않음을 발견하여 비점막에서의 RANTES 분비가 주로 섬유아세포에서 이루어진다고 하였다. 또한 섬유아세포에서 분비된 RANTES는 호산구에 대해서 생물학적 활성이 있다고 하였다.⁹⁾
   이러한 섬유아세포는 1960년대 초 피부, 관절조직, 골막 등의 섬유아세포의 배양에서의 차이점이 보고된 이후¹⁰⁾ 다른 조직에서의 이형질이 있음이 이미 여러 문헌에서 보고되었고^2)11)12) 또한 같은 해부학적 부위에서도 여러 상태에 따라 기능적, 구조적 이형질이 있음이 보고되고 있다.¹³⁾¹⁴⁾ 비점막 섬유아세포의 경우도 Kim 등¹⁵⁾은 자극을 가하지 않은 비섬유아세포에서 IL-6와 TNF-α의 생산량이 알레르기성 비염군에서 비알레르기성 비염군에 비해 증가되는 양상을 보여 두 군에 있어 섬유아세포의 기능적 이형질성을 보고하였고 Park 등¹⁶⁾은 알레르기성 비염과 비알레르기성 비염의 비용에서 채취한 섬유아세포에서 투과 전자현미경을 이용하여 섬유아세포의 형태를 관찰한 결과 비알레르기군 섬유아세포에서는 핵의 압흔이 없이 주위가 매끈한 핵과 세포질내 electron dense material, 공포(vacuole)들이 발견됨에 비해 알레르기군 섬유아세포에서는 핵의 압흔이 있으며 세포질내에서 electron dense material이 소량 발견됨을 보고하여 섬유아세포의 기능적 이형질성이 형태학적 이형질성을 동반하고 있음을 보고하였다. 본 연구 결과에서도 알레르기군에서의 섬유아세포에서 IFN-γ와 TNF-α로 자극시 RANTES의 발현량이 비알레르기군에 비해 증가되어 있음을 관찰하여 알레르기성 비염에서의 섬유아세포의 기능적 이형질성을 알 수 있었으며 이러한 기능적 이형질성이 알레르기성 비염에서 호산구의 침윤에 있어 비섬유아세포가 일종의 역할을 담당함을 유추할 수 있었다.
  섬유아세포는 RANTES 이외에도 IL-6, IL-8, GM-CSF, SCF 등의 여러 proinflammatory cytokine을 생산한다.¹⁾²⁾³⁾ 이러한 cytokine의 생산은 소량의 경우 자발적으로도 분비하며 IL-1β, IFN-γ, TNF-α, TGF-β 등의 자극에 대해서는 자극 용량에 비례하여 분비량이 증가한다.³⁾ Kwon 등¹⁷⁾은 폐상피세포에서 IL-α, IL-1β, TNF-α, TNF-β로 자극한 이후 RANTES의 발현량을 측정한 결과 TNF-α로 자극을 준 경우가 가장 분비량이 많았으며 그 최대발현시간은 24시간이라고 발표하였다. Maune 등⁹⁾은 비섬유아세포에서 IL-1β, TNF-α, IFN-γ로 자극한 이후 24시간째 RANTES의 발현량을 측정하여 TNF-α로 자극한 경우가 가장 분비량이 많았음을 보고하였다. 본 연구에서는 알레르기군과 비알레르기군 모두에서 24시간째 TNF-α로 자극한 경우에서 IFN-γ로 자극한 경우보다 RANTES의 발현량이 증가되어 있었지만 48, 72시간째에서는 통계학적 유의성을 찾아 볼 수 없어 TNF-α가 IFN-γ에 비해 자극초기에서는 더욱 강력한 자극제(stimulant)이지만 자극시간이 48시간이상 지속된 경우에 있어서는 비슷한 효과를 보이는 것으로 관찰되었다.
   현재까지 강력한 항염증성 작용으로 인해 알레르기성 비염치료의 대표적인 약물중 하나로 알려진 스테로이드가 섬유아세포와 RANTES의 생성에 어떠한 작용을 미치는지는 아직 명확히 규명되어지지 않고 있다. 이전의 연구에서 Spoelstra 등¹⁸⁾은 IL-1β, TNF-α, IFN-γ, IL-4로 자극을 가한 폐섬유아세포에서 budesonide가 ICAM-1, VCAM-1의 발현을 억제함을 보고하였고, Burnstine 등¹⁹⁾은 IL-1β으로 자극한 안와섬유아세포에서 dexamethasone이 IL-8와 MCP-1의 발현을 억제함을 보고하여 스테로이드가 섬유아세포에서 cytokine과 접착분자의 발현을 억제한다고 하였다. 또한 Stellato 등²⁰⁾은 TNF-α, IFN-γ로 자극을 가한 기관지상피세포에서 budesonide가 RANTES 발현을 억제함을 살펴보아 스테로이드가 상피세포에서 RANTES 발현을 억제함을 보고하였다. 본 연구에서는 dexamethasone이 IFN-γ로 자극을 가한 알레르기성 비염 섬유아세포에서 RANTES의 발현을 억제함을 관찰하여 스테로이드가 알레르기의 염증매개 반응에 있어서 일부 섬유아세포에서의 RANTES의 생성을 감소시켜 호산구의 활성화와 침윤을 억제하는 효과를 가져 올 것으로 유추하였다. 하지만 TNF-α로 자극을 가한 알레르기성 섬유아세포의 RANTES 생성에는 스테로이드의 억제작용이 발견되지 않았는데 Kwon 등¹⁷⁾은 TNF-α로 자극을 가한 폐상피세포에서 dexamethasone이 RANTES mRNA의 반감기를 감소시키지 못함을 보고하여 dexamethasone이 TNF-α로 자극을 가한 폐상피세포에서 RANTES 전사단계에 영향을 주지 못한다고 하였다. 또한 자극을 가한 cytokine의 종류에 따라서 섬유아세포의 형태학적 이형질성을 보고한 여러 연구가 있었는데 Kim 등¹⁾은 무자극 섬유아세포에서는 핵의 압흔이 뚜렷하게 나타나고 세포질내 electron dense material과 공포들이 많이 관찰되는 반면 IL-4로 자극한 섬유아세포에서는 electron dense material과 공포들이 감소하였으며, 핵의 압흔이 명확하지 않다고 하여 자극을 가한 섬유아세포가 무자극 섬유아세포와 형태학적 이형질성을 가진다고 하였다. Park 등¹⁶⁾도 알레르기성 비염환자의 비용에서 채취한 섬유아세포에서 histamine으로 자극시 핵의 압흔이 없어지고 세포질내 교원물질이 많이 관찰됨에 비해 IL-4로 자극시 섬유아세포의 크기가 상대적으로 작아졌으며 세포주위에 섬모가 관찰된다고 하여 자극을 가한 cytokine의 종류에 따라서 섬유아세포의 형태학적 이형질성을 보고하였다. 본 연구에서 IFN-γ로 자극을 가한 섬유아세포와 TNF-α로 자극을 가한 섬유아세포의 RANTES 생성에 스테로이드의 작용이 다른 이유도 자극을 가한 cytokine의 종류에 따른 섬유아세포의 이형질성때문이라고 유추하였다. 하지만 IFN-γ, TNF-α로 자극을 가한 섬유아세포의 전자현미경적 관찰, mRNA 등 전사단계에서의 연구, 스테로이드 수용체 변형 유무 등 앞으로 이 분야에서 더욱 많은 연구가 필요할 것으로 사료된다.

결     론

   저자들은 알레르기성 비염과 비알레르기성 비염환자의 비점막으로부터 배양된 섬유아세포에서 IFN-γ, TNF-α로 자극시 RANTES의 발현 여부를 측정한 결과 알레르기군에서의 섬유아세포에서 RANTES의 발현량이 비알레르기군에 비해 증가되어 있음을 관찰하여 알레르기성 비염에서의 섬유아세포의 기능적 이형질성이 있어 RANTES 생성이 증가되어 있을 것으로 생각하였다. 또한 스테로이드가 IFN-γ로 자극을 가한 알레르기성 섬유아세포에서 RANTES의 발현을 선택적으로 억제함을 관찰하여 비알레르기군과 알레르기군 섬유아세포에서의 이형질성뿐만 아니라 자극을 가한 cytokine의 종류에 따라서도 섬유아세포의 이형질성이 나타나 약물반응에 차이를 보일 수 있음을 살펴보았다.

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