교신저자：이형석, 133-792 서울 성동구 행당동 17번지 한양대학교 의과대학 이비인후과학교실
                  전화：(02) 2290-8580 · 전송：(02) 2293-3335 · E-mail：HYENT@chollian.net 

서     론

   기관지경 하에 기관 수술시 CO₂ 레이저의 사용은 주위 조직에 거의 손상을 주지 않으면서 절단 능력이 뛰어난 장점이 있어 기관 폐쇄증이나 기관 내 육아종과 같은 양성 질환 수술에 보편적으로 사용되고 있다.¹⁾²⁾ CO₂ 레이저에 의한 창상 치유는 수술도에 의한 창상 치유와 비교할 때 지연된다고 알려져 있는데 이는 주위 조직에 대한 열손상 때문이라고 생각되고 있다.³⁾ 최근 레이저에 의한 주위 조직의 열손상 범위를 감소시키기 위해 continuous mode 보다는 레이저 pulse length를 감소시킨 superpulse mode를 사용하여 창상 치유 지연 정도를 감소시킨 보고도 있다.³⁾
   Laminin은 세포 기저막에 존재하는 세포외 기질을 형성하는 당단백질로 창상 치유 과정에 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있으며 또한 세포와 기질의 결합, 세포의 성장과 이동, 종양의 증식 및 전이, 이식 조직의 생존에 중요한 기능을 담당하고 있다.⁴⁾⁵⁾⁶⁾
   CO₂ 레이저를 superpulse mode로 하여 가토의 기관에 시술한 후 기관 점막의 창상 치유 과정을 동물 모델을 이용하여 조직학적으로 관찰하고 창상 치유 과정에 중요한 역할을 하는 laminin의 발현 정도를 알아보고자 이 연구를 시도하였다.

재료 및 방법

재  료
   실험 동물은 체중 1.5~2.0 kg 내외의 건강한 가토를 이용하여 대조군 1마리와 실험군 10마리를 사용하였으며 물은 제한 없이 공급하였다. 실험군 10마리를 2마리씩 5개 군으로 배정하였으며, CO₂ 레이저 조사 후 12시간, 1일, 3일, 5일, 7일 경과군으로 분류하였다.

방  법

실험 처치
   각 실험군은 이개의 털을 깍고 알코올로 소독 후 체중 1 kg당 25 mg의 pentobarbital sodium을 이개 정맥 내에 주사하여 전신 마취를 한 후 전경부의 털을 깍고 수술대 위에 앙와위로 고정하고 betadine과 알코홀로 수술 부위를 소독 처리하였다. 기관 절개술을 시행하여 가토의 기관 점막을 노출시킨 후 CO₂ 레이저를 조사하였다. 사용된 CO₂ 레이저는 Sharplan Model 1055S였으며, 사용 방법은 0.5 second간 3 watt의 single pulse로 조사하였으며, focusing mode로 spot size는 0.6 mm이였고 작업거리는 400 mm이었다. 조작 후 경과 시간에 따라 12시간, 1일, 3일, 5일, 7일 경과 후 가토를 희생시켜 기관을 적출하였다. 적출한 조직은 0.1% glutaraldehyde-4% paraformaldehehyde 혼합 용액(pH 7.4)과 일부에 고정하였다.

Laminin에 대한 면역조직 염색
   Laminin의 분포 및 형성 정도를 면역 조직 화학적 염색으로 관찰하기 위하여 적출된 기관을 0.1% glutaraldehyde-4% paraformaldehyde 혼합 용액에 고정된 조직을 5 μm의 파라핀 절편을 제작하고 염색을 시행하였다. 탈파라핀 및 함수 과정을 거친 후 phosphate buffered saline(PBS) 용액에 세척하고 2~3% H₂O₂ methanol 용액에 5분간 반응시킨 다음 PBS 및 0.4% pepsin in 0.1 N HCl 용액에 37에서 30분간 처리하였다. 일차 항체는 rabbit anti-laminin(Sigma Co. USA)을 1：30으로 희석하여 37에서 90분간 반응시켰으며 PBS로 세척하고 이차 항체 biotinylated goat anti rabbit IgG(Vectastain, USA)를 30분간 반응시킨 후 PBS로 세척하였다. 이어서 ABC(avidin-biotin complex, Vectastain, USA) kit로 30분간 반응시키고 PBS에 세척하였다. 발색은 5~10분간 3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB)를 이용하였으며 1% methylene blue로 대조염색 후 탈수, 청명 후 봉입하고 광학 현미경으로 관찰하였다.

결     과

   Laminin에 대한 면역 조직 염색의 양성 반응은 갈색으로 나타나며 대조군으로 정상적인 성숙 가토 기관의 점막 조직에서 상피세포의 섬모층에 강한 반응을 보였고 상피 세포질(apical cytoplasm)에 약한 반응을 나타내었다. 상피 세포 사이의 공간(intercellular space)에는 미약한 반응이 관찰되었으며 기저막과 점막의 고유층(lamina propria)에는 강한 반응이 관찰되었다(Fig. 1). 12시간 경과군은 레이저 처리로 손상을 입은 부위의 점막은 혈액 응고괴(blood clot)와 불규칙한 결합조직이 관찰되었고 일부에는 육아조직이 나타났고 이 부위에 중등도의 laminin 면역반응이 관찰되었다(Fig. 2). 1일 경과군은 절개 부위 점막의 혈액 응고괴는 대부분 흡수되었고 육아조직이 광범위하게 관찰되었고 이 부위의 laminin 면역반응은 중등도의 반응을 보였다. 상실된 상피조직의 재생은 없이 고유층이 기관의 빈 공간에 노출되어 있었다(Fig. 3). 3일 경과군은 레이저가 조사된 중심 부위에 일부 육아조직이 남아 있었고 이곳에 강한 laminin 면역반응이 관찰되었고, 상실된 상피조직의 일부가 재생되고 있었으며 이 때 상피 조직의 기저막에 강한 laminin 면역반응이 관찰되었다(Fig. 4). 5일 경과군은 절개 부위가 결합조직으로 상처 부위가 치유되었으나 육아조직이 군데군데 분포되어 있었으며 이곳의 laminin 면역반응이 강하게 나타났다. 상피조직은 단층원주상피로 상처 부위가 완전히 덮혔고 기저막과 상피의 표면에 중등도 및 강도의 laminin 면역반응이 각각 관찰되었다(Fig. 5). 7일 경과군에서는 기관점막의 조직은 거의 정상적인 조직으로 재생되었으며, 상피 조직은 위중층 원주상피로의 형태를 나타내었고 상피 세포의 상단의 세포질과 섬모에는 강한 laminin 면역반응이 있었으며 상피세포 사이에는 중등도의 면역반응이 관찰되었고 고유판에는 강한 면역반응이 보였다(Fig. 6).

고     찰

   기관 점막은 혈관이 풍부하여 수술 중이나 수술 후 혈액의 흡인에 의한 합병증의 예방과 주위 조직의 손상에 의한 기관 협착을 방지하기 위해 수술시 기관지경 하에서 레이저 사용은 보편화되어 있다.²⁾ CO₂ 레이저는 직경이 0.5 mm까지의 혈관을 봉인하여 비교적 출혈이 없는 상태에서 절제가 가능하며, 신경 말단을 봉인하여 술 후 통증이 적고 림프선도 봉인되어 부종도 덜하며, 종양 수술시 혈관과 림프선의 봉인으로 인하여 종양세포의 파급 위험을 감소시킬 수 있다.
   Hall⁷⁾은 쥐 실험에서 CO₂ 레이저에 의한 창상 치유가 메스에 의한 창상보다 지연된다고 하였다. Buell과 Schuller⁸⁾는 CO₂ 레이저에 의한 창상이 술 후 3주간은 메스에 의한 창상에 비해 긴장력(tensile strength)이 약하지만 결국은 같아진다고 하였으며, Moreno 등⁹⁾은 CO₂ 레이저에 의한 창상 치유가 지연됨은 상피 이동의 시작이 지연되기 때문이며, 상피 이동 속도가 감소되어서 나타나는 것은 아니라고 하였다. 즉 일단 상피 이동이 시작되면 메스에 의한 창상과 같은 속도로 진행된다고 하였다. CO₂ 레이저에 의한 창상 치유 지연은 주위 조직에 대한 열손상에 의해 일어나는 것으로 보고 있다.^3)10)11) 결체 조직의 열손상으로 생성된 괴사 조직이 분해되는데 염증 세포의 활성이 더 오래 필요하며, 레이저에 의해 미세 혈관의 손상으로 창상 치유에 필요한 영양분이나 혈장 성분의 이동 장애, 그리고 염증 세포들이 창상 부위에 잘 도달하지 못하여 창상 치유가 지연되는 것으로 보고도 있다.¹¹⁾¹²⁾ 이러한 열손상 범위를 감소시키기 위해 continuous mode 보다는 레이저 pulse length를 감소시킨 superpulse mode를 사용하여 창상 치유 지연 정도를 감소시킨 보고가 있다.³⁾
   조직의 손상후 상피의 재생과정 중 상피세포가 이동하여 손상부가 회복되는 과정에 laminin, fibronectin 등이 다량 합성되어 이동되는 것을 면역조직학적으로 염색성의 증가나 전자현미경을 통하여 관찰할 수 있다. 일반적인 수술도와 CO₂ 레이저와의 비교연구는 본 저자들이 설점막에서의 fibronectin의 발현을 관찰한 결과 레이저 창상의 경우 수술도에 의한 창상의 경우보다 더 늦게 최고치에 도달하며 전반적인 발현정도가 낮아 창상치유가 지연되는데 부분적으로 관여하는 것으로 연구된 바 있다.¹³⁾
   Laminin은 1979년 Timpl 등¹⁴⁾에 의해서 처음 발견되었으며 collagenase에 저항성이 있는 제 IV 형 collagen의 3번째 사슬(chain)에서 기원하는 것으로 알려져 있는 세포 기저막을 형성하는 당단백질이다.⁴⁾ Laminin은 처음 종양세포에서 분리되었으나 laminin의 항체를 이용한 연구에서 신체내에 다양한 조직에 분포하는 것으로 알려져 있다.⁴⁾⁵⁾⁶⁾ Laminin은 α, β, γ의 3개 사슬로 구성되어지는 십자형태(cruciform-like structure)를 나타내며, 400 kDa의 α사슬로 3개의 globular domain을 형성하며, 200 kDa의 β, γ 사슬로 각각 2개의 globular domain을 형성한다.⁴⁾⁵⁾⁶⁾ 각각의 α, β, γ 사슬의 아미노산 배열의 차이에 의하여 여러 가지의 아형(subtype)이 존재하며 각 아형이 분포하는 조직은 조금씩 다른 것으로 알려져 있다.⁴⁾⁵⁾⁶⁾ Laminin의 역할은 세포 기저막을 형성하는 제 IV 형 collagen, perlecan, entactin 등과 서로 결합하여 세포와 기질의 부착 기능을 담당하며, 세포의 성장과 이동, 창상치유, 종양의 증식 및 전이, 이식 조직의 생존, 신경 축삭의 성장 등에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.⁴⁾⁵⁾⁶⁾
   CO₂ 레이저 조사 후 조직에서의 변화는 상피 세포의 손상과 탈락이 발생하며 고유층의 섬유와 결합조직 세포의 증식이 생기나 기저막에 존재하는 제 IV 형 collagen이나 laminin 등은 영향을 받지 않는 것으로 알려져 있다.¹²⁾ Luomanen 등¹²⁾의 연구에 의하면 레이저에 의한 조직 손상 직후 창상 주변부위의 남아 있는 상피 세포의 기저막 조직과 괴사 조직의 주변부에서 laminin이 강하게 염색되어 창상치유 초기 과정에서 상피 세포의 이동에 중요한 표식자(landmark)를 형성하여 기저 세포층의 세포 증식에 핵심적인 기능을 한다고 보고하였으며, 본 연구에서도 레이저 조사 후 12시간 경과군에서 기관의 고유층이 파괴되고 상피층이 탈락 소멸되었으며 창상 주변부위에 중등도의 laminin 발현을 관찰 할 수 있었다. Luomanen 등¹²⁾의 연구에서 레이저 조사 후 2일째부터 괴사조직 아랫부분에서 상피세포의 이동과 재상피화(re-epithelialization)가 시작된다고 하였으며, 본 연구에는 3일 경과 후부터 기관의 고유층의 결합조직이 감소되고 소실된 상피층이 기존의 상피에서 분화되어 고유층을 덮기 시작하여 비슷한 결과를 얻었다. 고유층이 완전한 정상적인 형태를 갖추고 재상피화가 이루어지는데 Luomanen 등¹²⁾의 연구에서는 11일이 소요되였으나, 본 연구에서는 7일 경과군에서 고유층의 조직은 대조군의 조직과 같은 거의 정상적인 형태를 갖추어 좀더 빨랐으며, 이는 Luomanen 등¹²⁾의 연구에서는 레이저 조사 시 10 watt의 continuous mode를 사용하여 3 watt를 사용한 본 연구보다 창상 치유가 지연되었기 때문으로 생각되어진다. 본 연구에서는 창상 치유가 완성된 시기에 상피 세포 사이의 세포막에서 중등도의 laminin이 발현되는 양상을 관찰 할 수 있었으며 고유층에서의 laminin 면역반응이 강하게 나타나 다른 연구들^12)15)16)과 비교해 비슷한 결과를 얻었다.
   
결     론

   임상에 흔히 사용되는 CO₂ 레이저를 동일한 조사 방법 및 용량으로 가토의 기관 점막 내 상피층과 고유층에 조사시켰을 때 CO₂ 레이저 시술에 의한 기관의 상피층과 기저층이 파괴되어 치유되는 과정에서 laminin은 조직 손상 직후 창상 주변 부위의 남아 있는 상피 세포의 기저막 조직과 괴사 조직의 주변부에서 상피 세포의 이동에 중요한 표식자(landmark)를 형성하여 기저 세포층의 세포 증식에 중요한 역할을 하는 재생 요소로 작용한다고 생각되어진다.

1. Jussi L, Anssi L, Juhani P, Immo R. Wound healing and soft tissue effects of CO₂, contact Nd: YAG and combined CO₂-ND: YAG laser beams on rabbit trachea. Acta Otolaryngol 1997;117:909-17.

2. Stanley MS. Laser applications in the trachea and bronchi: A comparative study of the soft tissue effects using contact and noncontact delivery systems. Laryngoscope 1987;97:1-26.

3. Albert JN. Laser and wound healing. Dermatologic Clinics 1993;11:783-9.

4. Katherine MM, Hynda KK. The laminins. Int J Biochem Cell Biol 1996;28:957-9.

5. Campell JH, Terranova VP. Laminin: Molecular organization and biological function. J Oral Pathol 1988;17:309-23.

6. Monique A, Neil S. The role of laminins in basement membrane function. J Anat 1998;193:1-21.

7. Hall RR. The healing of tissue incised by a carbon dioxide laser. British Journal of Surg 1971;58:222-5.

8. Buell BR, Schuller DE. Comparison of tensile strength in a CO₂ laser and scalpel skin incisions. Arch Otorhinolaryngol 1983;109:465-7.

9. Moreno RA, Hebda PA, Zitelli JA. Abell E. Epidermal cell outgrowth from CO₂ laser and scalpel cut explants: Implications for wound healing. J Dermatol Surg Oncol 1984;10:863-8.

10. Shelia E, Fisher JW, Frame RM, Browne R. A comparative histologic study of wound healing following CO₂ laser and conventional surgical excision of canine buccal mucosa. Arch Oral Biol 1983;28:287-91.

11. Bryant GL, Davidson JM, Ossoff RH, Garrett CG, Reinisch Lou. Histologic Study of Oral Mucosa Wound Healing: A Comparison of a 6.0 to 6.8 μm pulsed. Laser and a Carbon Dioxide Laser Laryngoscpoe 1998;108:13-7.

12. Luomanen M, Meurman JH, Lehto VP. Extracellular matrix in healing CO₂ laser incision wound. J Oral Pathol 1987;16:322-31.

13. Lee HS, Tae K, Yu YH, Choi JS, Chung YG. Expression of fibronectin Activities in rat tongue mucosal wound healing following CO₂ laser incision. Korean J Otolaryngol 2000;43:51-7.

14. Timpl R, Rohde H, Gehron RP, Rennard SI. Laminin-a glycoprotein from basement menbrane. J Biol Chem 1979;254:9933-7.

15. Luomanen M, Meurman JH. Laser induced alterations in rat oral mucosa. Scan J Dent Res 1986;94:452.

16. Terranova VP, Lyall RM. Chemotaxis of human gingival epithelial cells to laminin. A mechanism for epithelial cell apical migration. J Periodontol 1986;57:311.